Introduction
Streptococcus pneumoniae, een gemeenschappelijke kolonisator van het polymicrobiële gemeenschap van de neus-keelholte, is in staat om te concurreren met andere pneumokokken en nauw verwante soorten door de productie van bacterieel geproduceerd antimicrobiële peptiden (bacteriocins). Elke volledig gesequenced pneumokokken soort tot op heden onderzocht bevat een versie van de b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Bacteriocine productie door pneumococcen is aangetoond belang bij de uitkomst van zowel in vitro als in vivo competitie 1-4 zijn. Concurrentiedynamiek worden beïnvloed door de expressie van diverse bacteriocinen samen met verwante immuniteit eiwitten in antwoord op een specifieke peptide feromoon. Inductie van de BLP locus wordt bestuurd door een quorum sensing systeem waarin een peptide feromoon BlpC, bindt aan de sensor kinase, BlpH en initieert een signalerende cascade resulteert in detranscriptie van het BLP locus 5,6. Er zijn vier allelische varianten van BlpC die elk binden aan het verwante BlpH 6. Voor de cel om de effecten van zijn eigen bacteriocine overleven, zijn de genen die immuniteit verwante eiwitten coderen getranscribeerd op hetzelfde operon als elke bacteriocine genen. Killing treedt op als een concurrent stam niet in staat is de BLP locus upregulate in reactie op exogene feromoon of, indien de spanning niet over de specifieke immuniteit gen nodig voor bescherming. De transporteur complex, BlpAB vereist voor uitscheiding en verwerking van het peptide feromoon en bacteriocine peptiden 2,4. Onlangs is aangetoond dat een aanzienlijk deel van de pneumokokken stammen zijn "bedriegers", wat betekent dat ze een geconserveerde mutatie in het blpA gen dat maakt ze niet in staat om feromonen en bacteriocins 1,2 afscheiden. Deze stammen zijn in staat om te reageren op exogene BlpC 2 afgescheiden door hinnikenboring stammen waardoor de productie van immuniteit eiwitten.
Hoewel ruwe preparaten van bacteriocinen uit supernatanten kunnen worden bereid uit productiestammen middels biochemische methoden stappen om zuiverheid te bereiken, is deze benadering niet nuttig voor het screenen van grote verzamelingen isolaten en wanneer het niveau van bacteriocine expressie laag in bouillon gekweekte kweken 2,7- 9. De overlay assay wordt gebruikt als een snelle manier om de competitieve dynamiek tussen stammen die kunnen bestaan in vitro onderzoeken. Hiervoor een pneumococcen stam vooraf geïnoculeerd op een agarplaat en mag groeien lokale bacteriële concentratie voldoende voor inductie van de BLP locus bereiken. Een tweede stam wordt vervolgens geïnoculeerd in een gesmolten zachte agar oplossing die vervolgens via pre-geïnoculeerde stam testen op gevoeligheid wordt toegepast. Om evalueren activiteit van de BLP locus (onafhankelijk van remmende activiteit) kunnen stammen worden bedekt met een reeks three eerder beschreven BlpC reporter stammen. Deze stammen werden gebouwd op een van de drie verschillende blpH allelen die inspelen op de drie meest voorkomende BlpC feromonen afgescheiden door de pneumokokken bevatten. De reporter stammen hebben een geïntegreerde lacZ gen dat onder controle van een BlpH afhankelijke promoter en dragen een deletie in het gen dat blpC zelfstimulatie 10,11 voorkomt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van Producent Strain
- Streak een pneumokokken stam te worden getest op bacteriocineproductie productie op een 5% schapen bloed tryptische soja-agar plaat van -80 ° C vriezer voorraden.
NB: Gebruik van bloedplaatjes voor groeien van de stam te testen op remming verhoogt de reproduceerbaarheid van de assay. Bovendien kunnen andere niet-pneumococcen stammen die bacteriocines produceren gebruikt worden, hoewel groeiomstandigheden moet worden aangepast voor een bepaald organisme. We hebben Streptococcus mitis en Lactococcus lactis gebruikt in de overlay test met succes. - Incubeer de plaat gedurende de nacht (O / N) bij 37 ° C met 5% CO2.
- Na incubatie van de producerende stam, bereid de tryptische soja-agar (TSA) plaat pipetteren 3000 tot 4000 eenheden katalase op platen die 25 ml TSA en spreid het catalase oplossing met steriele glazen kraaltjes. Laat de plaat drogen gedurende ongeveer 10 minuten ondereen biologisch veiligheidskabinet.
- Verzamel een zichtbare hoeveelheid bacteriën op een pipet. Steek de pipet in de gedroogde TSA plaat.
OPMERKING: Meer dan een producent stam kan worden gestoken in een enkele TSA plaat. Het is belangrijk dat de ruimte steken zodat verkregen halos niet overlappen.- Indien mogelijk, omvatten bekende bacteriocine producent als positieve controle en de stam voor gebruik in de overlay als een negatieve controle.
OPMERKING: Positieve en negatieve controles werden eerder gepubliceerd en zijn beschikbaar op aanvraag 10 beschikbaar.
- Indien mogelijk, omvatten bekende bacteriocine producent als positieve controle en de stam voor gebruik in de overlay als een negatieve controle.
- Incubeer TSA plaat met meerdere steken bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 6 uur.
2 Het maken van glycerol voorraden van de Overlay Strain
- Bereid glycerol voorraden (kweken gekweekt tot mid-exponentiële fase en vervolgens bij -80 ° C na toevoeging van glycerol) vóór de dag van de overlay test. Inoculeren 5-10 kolonies van pneumokokken strain te worden getest op gevoeligheid of feromoon secretie in Todd-Hewitt medium met 0,5% gistextract (THY).
OPMERKING: De bouw van BlpC induceerbare verslaggevers is eerder beschreven 2 en stammen zijn beschikbaar op aanvraag. - Incubeer 5-10 kolonies in glazen buisjes met 5 ml van THY met goed gesloten deksels in een 37 ° C waterbad zonder schudden.
- Incubeer kweken bij 37 ° C totdat ze bij een OD 620 van 0,3 tot 0,5.
OPMERKING: Dit duurt ongeveer 4-5 uur duren, afhankelijk van de gebruikte stam.- Keer de buis een paar keer voorafgaand aan het meten van de OD.
- Indien de proef niet dezelfde dag worden uitgevoerd of de virusstam meerdere keren worden gebruikt in de toekomst te glycerol voorraden en verdere experiment later. Voor glycerol voorraden voeg glycerol te kweken tot een uiteindelijke concentratie van 20%. Aliquot culturen in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C. OPMERKING: Monsters kunnen s zijneerd voor maanden bij -80 ° C. Als niet het maken van glycerol voorraden, gebruikt samples direct voor overlay test.
3 Overlay Assay
- Net voor het aanbrengen overlay, meng de overlay componenten. In een 15 ml conische buis, voeg 5 ml THY, 3000-4000 U katalase, en 200 ul van de stam overlay kweek die ofwel werd gekweekt die dag of een glycerol stock van de cultuur werd bij kamertemperatuur ontdooid. Als u de reporter stam, voeg 50 ul van X-gal (40 mg / ml) aan het mengsel overlay. Gebruik een conische buis per plaat.
- Equilibreer overlay mengsel bij kamertemperatuur voorafgaand aan toevoeging van TSA gesmolten.
- Verwijder TSA plaat met gestoken stam van incubator. Smelt solide TSA in de magnetron en blijf bij 55 ° C waterbad tot gebruik. Voeg 3 ml gesmolten TSA 1,5% agar afgekoeld tot 55 ° C aan mengsel overlay.
- Bereid de overlay mengsel onmiddellijk voor pipetteren, zal het mengsel begint te zeer stollensnel. OPMERKING: Als de overlay begint te stollen voordat plating, zullen de resultaten te interpreteren zijn.
- Meng de overlay mengsel door en neer te pipetteren meerdere malen met een 5 ml pipet en let niet te bellen introduceren in het mengsel. Langzaam pipet overlay mengsel direct op de gestoken TSA plaat. Laat de plaat op de benchtop paar minuten zodat de agar uitharden.
- Laat de plaat om de overlay mengsel verdelen niet draait, zal dit de groei van de gestoken cultuur trekken in de overlay.
- Plaats voorzichtig TSA plaat met overlay op 37 ° C incubator met 5% CO 2 O / N (ongeveer 16-18 uur).
- Let op de borden na een nacht groei. De platen moeten ondoorzichtige van de groei van de overlay stam verschijnen, behalve in gebieden waar remming of feromonen signalering heeft plaatsgevonden. Deze verschijnen als ofwel helder of blauw zones rond de stam gestoken, respectievelijk.
OPMERKING: Hoewel MEASURements van de diameter van blauw of clearing kan worden vastgesteld kwantitatieve beoordeling verschillen in de diameter kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid bacteriën die is gestoken in de plaat. De overlay test is een kwalitatieve test, geen kwantitatieve evaluatie moet met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Zichtbare clearing in vergelijking met de negatieve controle beschouwd als activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn twee mogelijke uitkomsten in de overlay test. Het moet mogelijk zijn om de groei van de stam gestoken nadat nacht incuberen. In figuur 1A, de overlay stam gevoelig voor de bacteriocines geproduceerd. Een zone kan worden gevisualiseerd rondom de stam gestoken. Bovendien wervelen van de gestoken zeef in de overlay mengsel mogelijk is te zien in de figuur 1A. In figuur 1B, de overlay stam is immuun voor de bacteriocins worden uitgescheiden zoals opgemerkt door een afwezigheid van een halo rond de stab. Het is ook mogelijk dat de gestoken stam niet uitscheidende bacteriocinen. Voor de signalering assay twee verschillende uitkomsten mogelijk. De stam gestoken kan feromoon dat interageert met de histidine kinase van de overlay-stam, zoals gezien door de afbraak van X-gal zoals getoond in figuur 2A scheiden. Als het feromoon niet transcriptie van het activerenBLP locus in de reporter stam of de stam gestoken niet scheiden feromoon, verdeling van X-gal zal optreden zoals getoond in figuur 2B.
Figuur 1 Verschijning van BLP gemedieerde remming en immuniteit in een overlay test. (A) Strain P133, een bacteriocine producent werd spiked in een TSA-plaat en toegestaan om te groeien voor 6 uur. Stam P250, een bacteriocine negatieve stam, werd geënt in de overlay. Platen werden gefotografeerd na O / N incubatie. Een zone wordt aangegeven door de pijl. (B) Stam P133 werd ingespoten in een TSA plaat en geïncubeerd gedurende 6 uur. Strain 130, dat een leesraamverschuiving in blpA, werd geïnoculeerd in de overlay. Na O / N incubatie werden de platen gefotografeerd.
Figuur 2 Pheromone gemedieerde activering van BLP locus in het signaleren assay. (A) Strain P133, een BlpC type R6 secretor, werd spiked in een TSA-plaat en gedurende 6 uur. Stam P981, een BlpC type R6 reporter met een deletie in BlpC, werd geënt in de overlay. Foto's werden genomen na O / N incubatie. (B) P133 werd spiked in een TSA-plaat. Na incubatie gedurende 6 uur, P845, een BlpC het type P164 reporter met een deletie in BlpC, werd geënt in de overlay. Foto's werden genomen na O / N groei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze overlay test is een snelle manier om het bereik van activiteit bacteriocine producenten bepalen en competitieve interacties die kunnen optreden onder pneumococcen stammen tonen. De overlay test kan worden aangepast om te gebruiken voor het screenen van meerdere stammen voor bacteriocineproductiekinetiek op een enkele plaat. We hebben met succes grote stam verzamelingen deze assay gescreend met een 48-pin replicator SBA platen enten van een helft van een 96-well plaat. Na een nacht incubatie wordt de groei naar de TSA plaat met de replicator en piercing het agar oppervlak van de plaat met de pennen van de replicator.
Andere bacteriën uitgescheiden antimicrobiële peptiden die in een dichtheid afhankelijke manier zoals lantibiotica worden gereguleerd kan worden onderzocht met behulp van de overlay-techniek 7,12,13. Dit is vooral handig bij het zuiveren van een bacteriocineproductie of lantibioticum is moeilijk. Hoewel supernatanten worden getest op antimicrobiëleactiviteit, expressie van de BLP afkomstige bacteriocines in bouillon is zeer beperkt of onbestaand (gegevens niet getoond). De overlay test maakt groei een hogere dichtheid die niet wordt bereikt wanneer organismen worden gekweekt in vloeibaar. Groei op een vast medium zou ook beter aansluiten bij de in vivo omstandigheden van de neus-keelholte.
De overlay test kan ook worden gebruikt om het vermogen van de stam gestoken om de bacteriocine specifieke signalering feromoon afscheiden onderzoeken. Dit vereist constructie van een reporter stam die het feromoon receptor eiwit expressie en waarbij een feromoon reagerende promotor stroomopwaarts van het lacZ-gen is geplaatst. Waardering van feromoon secretie door een gestoken stam is vooral handig als een uitlezing van BLP locus activiteit als de gestoken stam niet de overlay stam te remmen. Het onvermogen om de overlay stam remmen kan het gevolg zijn van een niet-functioneel BLP locus (bijvoorbeeld in een testam met een mutatie transporter) of omdat de bacteriocines afgescheiden niet actief zijn tegen de specifieke overlay stam getest. De verslaggever stam overlay biedt aanvullende informatie dat de baan in de producent heeft een volledig functionele twee componenten systeem en BlpA transporter waardoor upregulatie en secretie van het feromoon. Dit betekent dat gecodeerd bacteriocinen ook worden uitgescheiden.
Er zijn een aantal beperkingen aan deze assay. De overlay test is een kwalitatieve test zodat vergelijkingen tussen de remmende activiteit of feromoon uitscheiding van verschillende stammen moeten zorgvuldig worden gemaakt. Groei tarieven en voorwaarden moeten worden overwogen bij het vergelijken van verschillende stammen, omdat de uitkomst van de test is sterk afhankelijk van de groei van de overlay en gestoken stammen. De toevoeging van catalase aan zowel de plaat als de overlay is belangrijk om de remmende effecten van pneumococcen H 2 O 2 productie in het verwijderengroei van de overlay-stam, in het bijzonder bij toepassing catalase negatieve organisme in de overlay. Gezien de bekende verscheidenheid van genomisch gehalte in de pneumococcus populatie elke remmende activiteit gezien met deze assay niet automatisch toegeschreven aan de BLP locus zonder deletie analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
