外层膜蛋白的分离线粒体的流式细胞仪免疫检测
Summary
这里描述的是这样一种方法来检测并通过免疫标记线粒体分离从啮齿动物的组织和通过流式细胞仪分析的量化线粒体外膜蛋白质。该方法可以被扩展以评估线粒体亚群的功能方面。
Abstract
方法来检测和监测线粒体外膜蛋白成分在动物组织是研究线粒体生理和病理生理至关重要。该协议描述了线粒体啮齿动物组织中分离出免疫标记是通过流式细胞仪检测的技术。线粒体是从啮齿动物的脊髓中分离并进行快速浓缩步骤，以除去髓磷脂，来自神经组织制备的线粒体级分中的主要污染物。分离的线粒体，然后标记所选择的抗体和荧光标记的二抗。分析流量通过与线粒体特异性染料，其次是检测和免疫标记蛋白定量染色流式细胞仪验证线粒体制剂的相对纯度。该技术具有快速，量化和高吞吐量，允许成千上万的每个样本的线粒体的分析。它可适用于评估新颖p在正常生理条件下，在线粒体表面roteins以及病理过程中，可能会成为错误定位到该细胞器的蛋白质。重要的是，这种方法可以被耦合到荧光指示剂染料对线粒体亚群的某些活动的报告，并为从中枢神经系统（脑和脊髓）以及肝线粒体可行的。
Introduction
线粒体是经过多轮的裂变和聚变，被运到高能源需求的网站，并迅速生理刺激反应1高动态性的细胞器。因为人们越来越认识到不同组织内的线粒体，甚至不同的细胞区室，具有不同的功能配置文件，需要新的方法来识别这些不同的线粒体亚群。
显微术提供了一种方法，通过个别线粒体可以可视化和蛋白质在或在线粒体可以通过免疫2来确定是否存在。然而，用这种方法定量分析是劳动密集和更适合用永生化或原代细胞系的实验。来源于组织的个体的线粒体的研究是显著更加困难和最方法不允许以易于识别线粒体亚群与evalu并发通报BULLETIN线粒体功能3。
为了解决这一难题，一种新颖的方法来immunolabel线粒体分离从啮齿动物组织中，并随后分析通过流式细胞术已经被开发出来。这允许快速检测并定位于线粒体外膜，其相比于分析由显微镜蛋白质的定量，少得多的劳动密集的，并允许以十万计的线粒体中的单个样品的分析。此测定法可用于监测被认为是组成性存在于线粒体的线粒体外膜蛋白质的命运和相对量，蛋白质的募集到线粒体表面，或错误定位在病理条件下，线粒体蛋白的检测。此外，以往的荧光指示剂染料的掺入允许的线粒体功能的某些方面，在不同的线粒体同时评价亚群。
Protocol
Representative Results
Discussion
这是越来越明显，线粒体是关键球员在正常生理和疾病。虽然免疫可以确定哪些蛋白质在线粒体或在线粒体表面发现了在一定的条件下，对整个人口的平均这个方法报告。此方法不能产生约线粒体亚群或亚群的相对丰度信息。虽然先前已假设所有线粒体创建相等，则该字段被越来越多地认识到在小区内的线粒体在形态和/或函数10方面的广泛变化。
荧光显微镜方法…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢劳瑞Destroismaisons和出色的技术支持莎拉Peyrard和Dr.Alexandre宝勒访问的流式细胞仪。我们也想感谢蒂莫西·米勒博士，他的贡献就从筹备去除髓鞘。这项工作是由卫生研究院（CIHR）神经肌肉研究合作伙伴，加拿大创新基金会，加拿大ALS协会，基金会弗里克ALS研究，密友基金会和全宗德拉RECHERCHE桑特连接魁北克（CVV）加拿大研究院的支持。无论是CVV和NA是研究学者的全宗德拉RECHERCHE桑特连接魁北克与CIHR新的调查。 SP被蒂姆·诺埃尔助学金来自加拿大的ALS协会的支持。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
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