Protocol
1，样品制备
- 得到含有荧光素酶表达的病毒（本文VSVΔ51-Fluc为例）为滴定并转移至96孔板的样品。交替地，执行在96孔组织培养板直接与使用上清液感染。
- 留下两列未处理列入标准曲线。用于实验的实验（40小时后的感染）或存储在-80℃和滴度的末端在96孔板中，滴度直接做在稍后的日期。
2，准备允许细胞进行病毒滴定
- 24小时前滴定，制备Vero细胞的悬浮液以2.5×10 5个细胞/在Dulbecco改良的Eagle培养基毫升（DMEM）中含有10％胎牛血清（FBS），30mM的HEPES的浓度，和1％青霉素/链霉素。注：尽管本协议使用Vero细胞，任何适当的宽容细胞系的VSV感染可以bê使用。
- 在使用微板的分配器96孔白色固体的平底板种子2.5×10 4个细胞（100微升）。
- 制备12毫升细胞悬浮液，每片加5毫升涂刷。
- 干净微分配器盒通过冲洗管路用50ml无菌水。
- 填充微分配器线路用细胞悬浮液，并让5毫升细胞悬浮液的流过。
- 选择一个程序，将分配100μl的在白壁96孔板的每个孔中。分配，并重复所必需的附加板。还种子几孔中96孔透明平底板如果不透明底白墙板用于验证的细胞的健康和密度。
- 完成后，冲洗细胞放回原包装内。通过运行50毫升70％乙醇中的随后加入50毫升的温无菌水通过管道清洁盒。
- 确保磁带和油管是AP使用之间propriately清洗。
- 培养在湿润的5％CO 2培养箱中的细胞24小时，在37℃。
3，病毒的制备标准曲线
- 制备VSVΔ51-Fluc在无血清DMEM中的标准曲线，使得噬斑形成单位（pfu）每毫升转印后的最终浓度到Vero细胞上是如下：10 8 PFU / ml的10 7 PFU / ml的， 10 6 PFU / ml的10 5 PFU / ml的10 4 PFU / ml的，10 3 PFU /毫升，10 2 PFU / ml，并将10 1 PFU / ml的。准备50微升每盘Vero细胞上加上一个额外的10％，每个浓度。
请注意：在荧光素酶的病毒原液的效价将需要在一个经典方式10为了产生标准曲线，将允许为绝对定量评估。否则，相对定量可以在不准确的效价信息通过任意设定病毒滴度达到基础在稀释步骤。例如在标准曲线的第一稀释度可以被设置为10 8病毒单元和以下10稀释到10 7等。在这种情况下，应该表示的值作为倍数变化相比预先确定的样本作为绝对定量将不准确。
4，样品转移上清到允许细胞
- 检查Vero细胞接种在透明底的96孔板，用光学显微镜来确认单层是至少95％汇合。
- 转账25微升样品上清液到Vero细胞接种于白墙板。不转移上清液到指定的标准曲线2列。注意：此可同时对所有的孔上使用96通道的液体处理的单个板来完成。
- 每种稀释液的标准曲线的制备在步骤3到Vero细胞中的使用8位或12通道多通道移液器，加25微升2指定列。
- 离心平板5分钟，在430 XG在RT。
- 在潮湿的5％CO 2的培养箱中孵育5小时，在37℃。
细胞活性的5评价
- 请注意：当从在清晰的96孔板进行感染实验中获得的上清液开始，样品活力之前可以量化与细胞存活率指示剂染料诸如刃天青评价。
- 的量等于该体积的10％，在96孔板中含有病毒和细胞样品的每个孔中加入刃天青。包括细胞只控制以及媒体只控制分别确定为100％和0％生存力的值。
- 后2-4小时（温育时间将取决于细胞类型和对染料的市售的或再造的粉末的浓度变化），读取并使用荧光板读数器（530-560激发，590发射）记录该信号。报告细胞viabili×100％根据下式的相对代谢活性= - （ - 负控制信号）/（细胞只能控制信号的负控制信号）（试验样品信号）TY为样品
6，制备荧光素底物
- 30分钟5小时孵育结束前，制备荧光素，以获得2毫克/毫升的溶液在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。准备每盘2.5毫升加上一个额外的2毫升避光的解决方案。注：荧光素，也可以在当天早些时候制备并保存于4℃直至使用。
7，读生物发光
- 5小时培养结束后，在白色的固体平板添加25μl的荧光素对Vero细胞的每个孔中。手动或使用自动分配器集成在光度计中添加荧光素。注意：只有单和终点使用的仪器读取可能需要添加荧光素酶裂解兼容的BUFFER之前加入萤光素底物，以改善一致性。
- 阅读以下参数的板：
- 摇动5秒。
- 等待30秒。
- 阅读发光在适当的固定感光度/曝光值。如果该选项可用在仪器上，使用多点读取（ 例如，3×3矩阵），以提高准确性。
- 记录并保存定量生物发光强度。
- 如果一个自动化分配器用于添加荧光素清除萤光素和素用温水无菌水的线条。
8，数据分析
- 为准确的结果，解决了非线性回归，以产生从标准曲线希尔方程。套用这个公式的滴定样品来计算病毒表达单位。某些病毒或情况可能会产生的标准曲线的线性关系;在这种情况下求解线性方程。
Representative Results
描述了高通量方法的工作流程的概要示于图1，图2示出了一个典型的标准曲线ofVSVΔ51-Fluc的结果。四参数非线性回归分析所产生的积山从未知输入PFU（病毒滴度的估计），可以插。这些估计滴度被称为病毒表达单位（VEU）。 图3A示VEUs和滴度通过执行具有相同的样品10标准的空斑测定法得到的。样品源自其中的各种化学品使用，以增强复制和786-0细胞扩散VSVΔ51-Fluc的一个实验。 VEUs从标准曲线内插必须由这是基于样品的上清液的稀释因子乘以被转移到Vero细胞中（在这种情况下，稀释因子为5）。滴度和VEU之间的线性相关性， 如图3B所示2的0.8083和0.899（P <0.0001）皮尔森的Ř得分。在图4中 ，从代谢法得到的典型的细胞的细胞毒性数据显示为与化学品在感染前用VSVΔ51-Fluc处理786-0细胞。最后， 图5示出了具有各种病毒获得的典型的标准曲线（单纯疱疹病毒（HSV），牛痘病毒，和腺相关病毒（AAV），所有表达萤火虫萤光素酶），并描述的孵育时间和冻融循环，根据需要。
图1中的工作流的高通量病毒滴定和细胞毒性测定用VSVΔ51-Fluc。 （一）种子2.5×10 4 Vero细胞每孔（100微升）细胞培养在37℃（B）24小时后转移25μl的标准曲线的对向Vero细胞（每盘2列），（C）转移25μl的样品进行滴定到剩余的Vero细胞。离心机板，并在37℃（D）在相等的量在体积的10％的孵化均匀，加入刃天青试剂含有原始样品板。培养板在37℃（E）的 3小时后，读取并记录荧光和评估细胞毒性（F）第5小时后，加入25微升2毫克/毫升的溶液的荧光素对Vero细胞的每个孔中。阅读发光并计算病毒表达单位。
图2。预期的VSVΔ51-Fluc的标准曲线。荧光素酶的表达是我asured内使用发光井和生物发光是用平均相对光单位（RLU）的五个不同点5小时后上清液转移。平均RLU作图对已知输入PFU / ml的解决非线性回归和生成希尔方程。两个复制曲线和标准误差线的平均值示相关（r 2 = 0.9993）。
图的标准空斑测定滴定度与通过高通量方法3得到的比较。 （A）在PFU / ml的通过标准空斑测定在Vero细胞上获得与使用的高通量荧光素酶测定法滴定相同的样品计算的病毒滴度（VEU /毫升）进行比较（B）线性VEU /毫升之间关系的病毒滴度并通过标准纵获得滴度laque检测。线性回归曲线和决心（R2）的系数显示。
图4样品的可行性。样品活力之前，上清液转移到Vero细胞上通过评估使用市售的刃天青溶液细胞代谢活性测定。原始荧光值标准化为未处理，未感染的孔中。
图5。预计单纯疱疹病毒，牛痘，和AAV病毒的标准曲线。荧光素酶的表达是衡量五个不同点内使用发光良好，生物发光是用平均RELA略去光单位（RLU）：（A）HSV标准曲线，加入到Vero细胞接种24小时前在每孔中（100微升）和萤光素酶测定为2.5×10 4个细胞的密度被制成17小时后supernantant转移（R 2 = 0.9489，n = 1时）。甲希尔方程，通过求解非线性回归产生的（B）牛痘标准曲线，加入到Vero细胞上镀每孔（100微升）2.5×10 4个细胞的24小时更早的密度和在37℃下温育2.5小时C，之后被带到荧光素酶测定（R2 = 0.9892）。的线性方程，通过求解线性回归产生的（C）的AAV标准曲线，加入到人肺癌细胞（A549细胞）接种24小时前在每孔中（100微升）和萤光素酶测定为2.5×10 4个细胞的密度有人24小时后感染。甲希尔方程，通过求解非线性回归产生的。平均五个复制曲线和标准误差条示（R 2 = 0.9926）。
Discussion
这里描述的荧光素酶为基础的方法提供了许多优于其它现有的方法，包括其方便，快速，最小的设备的需要，并且成本相对较低。一个关键因素，这是避免连续稀释步骤。尽管如此，这个协议的系列稀释基衍生物是肯定可行的，最近被用于评估在高通量抗病毒药屏幕11荧光素酶表达埃博拉滴度。而本质上更耗时且较昂贵，这样的修改可以针对病毒的定量提供更大的动态范围，必要时。除了是特别适合用于评估病毒滴度在高通量筛选的上下文中，我们的一步法荧光素酶基的病毒定量方法产生在复制病毒的情况下，感染性病毒粒子的准确估计。此外，发光以及来自同一实验的细胞毒性数据读数得到更的靶细胞上的实验条件下的效果完整图像，这是在溶瘤病毒和药物屏幕的背景下尤其有用。
这里所示的例子中使用了复制的负单链RNA病毒;然而，该协议可以适应许多复制型或非复制型病毒有一些小的协议的调整。这包括DNA病毒，如牛痘，单纯疱疹病毒，和腺相关病毒（参见图5）。感染细胞内的病毒，如牛痘病毒，例如样品，需要事先向量化（ 例如 ，至少一个冷冻-解冻周期）的病毒的释放步骤。当应用该技术对其他的病毒，它是必要的，以从病毒上清液或裂解物由光度计转移到所述板的读取优化的温育时间。该参数将主要取决于病毒在允许细胞系和复制周期p的强度romoter驾驶荧光素酶的表达。这最好通过使用完整的标准曲线，在优化步骤中完成的。要做到这一点，必须有感染的编制标准曲线的各种重复的适当宽松细胞系和阅读每个重复在不同的时间点后转移。理想情况下，孵育时间点被选择，导致LOG（RLU）和LOG（效价）之间的线性关系跨越预期样品的滴度范围。为VSVΔ51-Fluc，这通常是从10 4 PFU / ml的-10 7 PFU / ml的为5小时的温育时间。如果更低或更高的滴度从样品预期，可以简单地增加或减少培养时间分别。或者，样品可以稀释到下降多达通常用于ELISA进行的范围内。
如上面所提到的，这种方法非常适合于执行使用药物库的大多数步骤可以是自动化的高通量药物屏幕。细胞可以被镀èfficiently使用自动化微板的分配器，所述药物库可使用96通道的液体处理器加入，病毒可以使用微分配器被添加和平板阅读使用自动化的光度计。从理论上讲，这也适用于384孔或更小的格式;但是，不限于该端是多个小区可以被镀的，给予较少的细胞导致更窄的范围中的LOG（RLU）的线性度，以LOG（效价）的关系。最后，使用刃天青或其他代谢染料细胞活力评估可以很容易地在工作流中引入，从而允许细胞毒性化合物的抗病毒帘或鉴定的化合物，导致协同杀伤与病毒12组合判断。然而，这种方法的局限性包括：荧光素酶转基因表达的病毒，这并不总是可能的要求，并具有足够允许细胞系的可用性。然而，这很可能能够适应该方法与其它报告基因的使用（ 例如 ，GFP）提供记者定量方法具有适当的线性度和信噪比。总体而言，所描述的高通量的方法可以进行修改，以适应许多不同的病毒，并适用于多种应用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1 mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96-well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
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