Summary
A janela da câmara de dobras cutâneas dorsal murino apresentado visualiza uma zona de isquemia aguda persistente de um retalho musculocutâneo. Intravital epi-fluorescência licenças de microscopia para avaliação direta e repetitiva da microcirculação e quantificação de hemodinâmica. Morfológica e resultados hemodinâmicos podem ainda ser correlacionados com análises histológicas e moleculares.
Abstract
Apesar de profunda experiência e técnicas cirúrgicas avançadas, complicações induzidas por isquemia que variam de quebra ferida à extensa necrose dos tecidos ainda estão ocorrendo, particularmente na cirurgia de retalho reconstrutiva. Vários modelos experimentais de aba ter sido desenvolvido para analisar mecanismos e causas subjacentes e para investigar as estratégias de tratamento para prevenir complicações isquémicas. O fator limitante de a maioria dos modelos é a possibilidade de falta direta e repetidamente visualizar a arquitetura microvascular e hemodinâmica. O objetivo do protocolo é apresentar um modelo de rato bem estabelecida filiar esses elementos que faltam antes mencionados. Mais difícil et ai. Desenvolveram um modelo de uma aba musculocutaneous com um padrão aleatório de perfusão que sofre de isquemia e os resultados persistente aguda em ~ 50% de necrose depois de 10 dias se mantido não tratado. Com o auxílio de microscopia de epi-fluorescência intravital, este modelo de câmara permite a visualização repetitiva demorfologia e hemodinâmica em diferentes regiões de interesse ao longo do tempo. Processos associados, tais como apoptose, inflamação, o vazamento microvascular e angiogênese pode ser investigado e correlacionados com ensaios de proteína imuno-histoquímica e molecular. Até o momento, o modelo provou viabilidade e reprodutibilidade em vários estudos experimentais publicados que investigam o efeito do pré, peri e pós-condicionamento de tecido isquemicamente desafiado.
Introduction
Cobertura de material de tendão, osso e implante exposto em cirurgia reconstrutiva depende da utilização de abas. Uma aba é um bloco de tecido que é transferido no seu pedículo vascular que garante influxo arterial e retorno venoso. Apesar da perícia e da ampla disponibilidade de uma variedade de abas sejam transferidos, complicações induzidas por isquemia que variam de desagregação da ferida para a perda de tecido total ainda são encontrados. Considerando o tratamento conservador e cicatrização por segunda intenção pode ser esperada após necrose do tecido menor, necrose significativa geralmente requer revisão cirúrgica, incluindo desbridamento, condicionamento de feridas e reconstrução secundária. Isso aumenta a morbidade, prolonga a internação e, conseqüentemente, leva ao aumento dos custos de cuidados de saúde.
As abas com um padrão indefinido de vasculatura ou áreas perfundidos aleatoriamente na zona distal mais afastada do influxo arterial são particularmente propensas a danos isquémico. Acco rdingly, numerosos estudos experimentais e clínicos têm avaliado o desenvolvimento de necrose em ambos, retalhos de padrão axial (fornecimento de sangue definido) e retalhos de padrão aleatório (fornecimento de sangue indefinido) 3/1. As principais conclusões são comumente baseado na avaliação macroscópica do tamanho da área de necrose. A fim de avaliar as causas e os mecanismos da necrose tissular em mais pormenor, vários estudos concentraram-se na análise da microcirculação. Diferentes técnicas têm sido usadas para medir a perfusão tecidual, incluindo a análise da tensão de oxigênio nos tecidos utilizando eletrodos polarográficas 05/04, bem como a medição do fluxo de sangue utilizando dopplerfluxometria a laser 6-7, corante difusão 8, e microesferas 10/09. Estas técnicas, no entanto, só permitem a medição de parâmetros indiretos de perfusão tecidual e não permitir qualquer análise morfológica dos processos microhemodynamic dentro de uma área individual de interesse de um retalho.
t "> Sandison é conhecida por ser a primeira que tenha usado uma câmara transparente prolongada para estudos in vivo, o que ele realizados em coelhos 11 Em 1943 -. cerca de 20 anos mais tarde - Algire foi o primeiro a se adaptar uma câmara, de modo transparente para ser aplicável em camundongos, a fim de estudar o comportamento de micro-implantes de células tumorais 12. Devido ao fato de que os ratos são os chamados animais de pele solta e depois de alguns aperfeiçoamentos técnicos ao longo dos anos seguintes, Lehr e colegas de trabalho foram capazes de adaptar tais uma câmara de dobras cutâneas dorsal desenvolver uma câmara de titânio menor e mais leve. Esta câmara permitiu a avaliação em microscopia de fluorescência intravital, uma técnica que permite a visualização direta e repetitiva de uma série de características morfológicas e da microcirculação e suas mudanças ao longo do tempo, em diferentes condições fisiológicas e fisiopatológicas, tais como a lesão de isquemia-reperfusão 13.Na investigação de perfusion de pele, músculo e osso abas em condições normais e patológicas duas tendências ocorreu: Em primeiro lugar, os modelos aba "aguda" que não usam a câmara prega dorsal, como a aba lateral pediculado no camundongo 14, o retalho ilha da pele com base lateralmente no hamster 15 e do retalho pediculado composto em ratos 16. Em segundo lugar, o modelo flap "crônica", onde a combinação de um retalho com dobras cutâneas dorsal licenças de câmara microcirculação repetitivo análises ao longo de vários dias, com a microscopia de fluorescência intravital. É constituída por uma aba musculocutaneous perfundido aleatoriamente, que está integrado na câmara de dobra cutânea do rato 17. Sua relação largura-comprimento foi escolhido que uma situação de isquemia aguda persistente consistentemente resulta em ~ 50% necrose tecidual aba 10 a 14 dias após a elevação do retalho. Esta medida reprodutível de necrose do tecido permite uma avaliação mais aprofundada de ambos, de proteção (ou seja, o desenvolvimento de less necrose) e factores prejudiciais (isto é, o desenvolvimento de mais de necrose) no fisiopatologia aba. Durante os últimos anos, várias publicações experimentais que demonstrem o efeito do pré-diferente, os procedimentos pós-condicionado, incluindo a administração de substâncias de tecido de proteção 18-24 e aplicação local de estressores fisiológicos, tais como calor e ondas de choque 25 26 peri e, têm surgido.
As análises quantitativas de necrose, morfologia microvascular e parâmetros da microcirculação pode ainda ser correlacionada com as análises de imuno-histoquímica e testes de proteína. Proteínas e moléculas diferentes, incluindo o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), sintases de óxido nítrico (NOS), factor nuclear kappa B (NF-kB) e proteínas de choque térmico (HSP-32: heme oxigenase-1 (HO-1) e HSP- 70) tem mostrado desempenhar um papel na protecção dos tecidos. Com base neste modelo aba câmara, duas modificações têm sido desenvolvidos na order para analisar a neovascularização ea microcirculação da pele durante o enxerto cura 27 e desenvolvimentos angiogênicos em um retalho pediculado com padrão axial perfusão 28. Nós apresentamos um modelo reprodutível e confiável, que inclui uma aba musculocutaneous isquemicamente desafiado na câmara de rato de dobras cutâneas. Este modelo permite a visualização e quantificação da microcirculação e hemodinâmica por microscopia de epi-fluorescência intravital.
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Protocol
NOTA: Antes da implementação do modelo apresentado, as leis de proteção animal correspondente deve ser consultado e permissão deve ser obtida junto das autoridades locais. Neste trabalho, todos os experimentos foram realizados em conformidade com os princípios orientadores para animais de pesquisa envolvendo e da legislação alemã sobre a protecção dos animais. Os experimentos foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais local.
1. Preparação Animal e elevação cirúrgica da Flap
- Manter os animais em gaiolas individuais à temperatura ambiente de 22-24 ° C e a uma humidade relativa de 60-65%, com um ciclo de dia e noite de 12 horas. Permitir o livre acesso à água potável ratos e ração padrão de laboratório. Sempre manter condições estéreis durante a cirurgia sobrevivência.
- Anestesiar o rato por via intraperitoneal (ip), a injecção de 0,1 ml de solução salina por 10 g de peso corporal, contendo 90 mg / kg de peso corporal de cloridrato de cetamina e 25 mg /kg de cloridrato de bw dihydroxylidinothiazine. A anestesia é necessário para a preparação dos animais, cirurgia e microscopia subsequente. Confirme anesthetization adequada, verificando a resposta a um estímulo doloroso. Durante o tempo de anestesia, aplique pomada veterinário sobre os olhos para evitar o ressecamento.
- Após a indução da anestesia suficiente, depilar as costas com um barbeador elétrico. A partir de agora, aplicar a depilação creme para a área raspada para remover o cabelo restante.
- Durante o tempo de permanência do creme de depilação de ~ 7-10 min, preparar instrumentos, incluindo fórceps de pele e micro fórceps, tesouras e micro tesouras, material de sutura e uma caneta. Desinfetar e preparar a câmara de titânio, aplicando os parafusos com a porca na base da câmara e pela fixação de espuma auto-adesiva (Fig. 1 AC) em torno da janela de contrapartida da câmara para garantir a estanquidade do sistema de câmara.
- Remova todo o creme de depilação da parte traseira por lavagemlo com água morna. Em seguida, secar e desinfectar a pele com uma solução contendo álcool.
- Posicione o mouse na posição prona e definir a linha média das costas. Segure a pele central e levante-o para criar uma dobra (Fig. 2A). Por trans-iluminação usando qualquer tipo de fonte de luz, decidir onde colocar provisoriamente a armação de titânio (Fig. 2B). Certifique-se de que os ramos distais da artéria torácica lateral (LTA) cranial e artéria ilíaca profunda circunflexo (DCIA) caudal curso através do centro da janela da câmara (Fig. 2B-D). Uma vez que o posicionamento da câmara é feito, ambas as camadas de perfurar a pele na parte inferior da prega de fixação posterior da armação de titânio. Agora retire a armação de titânio, coloque o mouse na posição prona e redefinir a linha média das costas, se necessário.
- Esboço da aba perpendicular à lombada começando na linha média com uma relação entre largura e comprimento de 15 x 11 milímetro para resultar em uma aba lateral e perfundidos com base aleatoriamente. Em seguida, delinear uma área adicional de pele de 2 milímetros estendendo-se para o lado contralateral (Fig. 2C, D). Esta área é captado com os fórceps e depois suturado à armação de titânio, sem interferir com a área aba visível.
- Após a última marcação, inciso do retalho. Ao fazê-lo, tanto o LTA transecção e DCIA e elevar a aba (Fig. 2E). Não há necessidade para a coagulação ou a ligadura dos vasos seccionados.
- Coloque o parafuso da câmara através das perfurações da pele feitas anteriormente (Fig. 2F) e fixar a dobra cutânea tanto anteriormente quanto posteriormente dentro do quadro da câmara do retalho elevado para a parte traseira do quadro usando os buracos de armação da câmara e um 5-0 suturas interrompidas (Fig. 2G).
- Suturar os membros verticais da aleta traseira para a pele circundante por meio de 5-0 interrompidas (
- Extirpar uma área de hemi-circular de pele de lateral para a pequena tira de pele de 2 mm, isto é, no outro lado da aba de observar vasculatura da aba. Isto permite vista directa através da janela de observação da câmara que tem uma superfície de 90 mm, 2.
- Remover o tecido areolar frouxo gelatinoso do músculo estriado utilizando instrumentos de microcirurgia e lente de ampliação óptica ou microscópio a fim de melhorar a qualidade da imagem durante a microscopia. Tente não danificar os vasos dentro das camadas do tecido muscular.
- Finalmente, vedar a câmara através da montagem do homólogo do quadro que tenha sido previamente dotado com tiras auto-aderente de espuma anteriormente, cranialmente e posteriormente, borrifar a aba com bisbenzimida tópica e solução salina (Fig. 2J). Depois disso, aplique a janela de observação com uma tampa de vidro usando um anel de pressão. Tente não prender quaisquer bolhas de ar sob o vidro (Fig. 2 K, L). A pele vai aderir ao vidro da tampa por forças de adesão.
2. Intravital epifluorescência Microscopia
- Espere 24 horas após o preparo cirúrgico para a primeira análise microscópica de qualidade óptica ideal. Esta análise representa a linha de base de microscopia e é repetido nos dias 3, 5, 7 e 10 após a cirurgia. Cada tempo, anestesiar o rato, tal como descrito na etapa 1.2. Colocar o animal em posição de decúbito lateral sobre um portador de acrílico feito sob medida. Dessa forma, as camadas do tecido muscular do retalho aderindo ao vidro da tampa estão enfrentando up-alas.
- Injetar 0,05 ml de 5% dextrano verde fluorescente (peso molecular 150.000) e 0,05 ml de 1% de corante altamente fluorescente família Rhodamine em uma veia da cauda ou do plexo venoso retro-bulbar. O dextrano verde fluorescente mancha as componentes não celulares do sangue, se aplicado por via intravenosa (iv). O fluorescente rodamina manchas leucócitos e plaquetas, que pode ser distinguished de outros componentes celulares e não celulares. Finalmente, bisbenzimida manchas componentes nucleares que emitem fluorescência mais ou menos de acordo com o estado de condensação.
- Subsequentemente, colocar o rato sob o microscópio. Certifique-se o microscópio inclui um sistema de LED - combinações de feixe de LED para 470 e 425 nm, 365 nm e 490, e 540 e 580 nm, bem como os conjuntos de filtros correspondentes (62 HE PBF / GFP / HcRed, faixa de 1: 350-390 nm comprimento de onda de excitação, dividir 395 nm / 402-448 nm; faixa 2: 460-488 nm, 495 nm dividida / 500-557 nm; faixa 3: 567-602 nm, 610 nm dividida / 615 nm para 20 Rhodamine infinito, alcance. : 540-552 nm, 560 nm dividida, emissão 575-640 nm).
- Grave as fotos e filmes-retratos usando uma câmera de vídeo de carga acoplada dispositivo e salvá-los em um disco rígido de computador para análise posterior off-line.
- Use diferentes objectivos (2.5X, NA (abertura numérica) = 0,06 para vistas panorâmicas da câmara; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) para as gravações das regiões de interesse.
- Virtualmente, pode dividir a superfície da aba que é visível através da janela da câmara em três áreas da mesma altura, ou seja, uma extremidade proximal, uma central e uma zona distal mais afastada do fluxo vascular (Fig. 3F). Para aquisição de imagem, proceda da seguinte maneira em cada momento de observação:
- Digitalize a imagem do tecido por imagem dentro da janela da câmara de proximal para distal com o objetivo de 5X.
- Em cada área do retalho, selecione arteríolas de segunda ou terceira ordem e seus acompanhantes vênulas com padrões de ramificação facilmente identificáveis. Usando o objectivo 5X, 10X, 20X ou, fazer impressões dos feixes arteriolovenular, a fim de re-localizar facilmente os pacotes ao longo de todo o período de observação.
- Com o objetivo de 20X e 50X o objetivo, mais registro 5-6 campos capilares e "apoptótica"campos por área do retalho, respectivamente. Todas as imagens gravadas com a 10X e 20X objetivos usar a luz azul (dextrano fluorescente) ea luz verde (rodamina) filtro, enquanto que as imagens gravadas com o 5X e 50X uso objetivo luz azul (dextran fluorescentes) e luz branca (Bisbenzamida) filtro, respectivamente .
3. Análise dos dados registrados
NOTA: Com a utilização de um sistema de análise de imagem assistida por computador quantificar todos os parâmetros gravados fora de linha 29 como se segue.
- Medição da área de não-perfundido, respectivamente tecido necrótico (mm 2).
- Use a imagem completa câmara digitalizados janela gravado com o objetivo de 5X (de 2.6.1) eo dextrano fluorescente para medir o tecido não-perfundidos respectivamente necrosado. Use a função "AreaBo" para medir a área não-perfundidos escuro: Beira da área não-perfusão e calcular a área em mm 2 por meio da área de algoritmos de medição do software.
- A medição do diâmetro microvascular em arteríolas, capilares e vénulas (um).
- Carga de vídeo ou fotos dos AV-feixes gravadas ou os campos capilares para o software. Para melhores resultados, use as fotos ou vídeos com a maior ampliação onde as fronteiras definitivas do navio são claramente visíveis.
- Use a função "DiamPe" do software para certificar-se as medições são realizadas perpendicular à parede do vaso. Para fazê-lo marcar dois pontos sobre a parede do vaso e com o terceiro marca clique o diâmetro perpendicular do navio. O software irá executar a medição im.
- Repita as medições sobre as mesmas para todas as gravações de vasos no mesmo local. Medir múltiplos capilares para acumular diâmetro médio.
- Análise de células do sangue (RBC) velocidade vermelho nas arteríolas, capilares umand vénulas (mm / seg).
- Para arteriolar células do sangue (RBC) velocidade vermelho (mm / s) medições de usar a função "VeloLSD" do software e escolher os mesmos vasos na janela dextrano fluorescente para que os diâmetros foram medidos.
- Analise-o com o sistema de análise de imagem assistida por computador, utilizando o método do deslocamento de linha, que está na base da medição do deslocamento (mm) de um padrão individual intravascular nível de cinza ao longo do tempo (seg).
- Quantificação do fluxo volumétrico em vasos (pl / seg).
- Calcular o fluxo volumétrico do sangue (pl / seg) em arteríolas, vénulas e capilares a partir da área de corte transversal do navio e da velocidade de RBC (π * r 2) de acordo com a equação de Gross e Aroesty, isto é, Q = V * r * 2 π , assumindo uma forma cilíndrica vaso 30.
- A medição da densidade capilar funcional de capilares RBC-perfundidos (perfusão nutritivo: cm / cm
- Coloque um campo capilar fluorescente gravado com ampliação de 20x objetivo para o software. Use a função "DensLA" para medir a densidade capilar funcional de microvasos RBC-perfundidos.
- Trace os capilares perfundidos com o cursor e marcar os vasos perfundidos. Não marcar não-perfundidos capilares arteríolas ou vênulas. O software irá medir a densidade capilar funcional dos capilares perfundidos em cm / cm 2. Repita os passos para os outros campos capilares gravados.
- Carregar vídeos gravados ou quadros de campos capilares fluorescentes no software. Identificar vasos gyrose e usar a função "TorqIx" do software. Trace o fluxo do vaso definitivo com o curso e terminam com um clique direito. O software irádesenhar uma linha reta para a forma direta e vai colocá-lo em relação com o caminho traçado.
NOTA: Esteja atento aos sinais da angiogênese, como brotos, brotos e capilares recém-formados, que normalmente emanam perpendicularmente dos capilares pré-existentes. Medir a densidade destes vasos recém-formados, tal como descrito na etapa 3.5.
- Coloque vídeos Bisbenzamida-gravados (objetiva 50X) para o software. Use a função "DenseNA". Marque células em apoptose de acordo com as características mencionadas, tais como a condensação nuclear, fragmentação e marginalização com um clique esquerdo.
- Depois de marcar todas as células característicos de todo o vídeo, clique em "N / A" no software, que contará automaticamente todas as células marcadas e dividi-lo em toda a área. O resultado será apoptóticacélulas / mm 2.
- Analisar a resposta inflamatória através da contagem do número de leucócitos Rodamina que aderiram ao revestimento endotelial das vénulas pós-capilares por um período de tempo de ≥30 seg ("adesivos") e os leucócitos que aderem de forma intermitente marcado (<30 seg, "rolos") . Venular a adesão de leucócitos é expresso em células por mm2 da superfície endotelial.
- Avaliar macromolecular leakage como um parâmetro de permeabilidade microvascular após uma injecção intravenosa de um dextrano fluorescente. Densitometricamente determinar vários níveis de cinzento do tecido directamente adjacente à parede do vaso capilar (E1), bem como no plasma isento de células marginal do recipiente (E2). Em seguida, calcular o extravasamento macromolecular (E) é a relação de E1 / E2 31.
4. Cuidados Pós-Operatórios
- Retorne o animal em uma gaiola separada para evitar a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Monitorar os animais diariamente para o sangramento, local e sinais sistêmicos de infecção ea posição da câmara.
- Avaliar o estado geral do animal, observando a atividade motora, o peso corporal, os sinais de dor, tolerância ao vestir e auto-mutilação.
- Manter a ratinhos um por gaiola para evitar mutuai manipulação da câmara. A qualquer sinal de dor, aplicar buprenorfina numa dose de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por via subcutânea, em intervalos de 8 h.
5. Eutanásia e explantes da Câmara Skinfold
- No dia 10, sacrificar os animais utilizando uma dose letal de uma droga anestésica (150 mg / kg de pentobarbital).
- Retire a câmara e provar o tecido aba para ensaios de proteína de imunohistoquímica e molecular. Tecidos de amostra para histologia convencional (formol) e ensaios de proteína quantificáveis (nitrogênio líquido ou gelo seco).
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Representative Results
Necrose
O principal desfecho deste modelo - a necrose do tecido seguinte elevação do retalho (ou seja, a indução de isquemia aguda persistente) - é repetidamente medido e ilustrado macroscopicamente como mostrado na Figura 3 ao longo de um período de 10 dias. Demarcação final de área de necrose geralmente ocorre entre os dias 5 e 7 após a cirurgia e é caracterizada por uma franja vermelho, isto é, zona de vasodilatação e remodelação microvascular, desenvolvendo vital entre as extremidades proximal e distal da zona necrótica da aba (Fig. 3D-F ). Camundongos controle não tratados costumam desenvolver uma área de necrose de cerca de 50% após 10 dias, que pode ser dividido em três áreas distintas: a proximal bem perfundido, a área central intercalada e criticamente perfusão ea necrose da área distal (Fig 3F.). Estudos prévios do nosso grupo, como mencionado na introdução, mostraram e proteçãoffects após diferentes procedimentos de pré-condicionamento, que são caracterizados por uma mudança da área criticamente perfundidos a partir da zona central em direcção à zona distal do retalho.
Parâmetros do navio
Diâmetros microvasculares e de glóbulos vermelhos (RBC) -velocity de arteríolas e vênulas de vários diâmetros, bem como dos capilares vizinhos são medidos e o fluxo de sangue volumétrico resultante é calculado off-line. Isto permite correlacionar as alterações morfológicas e funcionais tanto de microvasos distintos a partir do dia 1 até ao dia 10 (Fig. 4A-B). Além disso, a densidade funcional dos capilares perfundidos-RBC, o parâmetro para a perfusão do tecido nutritivo, é analisado. Os vasos capilares são geralmente orientadas em paralelo e presente com diâmetros entre 3-5 mm, sob condições fisiológicas (Fig. 4C). O fluxo de sangue, a densidade capilar funcional e, eventualmente, a tensão de oxigênio do TISSUe diminuir gradualmente a partir de proximal para distal para chegar a um limiar "de viabilidade" (Fig. 4C-E), onde os capilares não são perfundidos mais (Fig. 4E).
Remodelação microvascular e angiogênese
Remodelação com dilatação e aumento da tortuosidade dos microvasos podem ser observados em todos os grupos experimentais submetidos a preparação aba (isto é, a indução de isquemia aguda persistente: A Fig. 4F). No entanto, neste modelo, o estímulo isquémico por si só não é suficiente para induzir a angiogénese como, por exemplo, visto em uma variedade de experiências de pré-condicionamento com a hormona eritropoietina (Fig. 4G-H). As novas redes microvasculares funcional que geralmente se desenvolvem a partir de gemas microvasculares e brotos que emanam perpendicularmente do pré-existente em paralelos organizados capilares são de primeira visível entre os dias 3 e 5.
A resposta inflamatória (interação leucócito-endotelial e apoptose)
Isquemia persistente aguda geralmente induz uma resposta inflamatória considerável em animais não tratados, que é representado pela adesão de leucócitos ao endotélio microvascular. Esta resposta inflamatória é caracterizada por laminagem (ou seja, a adesão intermitente de leucócitos ao endotélio vascular) e que adere (ou seja, adesão firme dos leucócitos para o endotélio vascular) leucócitos (Fig. 5A-B). Além disso, um aumento induzido por isquemia das células apoptóticas pode ser visto em todos os animais de controlo com os sinais característicos de condensação nuclear, marginação e fragmentação (Fig. 5C-D). Ambos, a interação leucócito-endotelial e apoptose são sinais para a resposta inflamatória induzida por isquemia e aumentar gradualmente com disfunção microvascular progressiva e diminuição da tensão de oxigênio do tecido (ou seja, (Fig. 5A-D)).
Figura 1. Ilustração do quadro câmara de titânio e todas as suas peças de trabalho. (A) desmontado quadro constituído de duas partes de quadros, três parafusos, porcas, cinco um pedaço de espuma, uma tampa de vidro e um anel piscar de olhos. (B) Ferramentas necessárias para a montagem da estrutura, incluindo um driver porca, um alicate de anel de pressão e um alicate de corte. Uma chave de fenda não é necessária, mas recomenda-se câmaras vai ser usado várias vezes. (C) montado peças de câmara única. Esquerda: O verso do quadro com dois parafusos e porcas anexado na parte inferior dois furos. A parte de trás é usada para suturar a moldura sobre a pele e tem a aba. Direita: Montado parte da frenteo quadro com espuma ligada a garantir a estanqueidade. Note-se que todos os três parafusos buracos são mantidos livres de espuma. Certifique-se de que nenhum dos espuma será prensado em janela de observação, que tem a tampa de vidro. (D) Esquema montado quadro câmara sem dobras cutâneas dorsal.
Figura 2. Ilustração do procedimento aba operatório e sua implementação na câmara de dobras cutâneas titânio dorsal do mouse. (A) Elevated trans-iluminado dobrou prega dorsal do mouse para visualizar arquitetura vascular para delinear a posição da câmara prega dorsal. (B) A parte de trás da armação de titânio da câmara ter sido posicionado e alinhado com os vasos. A incisão de dois furos para parafusos para fixar a parte da frente da armação has foram feitas. (C e D) Delineando do retalho na pele dorsal lateralmente: A proporção largura-comprimento é de 15 mm a 11 mm enquanto centralizadoras os dois navios decorrentes perpendicularmente. A distância 2 milímetros para o lado contralateral (área sem marcação entre esboço ponta fina e borda grossa) serão usados para agarrar a pele com uma pinça para elevar o retalho. Pela observação da pele através da janela traseira da câmara, o tecido adicional tem de ser removido (área tracejada). (E) Cima lateralmente com base aba da pele, demonstrando a arquitetura vascular dispostas aleatoriamente proveniente da base do retalho. A zona a tracejado tenha sido cortado, mas ainda está ligado à aba e é removida no passo seguinte (pendurado pele abaixo da pinça). (F) de montagem no lado de trás da moldura câmara. A superfície da pele é da aba na parte traseira e a superfície "em bruto", sob o lado da janela de vidro. Os parafusos chamber`s está preso through a buracos em ambos os lados da dobra cutânea dorsal incisão. (G) A pele circundante, anteriormente e posteriormente, da aba é fixada nos orifícios do aro câmara superior. (H) A aba de pele é esticada para fora e também suturada para o lado de trás da moldura. Para evitar a desidratação do retalho, solução de cloreto de sódio a 0,9% é pingada sobre a aba repetidamente. (I) O retalho ea pele circundante é completamente fixo nos orifícios do aro câmara superior. O retalho é suturada volta lateralmente na pele dorsal adjacentes para garantir o aperto da câmara. (J) o homólogo de montagem de suporte de espuma da armação, em torno da janela de observação. (K) Completamente montado câmara: A tampa de vidro está ligado às janelas de observação e selado com um anel de pressão. Um terceiro parafuso está ligado à parte superior da armação de aperto adicional. A janela na câmara permite análises repetidas da microvasculature do retalho por microscopia intravital. Para facilitar o acesso durante microscopia os três parafusos são encurtados. (L) do mouse Awake e movendo-se com câmara montada prega cutânea dorsal.
Figura 3. Apresentação do desenvolvimento morfológico e demarcação da necrose nos dias 0 (imediatamente após a preparação aba, A), 1 (B), 3 (C), 5 (D), 7 (E) e 10 (F) . demarcação necrótica final ocorre entre os dias 5 e 7 (D e E). Os controlos mostram uma zona de demarcação distinta dentro da área de aba central, incluindo uma franja vermelha e uma foice branco (ponta de seta dupla e asterisco em E), o que reflecte uma resposta hiperémica e remodelação microvascular, bem como um tecido não-perfundido mas potencialmente viável área delineando necrose desenvolvimento distal (E). No painel F, o retalhoo tecido está dividido em três zonas distintas por duas linhas horizontais: a zona proximal bem perfundida (na base da imagem), a zona central criticamente perfundido (incluindo a franja vermelho a uma "foice lunatica" branco correspondente à penumbra no cérebro isquémico tecido após a lesão acidente vascular cerebral) e da zona distal necrótica (circunferencial marcada pela borda vermelha). Ampliação 16X.
Figura 4. Intravital microscopia de epi-fluorescência exibir imagens de arteriovenular (AV) pacotes (A, B), campos de capilares (C, D, E) e alterações morfológicas, como a remodelação (F) e angiogênese (G, H). A microscopia intravital mostrando o mesmo AV-feixe em um animal de controlo (A, B) no dia 1 (A) e 10 (B). Note-se a ausência de resposta dilatadora nos controlos ao longo de todo o período de observação em ambos arteriolAR (a) e venular (v) de diâmetro. Imagens C, D e E demonstram paralelamente dispostas na zona de capilares perfundidos bem proximal (C), criticamente perfundido zona de transição central (D) e a zona não perfundido necrótica distal (E) da aba de tecido isquémico. Nos ratos criticamente perfundidos zona central de controle só mostram remodelamento vascular (F), caracteriza-se por em paralelos organizados capilares com dilatação e aumento da tortuosidade. Em contraste, os ratos recebendo eritropoietina antes da elevação do retalho como um regime de pré-condicionamento mostram recém-formado e perpendicularmente decorrente capilares, que são claramente distinguíveis dos capilares pré-existentes normais (G, H). Esta resposta angiogénica não foi observado nos controlos. Contraste reforço com dextrano fluorescente 150.000. Ampliação 80X.
Figura 5. </ Strong> microscopia de epi-fluorescência intravital visualizadas AV-feixes na zona proximal bem perfundida aba (A) e a zona central criticamente perfundido transição isquémica do tecido (B). Note-se a presença aumentada de leucócitos aderentes (setas) em vénulas pós-capilares (v) e arteríolas (a) dentro da zona de aba isquêmico (B) quando comparado a zona proximal saudável (A). Contraste com realce Rhodamine. Ampliação 80X. A microscopia de epi-fluorescência intravital visualizadas condensação nuclear indicando a morte apoptótica de células dentro do proximal (C) e criticamente perfundido área aba central (D) dos controlos. Um aumento do número de células apoptóticas (setas brancas) foi observada dentro da zona de transição central, mais isquémica (D) quando comparada com a zona proximal (C). Contraste com realce Bisbenzamida. Ampliação 250X.
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Discussion
A fim de diminuir complicações isquêmicas e, assim, melhorar o resultado clínico, é necessário um conhecimento mais detalhado dos processos fisiopatológicos em tecido aba criticamente perfundido. O desenvolvimento de novos modelos animais que imitam isquemia aguda persistente, por conseguinte, é obrigatória. Consequentemente, fomos capazes de desenvolver um modelo facilmente reprodutível e fiável que permita a avaliação morfológica em tempo real, dinâmica e funcional repetitiva de vários parâmetros do músculo e da vasculatura da pele que podem ser correlacionados com a análise imuno-histoquímica e molecular do tecido aba amostrados.
O procedimento cirúrgico não requer nenhum habilidades cirúrgicas específicas, apesar de prática e alguma destreza manual é necessária. A curva de aprendizado de cerca de 25-30 animais operados normalmente é necessário dominar a montagem da câmara de dobras cutâneas dorsal e preparação aba corretamente. Em mãos experientes, o tempo para as médias de cirurgia 35 minutos. Crucialetapas de preparação aba incluem o posicionamento correto e contorno do retalho no centro da janela da câmara com o posicionamento preciso dos principais navios para ser seccionado (usando trans-iluminação) ea remoção meticulosa da camada gelatinosa acima do panículo carnoso usando uma imagem-ampliação para melhorar a qualidade da imagem.
Desde dimensões do retalho são dadas em milímetros, recomendamos o uso de um paquímetro para aba correta marcação. Se houver algum problema durante o posicionamento dos vasos dominantes dispostos horizontalmente dentro da janela da câmara, um deveria escolher uma mais distal do que uma posição mais proximal dos vasos. O posicionamento correto destes navios que atravessam a janela da câmara, garante transection destes enquanto elevando a aba de distal para proximal e resulta em uma aba perfundido de forma aleatória. Em outras palavras, a incapacidade de transecção estas grandes vasos irá resultar numa perfusão axialpadrão sem necrose do tecido sob a janela. O passo fundamental final durante a preparação cirúrgica refere-se à remoção da camada de tecido areolar gelatinoso. A experiência tem mostrado que os danos excessivos de remoção do panículo carnoso subjacente e assim o delicado dispostas horizontalmente capilares musculares. Ao contrário, remoção de resultados conservadores edema-formação e, eventualmente, a visibilidade limitada das regiões de interesse durante a microscopia. Se todas essas etapas são dominados com cuidado, o retalho muito constantemente desenvolve cerca de 50% de necrose de 10 dias após a elevação do retalho. Isto permite estudar várias estratégias terapêuticas que podem melhorar ou piorar a sobrevivência do tecido aba. Finalmente, o método de microscopia intravital de fluorescência é um procedimento bem estabelecido para avaliar a perfusão microvascular e tecido pode ser aprendido muito rapidamente.
A principal desvantagem deste modelo é o tempo de observação limitado de tecido no interior da câmara217; s janela de aproximadamente 10 a 14 dias a seguir à preparação aba. Isto é devido ao afrouxamento progressivo da pele proximal para a câmara de dobra cutânea dorsal que finalmente resulta na inclinação lateral da câmara. Raramente, a, pele fixo tipo sanduíche puxa para fora do quadro da câmara e torna microscopia impossível. Desde necrose é mais freqüentemente totalmente demarcada entre os dias 5 e 7 após a cirurgia, isso realmente não comprometer a aquisição de dados antes de inclinar da câmara ou puxando para fora da pele dentro da câmara.
Vantagens do modelo incluem fácil reprodutibilidade e a possível utilização de animais geneticamente modificados. O tamanho relativamente pequeno da janela que pode ser avaliado pode no entanto comprometer a importância de traduzir os resultados em condições humanas. Além disso, existem diferenças anatómicas entre animais e seres humanos de pele soltas. Enquanto os animais e ferramentas cirúrgicas têm um custo-eficácia razoável, o hard- e software necessários para realizar microscopia (epi-iluminação microscópio, câmera de alta resolução, corantes fluorescentes e um software especial para análise de dados off-line) representa um investimento maior.
Conclusão:
Nós apresentamos um modelo animal tempo e eficaz em termos de custos em ratos que permite a visualização e quantificação dos parâmetros microcirculatórios na alta resolução. Esta abordagem representa um método ideal para analisar criticamente perfusão tecidual retalho musculocutâneo e os mecanismos celulares subjacentes. As alterações morfológicas das regiões de interesse podem ser repetidamente investigadas e correlacionadas com alterações funcionais em um microvascular e nível celular. Depois de microscopia de epi-fluorescência intravital, o tecido pode ser processado utilizando abordagens moleculares e histológicas.
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Acknowledgments
Agradecemos Katharina Haberland para edição de imagem. Financiamento: O autor sênior recebeu uma KKF Grant da Technische Universität München a criação de um novo laboratório de pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
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