Summary
La finestra della camera di murino plica dorsale presentato visualizza una zona di ischemia acuta persistente di un lembo muscolocutaneo. Intravitale epi-fluorescenza permette di microscopia per la valutazione diretta e ripetitiva del microcircolo e la quantificazione di emodinamica. Morfologiche e risultati emodinamici possono ulteriormente essere correlati con le analisi istologiche e molecolari.
Abstract
Nonostante la profonda esperienza e le tecniche chirurgiche avanzate, complicazioni ischemia indotta che vanno dalla rottura della ferita alla vasta necrosi dei tessuti sono ancora in corso, in particolare in chirurgia ricostruttiva lembo. Più modelli con patta sperimentali sono stati sviluppati per analizzare le cause ei meccanismi alla base e di indagare le strategie di trattamento per prevenire le complicanze ischemiche. Il fattore limitante della maggior parte dei modelli è la possibilità privo di visualizzare direttamente e ripetutamente architettura microvascolare e l'emodinamica. L'obiettivo del protocollo è stato quello di presentare un modello di topo consolidata affiliazione questi elementi mancanti prima menzionati. Harder et al. Hanno sviluppato un modello di un lembo muscolocutaneo con un pattern di perfusione casuale che subisce ischemia persistente acuta e provoca ~ 50% di necrosi dopo 10 giorni se conservato non trattato. Con l'aiuto di intravitale microscopia a fluorescenza, questo modello da camera permette la visualizzazione ripetitiva dimorfologia e l'emodinamica in diverse regioni di interesse nel corso del tempo. Processi associati, quali l'apoptosi, infiammazione, perdite microvascolare e l'angiogenesi possono essere studiati e correlati alle analisi di proteine immunoistochimica e molecolare. Fino ad oggi, il modello ha dimostrato la fattibilità e la riproducibilità in diversi studi sperimentali pubblicati che indagano l'effetto di pre-, peri- e postcondizionamento del tessuto ischemically sfidato.
Introduction
Copertura del materiale esposto tendini, osso e impianto nella chirurgia ricostruttiva si basa sull'utilizzo di lembi. Un lembo è un blocco di tessuto che viene trasferito sul suo peduncolo vascolare che garantisce l'afflusso arterioso e deflusso venoso. Nonostante competenze ampio e la disponibilità di una varietà di lembi da trasferire, complicazioni ischemia indotta vanno dalla ripartizione ferita alla perdita totale del tessuto sono ancora incontrati. Considerando che il trattamento conservativo e la guarigione per seconda intenzione si può aspettare dopo la necrosi dei tessuti minore, significativa necrosi lembo di solito richiede una revisione chirurgica, tra cui debridement, condizionata della ferita e la ricostruzione secondaria. Questo aumenta la morbilità, prolunga degenza e di conseguenza porta ad un aumento dei costi di assistenza sanitaria.
Flaps con un pattern indefinito di vasi o aree perfusi a caso nella zona distale più lontano dal flusso arterioso sono particolarmente inclini a danno ischemico. Acco rdingly, numerosi studi sperimentali e clinici hanno valutato lo sviluppo di necrosi in entrambi, lembi modello assiale (apporto di sangue definito) e lembi di pattern casuale (apporto di sangue non definita) 1-3. I risultati principali sono comunemente basati sulla valutazione macroscopica della dimensione dell'area necrotica. Per valutare le cause ei meccanismi di necrosi tissutale più in dettaglio, numerosi studi focalizzati sull'analisi del microcircolo. Diverse tecniche sono state usate per misurare la perfusione dei tessuti, compresa l'analisi della tensione di ossigeno tissutale utilizzando elettrodi polarografiche 4-5, nonché la misurazione del flusso sanguigno mediante laser Doppler flussimetria 6-7, tintura diffusione 8, e microsfere 9-10. Queste tecniche, tuttavia, consentono solo per misurare parametri indiretti di perfusione tissutale e non consentono alcuna analisi morfologica dei processi microhemodynamic all'interno di una singola area di interesse di un lembo.
t "> Sandison si caratterizza per essere il primo che ha utilizzato una camera trasparente per prolungato in vivo, che aveva svolto in conigli 11 Nel 1943 -. circa 20 anni dopo - Algire fu il primo ad adattare una camera così trasparente applicabile nei topi per studiare il comportamento di micro-impianti di cellule tumorali 12. A causa del fatto che i topi sono i cosiddetti animali pelle libera e dopo alcuni parametri tecnici negli anni successivi, Lehr e collaboratori sono stati in grado di adattare tale dorsale camera plica sviluppare una camera di titanio più piccolo e leggero. Questa camera di abilitare valutazione mediante microscopia a fluorescenza intravitale, una tecnica che permette la visualizzazione diretta e ripetitivo di una serie di caratteristiche morfologiche e microcircolo e loro evoluzione nel tempo in diverse condizioni fisiologiche e fisiopatologiche, tale come danno da ischemia-riperfusione 13.Nell'inchiesta di perfusion di pelle, muscoli e ossa lembi in condizioni normali e patologiche due tendenze si è verificato: In primo luogo, i modelli a ribalta "acuti" che non utilizzano la camera plica dorsale come il padiglione auricolare peduncolato nel topo 14, il lembo cutaneo isola basato lateralmente nel criceto 15 e il lembo composito peduncolato nel ratto 16. In secondo luogo, il modello flap "cronica", in cui la combinazione di un lembo con una plica dorsale camera permessi microcircolo ripetitivo analisi per diversi giorni con microscopia a fluorescenza intravitale. È costituito da un lembo muscolocutaneo perfuso casuale che è integrato nella camera plica del mouse 17. Il rapporto tra larghezza e lunghezza è stato scelto che una situazione di ischemia persistente acuta si traduce costantemente in ~ 50% necrosi del tessuto lembo 10 a 14 giorni dopo il sollevamento del lembo. Questa misura riproducibile di necrosi tissutale permette un'ulteriore valutazione di entrambi, protezione (cioè, lo sviluppo di less necrosi) e fattori negativi (ad esempio, sviluppo di più di necrosi) sulla fisiopatologia patta. Negli ultimi anni, diverse pubblicazioni sperimentali che dimostrano l'effetto di diversi pre-, peri- e le procedure post-condizionamento, compresa la somministrazione di sostanze di tessuto-protezione 18-24 e l'applicazione locale di fattori di stress fisiologici come il calore 25 e 26 onde d'urto, sono emerse.
Le analisi quantitative di necrosi, microvascolare morfologia e parametri microcircolatori possono inoltre essere correlate ad analisi immunoistochimica e saggi di proteine. Diverse proteine e molecole, tra cui il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), ossido nitrico sintasi (NOS), fattore nucleare kappa B (NF-kB) e le proteine da shock termico (HSP-32: eme-ossigenasi 1 (HO-1) e HSP- 70) hanno dimostrato di giocare un ruolo nella protezione dei tessuti. Sulla base di questo modello lembo camera, due modifiche sono state sviluppate in order per analizzare la neovascolarizzazione e la microcircolazione della pelle durante il trapianto di guarigione 27 e gli sviluppi angiogenici in un lembo peduncolato con motivo assiale perfusione 28. Vi presentiamo un modello riproducibile e affidabile che include un lembo muscolocutaneo ischemically contestato nella camera del mouse plica. Questo modello permette la visualizzazione e la quantificazione del microcircolo e l'emodinamica da intravitale microscopia a fluorescenza.
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Protocol
NOTA: Prima di implementazione del modello presentato, le leggi di protezione degli animali corrispondente devono essere consultati e il permesso deve essere ottenuto dalle autorità locali. In questo lavoro, tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i principi guida per la ricerca sugli animali e la normativa tedesca in materia di protezione degli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dal comitato cura degli animali locale.
1. Preparazione degli animali e chirurgica Elevazione della Flap
- Tenere animali in gabbie a temperatura ambiente di 22-24 ° C e ad una umidità relativa del 60-65% con un 12-hr ciclo giorno e notte. Consenti topi libero accesso all'acqua potabile e chow standard di laboratorio. Mantenere sempre condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico la sopravvivenza.
- Anestetizzare il mouse intraperitoneale (ip) iniezione di 0,1 ml di soluzione salina per 10 g di peso corporeo, contenente 90 mg / kg di peso corporeo ketamina cloridrato e 25 mg /kg di peso corporeo dihydroxylidinothiazine cloridrato. L'anestesia è necessaria per la preparazione degli animali, chirurgia e successiva microscopia. Verificare che l'anestesia controllando la risposta ad uno stimolo doloroso. Durante il tempo di anestesia, si applicano veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Dopo l'induzione dell'anestesia sufficienti, depilare la parte posteriore con un rasoio elettrico. Di seguito, applicare la crema depilazione alla zona rasata per rimuovere i capelli rimanenti.
- Durante il tempo di permanenza della crema depilazione di ~ 7-10 minuti, preparare gli strumenti, comprese le pinze della pelle e micro pinze, forbici e micro forbici, materiale di sutura e un pennarello. Disinfettare e preparare la camera di titanio applicando le due viti con dado alla base della camera e fissando autoadesiva in schiuma (Fig. 1 AC) attorno alla finestra della controparte della camera di garantire la tenuta del sistema camerale.
- Rimuovere tutti i crema depilazione dal retro mediante lavaggiocon acqua tiepida. Quindi asciugare e disinfettare la pelle con una soluzione contenente alcol.
- Posizionare il mouse in posizione prona e definire la linea mediana della schiena. Afferrare la pelle a livello centrale e sollevarlo per creare una piega (Fig. 2A). Con trans-illuminazione utilizzando qualsiasi tipo di sorgente luminosa, decidere dove posizionare provisorily il telaio in titanio (Fig. 2B). Accertarsi che i rami distali dell'arteria toracica laterale (LTA) cranialmente e la profonda arteria circonflessa iliaca (DCIA) caudalmente corso attraverso il centro della finestra della camera (Fig. 2B-D). Dopo il posizionamento della camera è fatto, forare entrambi gli strati della pelle nella parte inferiore della piega per la successiva fissaggio del telaio in titanio. Ora rimuovere il telaio in titanio, posizionare il mouse in posizione prona e ridefinire la linea mediana della schiena, se necessario.
- Outline l'aletta perpendicolarmente alla colonna vertebrale a partire dalla linea mediana con un rapporto tra larghezza e lunghezza di 15 x 11mm ad producono un lembo laterale based e perfuso in modo casuale. Poi delineare un'area cutanea ulteriore 2 mm estendono al lato controlaterale (Fig. 2C, D). Questa zona è scelto con la pinza e poi suturato al telaio in titanio senza interferire con la zona lembo visibile.
- Dopo la marcatura finale, incidere il lembo. In tal modo, la transezione sia LTA e DCIA ed elevare il lembo (Fig. 2E). Non è necessario per la coagulazione o legatura dei vasi sezionati.
- Posizionare la vite della camera attraverso le perforazioni della pelle fatte in precedenza (Fig. 2F) e fissare la plica sia anteriormente e posteriormente nel telaio della camera del elevati lembo alla parte posteriore del telaio utilizzando i fori del telaio della Camera e un 5-0 punti staccati (Fig. 2G).
- Suturare gli arti verticali del lembo alla pelle circostante per mezzo di 5-0 punti staccati (
- Accise un'area emi-circolare laterale pelle per la piccola striscia di pelle di 2 mm, cioè, sull'altro lato del lembo di osservare vascolare del lembo. Questo permette visione diretta attraverso la finestra di osservazione della camera che ha una superficie di 90 mm 2.
- Rimuovere il tessuto areolare sciolto la gelatina-come dal muscolo striato con strumenti di microchirurgia e lente di ingrandimento ottico e microscopio al fine di migliorare la qualità dell'immagine durante la microscopia. Cercate di non danneggiare i vasi all'interno degli strati di tessuto muscolare.
- Infine, sigillare la camera montando la controparte del telaio che è stato in precedenza rivestiti di strisce auto-aderente di schiuma anteriormente, posteriormente e cranialmente, irrorare il deflettore con Bisbenzimide attualità e soluzione salina (Fig. 2J). Successivamente, applicare la finestra di osservazione con un vetro di copertura con un anello elastico. Cercate di non intrappolare eventuali bolle d'aria sotto il vetro (Fig. 2K, L). La pelle si atterrà al vetro di copertura da parte delle forze di adesione.
2. intravitale epifluorescenza Microscopia
- Attendere 24 ore dopo la preparazione chirurgica per la prima analisi microscopica per qualità ottica ideale. Questa analisi rappresenta la linea di base di microscopia e si ripete a giorno 3, 5, 7 e 10 dopo l'intervento chirurgico. Ogni volta, anestetizzare il mouse come descritto al punto 1.2. Posto l'animale in posizione decubito laterale su un supporto di plexiglas su misura. In questo modo, gli strati dei tessuti muscolari del lembo adesione al vetro di copertura si trovano ad affrontare verso l'alto.
- Iniettare 0,05 ml di 5% di fluorescenza destrano verde (peso molecolare 150.000) e 0,05 ml di 1% molto colorante fluorescente famiglia rodamina in una vena della coda o il plesso venoso retro-bulbare. Il destrano fluorescente verde macchia i componenti non cellulari del sangue, se applicati per via endovenosa (iv). La fluorescenza Rhodamine macchie leucociti e piastrine che possono essere distinguished da altri componenti cellulari e non cellulari. Infine, Bisbenzimide macchie componenti nucleari che emettono più o meno di fluorescenza in funzione dello stato di condensa.
- Successivamente, posizionare il mouse sotto il microscopio. Assicurarsi che il microscopio include un sistema a LED - combinazioni di fasci LED per 470 e 425 nm, 365 nm e 490, e 540 e 580 nm, nonché i corrispondenti set di filtri (62 HE BFP / GFP / HcRed, compreso tra 1: 350-390 nm di eccitazione lunghezza d'onda, diviso 395 nm / 402-448 nm; Campo 2: 460-488 nm, diviso 495 nm / 500-557 nm; Campo 3: 567-602 nm, 610 nm divisa / 615 nm a infinito 20 Rodamina, gamma. : 540-552 nm, diviso 560 nm, emissione 575-640 nm).
- Registrare le immagini fisse e in movimento-immagini utilizzando una videocamera dispositivo ad accoppiamento di carica e salvarli su un disco rigido del computer per l'analisi ulteriore off-line.
- Utilizzare diversi obiettivi (2.5X, NA (apertura numerica) = 0,06 per le viste panoramiche della camera, 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) per le registrazioni delle regioni di interesse.
- Praticamente, dividere la superficie lembo che è visibile attraverso la finestra della camera in tre aree di uguale altezza, cioè, una prossimale, centrale, e una zona distale più lontana dal flusso vascolare (Fig. 3F). Per l'acquisizione delle immagini, procedere come segue ad ogni tempo di osservazione:
- Acquisire l'immagine del tessuto di immagine all'interno della finestra della camera da prossimale a distale con l'obiettivo 5X.
- In ogni zona del lembo, selezionare arteriole secondo o terzo ordine e le loro venule di accompagnamento con i modelli di ramificazione facilmente identificabili. Utilizzando l'obiettivo 5X, 10X, 20X o, effettuare le stampe dei fasci arteriolovenular per facilmente ri-localizzare i bundle per tutto il periodo di osservazione.
- Con l'obiettivo 20X e l'obiettivo 50X, altri record di 5-6 campi capillari e "apoptotico"campi per area del lembo rispettivamente. Tutte le immagini registrate con il 10X e 20X obiettivi utilizzano la luce blu (destrano fluorescente) e la luce verde (rodamina) del filtro, mentre le immagini registrate con la 5X e 50X uso oggettiva luce blu (destrano fluorescente) e luce bianca (Bisbenzimide) del filtro, rispettivamente, .
3. Analisi dei dati registrati
NOTA: Con l'uso di un sistema di analisi di immagine computerizzato quantificare tutti i parametri registrati off-line come segue 29.
- Misurazione della superficie non perfuso, il tessuto necrotico rispettivamente (mm 2).
- Utilizzare l'immagine completa della camera scansionata finestra registrata con l'obiettivo 5X (da 2.6.1) e il destrano fluorescente per misurare il tessuto non perfuso rispettivamente necrotico. Utilizzare la funzione "AreaBo" per misurare l'area non perfuso scuro: Bordo della zona non perfuso e calcolare l'area in mm 2 utilizzando algoritmi di misura Area del software.
- Misurazione del diametro microvascolare in arteriole, capillari e venule (micron).
- Carica video o immagini da AV-fasci o campi capillari nel software registrati. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare le immagini fisse o video con il massimo ingrandimento in cui i confini precisi del vaso sono chiaramente visibili.
- Utilizzare la funzione "DiamPe" del software per assicurarsi che le misurazioni vengono effettuate perpendicolarmente alla parete del vaso. Per farlo contrassegnare due punti sulla parete della nave e con il terzo contrassegno click il diametro perpendicolare della nave. Il software eseguirà la misura in micron.
- Ripetere le misurazioni sulle stesse navi per tutte le registrazioni nello stesso luogo. Misura più capillari di accumulare diametro medio.
- Analisi dei globuli rossi (RBC) di velocità in arteriole, capillari unand venule (mm / sec).
- Per le cellule del sangue (globuli rossi) Velocità rosso arteriolare (mm / s) misurazioni utilizzare la funzione "VeloLSD" del software e scegliere lo stesso navi nella finestra destrano fluorescente per cui sono stati misurati i diametri.
- Analizzare con il sistema di analisi di immagine computerizzato con il metodo di spostamento, che si trova sulla base della misura dello spostamento (mm) di un individuo intravascolare Reticolo livello di grigio nel tempo (sec).
- Misurazione del flusso volumetrico sangue nei vasi (pl / sec).
- Calcolare volumetrica del flusso sanguigno (pl / sec) in arteriole, venule e capillari di velocità e vaso sezione trasversale RBC (π * r 2) secondo l'equazione di Gross e Aroesty, cioè, Q = V * π * r 2 , assumendo una forma recipiente cilindrico 30.
- Misurazione del funzionale densità capillare dei capillari RBC-perfusi (perfusione nutritivo: cm / cm
- Caricare un campo capillare fluorescente registrato con 20X di ingrandimento obiettivo nel software. Utilizzare la funzione "DensLA" su misura funzionale densità capillare dei microvasi RBC-perfusi.
- Tracciare i capillari perfusi con il cursore e segnare i vasi perfusi. Non contrassegnare non perfuso capillari, arteriole e venule. Il software misurerà funzionale densità capillare dei capillari perfusi in cm / cm 2. Ripetere la procedura per gli altri campi capillari registrati.
- Carica video registrati o telai di campi capillari fluorescenti nel software. Identificare le navi piegato e utilizzare la funzione "TorqIx" del software. Tracciare il flusso vaso definitivo con il corso e terminare con un clic destro. Il software saràdisegnare una linea retta per il modo diretto e fisserà in relazione con la strada tracciata.
NOTA: Attenzione ai segni di angiogenesi, come gemme, germogli e capillari di nuova formazione, che di solito emanano perpendicolarmente dai capillari preesistenti. Misurare la densità di questi vasi neoformati come descritto al punto 3.5.
- Caricare video Bisbenzimide-registrati (obiettivo 50X) nel software. Utilizzare la funzione "DenseNA". Contrassegnare cellule apoptotiche secondo le caratteristiche menzionate come condensazione nucleare, frammentazione e margination con un clic sinistro.
- Dopo aver segnato tutte le cellule caratteristici di tutto il video, fare clic su "N / A" nel software, che conterà automaticamente tutte le cellule marcate e dividerlo in tutta l'area. Il risultato sarà apoptoticocellule / mm 2.
- Analizzare la risposta infiammatoria contando il numero di rodamina leucociti aderenti al rivestimento endoteliale delle venule post-capillari per un periodo di tempo di ≥30 sec ("adesivi") ei leucociti intermittenza aderenti etichettati (<30 sec, "rulli") . Venulare leucociti aderenza è espressa in cellule per mm 2 di superficie endoteliale.
- Valutare macromolecolare leakage come parametro di permeabilità microvascolare dopo un'iniezione endovenosa di un destrano fluorescente. Densitometricamente determinare diversi livelli di grigio nel tessuto direttamente adiacente alla parete del vaso capillare (E1), nonché nel plasma privo di cellule marginali della nave (E2). Quindi calcolare stravaso macromolecolare (E) come rapporto di E1 / E2 31.
4. Cura postoperatoria
- Rispedire l'animale in una gabbia separata per evitare la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Monitorare gli animali ogni giorno di sanguinamento, locale e segni sistemici di infezione e la posizione della camera.
- Valutare lo stato generale dell'animale osservando l'attività motoria, il peso corporeo, segni di dolore, la tolleranza per la medicazione e auto-mutilazioni.
- Tenere il mouse uno per gabbia per evitare MutuAl manipolazione della camera. In qualsiasi segno di dolore, applicare Buprenorfina alla dose di 0,05-0,1 mg / kg di peso corporeo, per via sottocutanea in 8 intervalli hr.
5. L'eutanasia e Espianto della Camera Skinfold
- Al giorno 10, sacrificare animali con una dose eccessiva di un farmaco anestetico (150 mg / kg di pentobarbital).
- Rimuovere la camera e gustare il tessuto lembo per analisi di proteine immunoistochimici e molecolari. Tessuti di esempio per l'istologia convenzionale (formalina) e saggi proteici quantificabili (azoto liquido o ghiaccio secco).
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Representative Results
Necrosi
L'endpoint principale di questo modello - necrosi tissutale conseguente sollevamento del lembo (cioè, l'induzione di ischemia acuta persistente) - viene ripetutamente misurata ed illustrato macroscopicamente come mostrato in Figura 3 per un periodo di 10 giorni. Delimitazione finale del lembo necrosi avviene di solito tra 5 e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico ed è caratterizzato da una frangia rossa, cioè, la zona di vasodilatazione e rimodellamento microvascolare, sviluppando tra prossimale vitale e la zona necrotica distale del lembo (Fig. 3D-F ). Topi di controllo non trattati di solito si sviluppano una zona necrotica di circa il 50% dopo 10 giorni che può essere suddiviso in tre zone distinte: la prossimali ben perfuso, la zona centrale intercalato e criticamente perfuso e la zona distale necrotica (Fig 3F.). Precedenti studi del nostro gruppo, come accennato in premessa, hanno dimostrato di protezione eFFETTI dopo differenti procedure di precondizionamento, caratterizzati da uno spostamento della zona critica perfuso dalla zona centrale verso la zona distale del lembo.
Parametri nave
Diametri microvascolari e globuli rossi (RBC) -velocity di arteriole e venule di vari diametri e dei capillari vicini sono misurati e il conseguente flusso di sangue volumetrico viene calcolato off-line. In questo modo la correlazione cambiamenti sia morfologici e funzionali dei microvasi distinti dal giorno 1 al giorno 10 (Fig. 4A-B). Inoltre, la densità funzionale dei capillari perfusi RBC, il parametro per perfusione nutritiva del tessuto, viene analizzato. I capillari sono normalmente orientati in parallelo e presente con diametro compreso tra 3-5 micron in condizioni fisiologiche (Fig. 4C). Il flusso di sangue, densità capillare funzionale ed eventualmente tensione di ossigeno del TISSue diminuire gradualmente da prossimale a distale di raggiungere una soglia "di viabilità" (Fig. 4C-E), in cui i capillari non sono perfusi più (Fig. 4E).
Rimodellamento microvascolare e l'angiogenesi
Rimodellamento con dilatazione e aumento della tortuosità dei microvasi può essere osservato in tutti i gruppi sperimentali in fase di preparazione del lembo (vale a dire, l'induzione di ischemia persistente acuta: Fig. 4F). Tuttavia, in questo modello, solo lo stimolo ischemico non è sufficiente per indurre angiogenesi come ad esempio visto in una varietà di esperimenti precondizionamento con l'ormone eritropoietina (Fig. 4G-H). Le nuove reti microvascolari funzionale che di solito si sviluppano da gemme microvascolari e germogli provenienti perpendicolarmente dal pre-esistenti in parallelo capillari sono disposti prima visibili tra il giorno 3 e 5.
Risposta infiammatoria (interazione e apoptosi leucociti-endotelio)
Ischemia acuta persistente solito induce una risposta infiammatoria notevole in animali non trattati che è rappresentato aderendo leucociti all'endotelio microvascolare. Questa risposta infiammatoria è caratterizzato da laminazione (cioè, adesione intermittente dei leucociti all'endotelio vascolare) e attaccare (cioè, ferma adesione dei leucociti all'endotelio vascolare) leucociti (Fig. 5A-B). Inoltre, un aumento ischemia indotta di cellule apoptotiche può essere visto in tutti gli animali di controllo con i segni caratteristici di condensazione nucleare, frammentazione e emarginazione (Fig. 5C-D). Entrambi, l'interazione e l'apoptosi dei leucociti-endotelio sono le indicazioni per la risposta infiammatoria indotta da ischemia e aumentare gradualmente a disfunzione microvascolare e una diminuzione progressiva tensione di ossigeno del tessuto (ad esempio (Fig. 5A-D)).
Figura 1. Illustrazione del telaio camera di titanio e tutti i suoi pezzi. (A) Telaio smontato costituito da due componenti del telaio, tre viti, cinque dadi, un pezzo di schiuma, un vetro di copertura ed un anello elastico. (B) gli strumenti necessari per assemblare il telaio compreso un driver dado esagonale, una pinza anello elastico e un tronchese. Un cacciavite non è obbligatorio ma consigliato se verranno utilizzati stanze più volte. (C) assemblato Pezzi singoli da camera. A sinistra: Lato posteriore del telaio con due viti e dadi in allegato in basso due fori. Il retro viene usato per suturare la cornice sulla pelle e porta il lembo. Destra: Assemblato lato anterioreil telaio con schiuma attaccato per garantire la tenuta. Si noti che tutti e tre i fori per le viti siano libere di schiuma. Assicurarsi che nessuno della schiuma viene premuto nella finestra di osservazione, che porta il vetro di copertura. (D) Schema assemblato telaio camera senza plica cutanea dorsale.
Figura 2. Illustrazione della procedura lembo operativa e la sua attuazione in titanio dorsale camera di plica del mouse. (A) Elevati trans-illuminato raddoppiato plica dorsale del mouse per visualizzare l'architettura vascolare per delineare la posizione della camera plica dorsale. (B) La parte posteriore della struttura di titanio della camera è stato posizionato e allineato con i vasi. L'incisione di due fori per viti per fissare il lato anteriore del telaio ettaris stato fatto. (C e D) Delineando del lembo sulla pelle dorsale lateralmente: Il rapporto tra larghezza e lunghezza è di 15 mm a 11 mm e centralizzando le due navi perpendicolarmente derivanti. A distanza di 2 mm a lato controlaterale (zona non marcato tra il sottile lembo di contorno e bordo più spesso) verrà utilizzato per afferrare la pelle con una pinza per sollevare il lembo. Per l'osservazione della pelle retro attraverso la finestra della camera, tessuto supplementare deve essere rimosso (area tratteggiata). (E) Veduta lateralmente riferiscono lembo cutaneo, dimostrando l'architettura vascolare disposti casualmente proveniente dalla base del lembo. L'area tratteggiata è stato tagliato fuori, ma è ancora attaccato al lembo ed è rimosso nella fase successiva (appeso pelle sotto le pinze). (F) Montaggio del lato posteriore del telaio della camera. La superficie cutanea del lembo è sulla parte e la superficie "grezza" sotto il lato della finestra di vetro. Le viti chamber`s sono bloccati through i fori su entrambi i lati della plica dorsale inciso. (G) La pelle circostante, anteriormente e posteriormente, del lembo è fissato nei fori del cerchione camera superiore. (H) Il lembo cutaneo viene stesa ed anche suturato al lato posteriore del telaio. Per evitare la disidratazione del lembo, soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% si fa gocciolare il lembo più volte. (I) Il lembo e la pelle circostante è completamente fissato nei fori del cerchio camera superiore. Il lembo viene suturato lateralmente nella pelle dorsale adiacente a garantire la tenuta della camera. (J) Montaggio controparte espanso portante del telaio, che circonda la finestra di osservazione. (K) completamente montato da camera: un vetro di copertura è fissato per le finestre di osservazione e sigillato con un anello elastico. Una terza vite è attaccata alla parte superiore del telaio per la tenuta supplementare. La finestra della camera permette analisi ripetute del microvasculature del lembo mediante microscopia intravitale. Per un accesso più facile durante la microscopia le tre viti si accorciano. (L) del mouse sveglio e si muove con montato camera di plica cutanea dorsale.
Figura 3. Presentazione dello sviluppo morfologico e la delimitazione della necrosi del lembo a giorni 0 (immediatamente dopo la preparazione lembo, A), 1 (B), 3 (C), 5 (D), 7 (E) e 10 (F) . Finale di demarcazione necrotico si svolge tra i giorni 5 e 7 (D e E). Controlli mostrano una zona distinta di demarcazione all'interno dell'area lembo centrale, compresa una frangia rossa e una falce bianca (doppia freccia e asterisco in E), riflettendo una risposta iperemica e rimodellamento microvascolare e un tessuto non perfuso ma potenzialmente realizzabile zona delineando Necrosi sviluppo distale (E). Nel pannello di F, il lemboil tessuto è diviso in tre zone distinte dalle 2 linee orizzontali: la zona prossimale ben perfuso (alla base dell'immagine), la zona centrale criticamente perfuso (compresa la frangia rossa un il "falce Lunatica" bianco corrispondente a penombra nel cervello ischemico tessuto dopo l'infortunio ictus) e la zona distale necrotica (circonferenza segnata da bordo rosso). Ingrandimento 16X.
Figura 4. intravitale microscopia a fluorescenza la visualizzazione di immagini di arteriovenular (AV) fasci (A, B), campi capillari (C, D, E) e le alterazioni morfologiche, come il rimodellamento (F) e l'angiogenesi (G, H). Microscopia intravitale mostra la stessa AV-fascio in un controllo degli animali (A, B) al giorno 1 (A) e 10 (B). Si noti l'assenza di risposta dilatoria nei controlli per l'intero periodo di osservazione sia arteriolar (a) e venulare (v) di diametro. Immagini C, D ed E dimostrano parallelamente disposti capillari nella zona ben perfuso prossimale (C), criticamente perfusi zona di transizione centrale (D) e la zona non perfusi necrotica distale (E) del tessuto ischemico lembo. Nella zona centrale di topi di controllo critico perfusi Mostra solo rimodellamento vascolare (F), caratterizzata da capillari in parallelo organizzato con dilatazione e aumento della tortuosità. Al contrario, i topi trattati con eritropoietina prima di sollevare il lembo come un regime di precondizionamento mostrano di recente formazione e perpendicolarmente derivanti capillari, che sono chiaramente distinguibili dalle normali capillari preesistenti (G, H). Questa risposta angiogenica non è stata osservata nei controlli. Contrasto miglioramento con destrano fluorescente 150.000. Ingrandimento 80X.
Figura 5. </ Strong> intravitale microscopia a fluorescenza visualizzazione di AV-bundle nella zona ben perfuso prossimale sportello (A) e la zona di transizione ischemica centrale criticamente perfusione del tessuto (B). Si noti la maggiore presenza di aderire leucociti (frecce) in venule postcapillari (v) e arteriole (a) all'interno della zona lembo ischemico (B) rispetto alla zona prossimale sano (A). Contrasto miglioramento con rodamina. Ingrandimento 80X. Intravitale microscopia a fluorescenza visualizzazione condensazione nucleare indica la morte apoptotica delle cellule all'interno del prossimale (C) e l'area lembo centrale criticamente perfuso (D) dei controlli. Un aumento del numero di cellule apoptotiche (frecce bianche) si osserva nella zona centrale più ischemico transitorio (D) rispetto alla zona prossimale (C). Contrasto miglioramento con Bisbenzimide. Ingrandimento 250X.
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Discussion
Per ridurre le complicanze ischemiche e quindi migliorare l'esito clinico, è necessaria una conoscenza più dettagliata dei processi fisiopatologici in tessuto lembo critico perfusi. Lo sviluppo di nuovi modelli animali che imitano l'ischemia persistente acuta è quindi obbligatoria. Di conseguenza, siamo stati in grado di sviluppare un modello facilmente riproducibile e affidabile che consente per la valutazione ripetitive in tempo reale morfologica, dinamica e funzionale dei vari parametri di muscoli e vascolarizzazione della pelle che possono essere correlati con analisi immunoistochimica e molecolare del tessuto lembo campionato.
La procedura chirurgica non richiede alcuna abilità chirurgiche specifiche, anche se è necessaria la pratica e un po 'di abilità manuale. Una curva di apprendimento di circa 25-30 animali operati è di solito necessario per padroneggiare il montaggio della camera di plica dorsale e la preparazione lembo correttamente. In mani esperte, il tempo per le medie di chirurgia 35 minuti. Crucialefasi di preparazione lembo includono il posizionamento corretto e contorno del lembo al centro della finestra della camera con il posizionamento esatto delle principali navi da transected (utilizzando trans-illuminazione) e la rimozione meticolosa dello strato di gelatina-come sopra la carnosus pannicolo utilizzando immagini ingrandimento per migliorare la qualità dell'immagine.
Dal momento che le dimensioni lembo sono espresse in millimetri, si consiglia di utilizzare un calibro scorrevole per la marcatura corretta lembo. Se ci sono difficoltà nel posizionamento dei vasi dominanti disposti orizzontalmente all'interno della finestra della camera, si dovrebbe piuttosto scegliere una più distale di una posizione più prossimale dei vasi. Il corretto posizionamento di questi vasi che trasversali finestra della camera, garantisce recisione di questi mentre elevando il lembo da distale a prossimale e si traduce in un lembo perfuso in modo casuale. In altre parole, la mancata transetti questi grandi navi implica un perfusione assialeReticolo senza necrosi del tessuto sotto la finestra. Il passo cruciale finale durante la preparazione chirurgica riguarda la rimozione dello strato di tessuto areolare gelatina simile. L'esperienza ha dimostrato che i danni eccessivi rimozione del carnosus pannicolo soggiacente e così il delicato in orizzontale disposti capillari muscolari. Al contrario, i risultati di rimozione dei conservatori edema formazione e la visibilità limitata alla fine delle regioni di interesse durante la microscopia. Se tutti questi passaggi sono masterizzati con cura, il lembo si sviluppa molto costantemente circa il 50% di necrosi 10 giorni dopo sollevamento del lembo. In questo modo lo studio diverse strategie terapeutiche che possono migliorare o peggiorare la sopravvivenza del tessuto lembo. Infine, il metodo di microscopia a fluorescenza intravitale è una procedura consolidata per valutare la perfusione tissutale microvascolari e può essere appreso molto rapidamente.
Il principale inconveniente di questo modello è il tempo di osservazione limitato del tessuto all'interno della camera217; s finestra di circa 10 a 14 giorni dopo la preparazione del lembo. Ciò è dovuto al progressivo allentamento della pelle prossimale alla camera plica dorsale che alla fine si traduce in inclinazione laterale della camera. Raramente, la pelle fisso sandwich tira fuori della cornice della camera e rende impossibile la microscopia. Poiché la necrosi è più spesso completamente delimitata tra il giorno 5 e 7 dopo l'intervento chirurgico, questo in realtà non compromette acquisizione dati prima inclinazione della camera o tirando fuori della pelle all'interno della camera.
Vantaggi del modello includono facile riproducibilità e l'uso potenziale di animali geneticamente modificati. La relativamente piccola dimensione della finestra che può essere valutata potrebbe tuttavia compromettere il significato nel tradurre i risultati in condizioni umane. In aggiunta, ci sono differenze anatomiche tra animali ed esseri umani dalla pelle sciolti. Mentre gli animali e gli strumenti chirurgici hanno un ragionevole rapporto costi-benefici, l'harD- e software necessari per eseguire microscopio (microscopio epi-illuminazione, fotocamera ad alta risoluzione, coloranti fluorescenti e un software speciale per l'analisi dei dati off-line), rappresenta un investimento più grande.
Conclusione:
Vi presentiamo un tempo e di costo-efficacia modello animale nei topi che permette la visualizzazione e la quantificazione dei parametri microcircolo ad alta risoluzione. Questo approccio rappresenta un metodo ideale per analizzare criticamente perfusione tissutale lembo muscolocutaneo e dei meccanismi cellulari alla base. I cambiamenti morfologici delle regioni di interesse possono essere ripetutamente studiati e correlati con i cambiamenti funzionali su un microvascolare e livello cellulare. Dopo intravitale microscopia a fluorescenza, il tessuto può essere ulteriormente trattati con istologico e approcci molecolari.
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Acknowledgments
Ringraziamo Katharina Haberland per l'editing di immagini. Finanziamento: L'anziano autore ha ricevuto una sovvenzione KKF dalla Technische Universität München di istituire un nuovo laboratorio di ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
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