Summary
Het raam van de muizen dorsale huidplooi kamer gepresenteerd visualiseert een zone van acute aanhoudende ischemie van een musculocutane flap. Intravitale epi-fluorescentie microscopie vergunningen voor directe en repetitieve evaluatie van de microvasculatuur en kwantificering van hemodynamiek. Morfologische en hemodynamische resultaten kunnen verder worden gecorreleerd met histologische en moleculaire analyses.
Abstract
Ondanks diepgaande expertise en geavanceerde chirurgische technieken, zijn ischemie geïnduceerde complicaties, variërend van wond afbraak tot uitgebreide weefselnecrose nog steeds voorkomende, met name in de reconstructieve flap chirurgie. Meerdere experimentele flap modellen ontwikkeld onderliggende oorzaken en mechanismen te analyseren en therapeutische strategieën onderzocht om ischemische complicaties te voorkomen. De beperkende factor van de meeste modellen is de ontbrekende mogelijkheid om direct en herhaaldelijk visualiseren microvasculaire architectuur en hemodynamiek. Het doel van het protocol is om een gevestigde muismodel affiliating deze eerder genoemde ontbreken elementen te presenteren. Harder et al. Hebben een model van een musculocutane flap ontwikkeld met een willekeurig patroon dat perfusie acute aanhoudende ischemie en resulteert in ~ 50% necrose ondergaat na 10 dagen als onbehandeld bleef. Met behulp van intravitale epi-fluorescentie microscopie, deze kamer model maakt repetitieve visualisatie vanmorfologie en hemodynamiek in verschillende regio's van belang zijn in de tijd. Bijbehorende processen zoals apoptose, ontsteking, microvasculaire lekkage en angiogenese kunnen onderzocht en gecorreleerd aan immunohistochemische en moleculaire eiwit assays. Tot op heden heeft het model haalbaarheid en reproduceerbaarheid bewezen in verschillende gepubliceerde experimentele studies naar het effect van pre-, peri- en postconditioning van ischemisch uitgedaagd weefsel.
Introduction
Dekking van blootgestelde pees, bot en implantaat materiaal reconstructieve chirurgie berust op het gebruik van flappen. Een flap is een stukje weefsel dat wordt overgebracht op haar vaatsteel dat arteriële instroom en veneuze uitstroom garandeert. Ondanks brede ervaring en de beschikbaarheid van een verscheidenheid van kleppen te dragen, worden ischemie geïnduceerde complicaties variërend van wond afbraak aan totale weefselverlies blijven optreden. Overwegende dat een conservatieve behandeling en genezing door secundaire intentie kan worden verwacht na kleine weefselnecrose, significant flap necrose meestal vereist chirurgische revisie, inclusief debridement, wond conditioning en secundaire reconstructie. Dit verhoogt de morbiditeit, verlengt verblijf in het ziekenhuis en dus leidt tot toegenomen kosten voor gezondheidszorg.
Kleppen met een ongedefinieerde patroon van bloedvaten of willekeurig geperfundeerd gebieden in de distale zone verst van de arteriële instroom zijn bijzonder gevoelig voor ischemische schade. Acco rdingly, hebben talrijke experimentele en klinische studies voor de ontwikkeling van necrose in beide geëvalueerd, axiale patroon flappen (gedefinieerd bloedtoevoer) en willekeurig patroon flappen (undefined bloedtoevoer) 1-3. De belangrijkste resultaten zijn gewoonlijk gebaseerd op macroscopische beoordeling van de omvang van het necrotische gebied. Om de oorzaken en mechanismen van weefselnecrose beoordelen meer in detail verscheidene studies gericht op de analyse van de microcirculatie. Verschillende technieken zijn gebruikt om weefsel perfusie meten, inclusief de analyse van weefsel zuurstofspanning middels polarografische elektroden 4-5, en het meten van de bloedstroom met laser Doppler flowmetry 6-7, kleurstofdiffusie 8 en microsferen 9-10. Deze technieken echter alleen mogelijk voor het meten indirecte parameters van weefselperfusie en geen morfologische analyse van de microhemodynamic processen binnen een bepaald gedeelte van belang van een klep niet mogelijk.
t "> Sandison bekend de eerste die een transparante kamer heeft gedurende langere in vivo studies, waaruit hij bij konijnen 11 zijn in 1943 -. ongeveer 20 jaar later - Algire als eerste dergelijke transparante kamer aangepast toepasbaar zijn in muizen om het gedrag van micro-implantaten van tumorcellen 12 bestuderen. Vanwege het feit dat muizen zogenaamde losse huid dieren na enige technische verfijningen in de volgende jaren Lehr en medewerkers konden zich dergelijke een dorsale huidplooi kamer ontwikkelt een kleinere en lichtere titanium kamer. Deze kamer staat beoordelingsproces met intravitale fluorescentiemicroscopie, een techniek die directe en repetitieve visualisatie van een aantal parameters en functies microcirculatie en de veranderingen in de tijd in verschillende fysiologische en pathofysiologische omstandigheden toelaat, zoals ischemie-reperfusieschade 13.In het onderzoek van perfusion van huid, spieren en botten flappen onder normale en pathologische omstandigheden twee trends voorgedaan: Ten eerste, de "acute" flap modellen die niet de dorsale huidplooi kamer hoeft te gebruiken, zoals de gesteelde oor flap in de muis 14, de zijdelings gebaseerd eiland huidflap in de hamster 15 en de pedicled samengestelde klep in de rat 16. Tweede, de "chronische" flap model waarbij de combinatie van een flap met een dorsale huidplooi kamer toelaat repetitieve microcirculatie analyses over meerdere dagen met intravitale fluorescentiemicroscopie. Het bestaat uit een willekeurig geperfundeerde musculocutane klep die is geïntegreerd in de huidplooi kamer van de muis 17. De breedte-lengte verhouding gekozen dat een situatie van acute aanhoudende ischemie steeds resulteert in ~ 50% flap weefselnecrose 10 tot 14 dagen na flap hoogte. Dit reproduceerbare omvang van weefselnecrose maakt verdere evaluatie van beide, beschermend (dat wil zeggen, de ontwikkeling van de less necrose) en schadelijke factoren (dat wil zeggen, de ontwikkeling van meer necrose) op de flap pathofysiologie. Gedurende de laatste jaren hebben verschillende experimentele studies waarin het effect van verschillende pre-, peri- en post-conditioning procedures, met inbegrip van het beheer van weefsel-beschermende stoffen 18-24 en de lokale toepassing van fysiologische stressoren zoals warmte 25 en schokgolven 26, naar voren zijn gekomen.
De kwantitatieve analyse van necrose, microvasculaire morfologie en microcirculatie parameters kunnen verder worden gecorreleerd aan immunohistochemische analyses en eiwit assays. Verschillende eiwitten en moleculen omvattende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), stikstofoxide synthase (NOS), nucleaire factor kappa B (NF-kB) en heat shock eiwitten (HSP-32: heem oxygenase-1 (HO-1) en HSP- 70) bleken een rol in weefselbescherming spelen. Op basis van deze kamer flap model, zijn twee wijzigingen zijn in Orde ontwikkeldr om neovascularisatie en de microcirculatie te analyseren tijdens huidtransplantatie genezing 27 en angiogene ontwikkelingen in een gesteelde flap met axiale patroon perfusie 28. We presenteren een reproduceerbare en betrouwbare model dat een ischemisch uitgedaagd musculocutane flap in de muis huidplooi kamer bevinden. Dit model maakt visualisatie en kwantificatie van de microcirculatie en hemodynamiek door intravitale epi-fluorescentie microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Voorafgaand aan de uitvoering van het gepresenteerde model, moet de corresponderende dierenbescherming wetten worden geraadpleegd en toestemming moet worden verkregen van de lokale autoriteiten. In dit werk, werden alle experimenten uitgevoerd in overeenstemming met de uitgangspunten voor het onderzoek met dieren en de Duitse wetgeving inzake de bescherming van dieren. De experimenten werden goedgekeurd door de lokale dierlijke zorg commissie.
1. Dierlijke Voorbereiding en Chirurgische Verhoging van de Flap
- Houd dieren één kooien bij kamertemperatuur van 22-24 ° C en een relatieve vochtigheid van 60-65% met een 12-uur dag en nacht cyclus. Laat muizen vrije toegang tot drinkwater en standaard laboratorium chow. Altijd onderhouden steriele omstandigheden tijdens survival chirurgie.
- Verdoven de muis door intraperitoneale (ip) injectie van 0,1 ml zoutoplossing per 10 g lichaamsgewicht bevattende 90 mg / kg lichaamsgewicht ketamine hydrochloride en 25 mg /kg lg dihydroxylidinothiazine hydrochloride. Anesthesie is noodzakelijk voor dierlijke voorbereiding, chirurgie en daaropvolgende microscopie. Bevestig de juiste verdoving door het controleren van de reactie op een pijnprikkel. Ten tijde van anesthesie toepassing dierenarts zalf op de ogen tot droog voorkomen.
- Na inductie van voldoende anesthesie, ontharen van de rug met een elektrisch scheerapparaat. Hierna gelden ontharing crème om het geschoren gebied om de resterende haren te verwijderen.
- Tijdens de verblijftijd van de ontharing crème van ~ 7-10 min, bereiden instrumenten, met inbegrip van de huid tang en micro tang, schaar en micro schaar, hechtmateriaal en een markeerstift. Ontsmet en bereiden de titanium kamer door het toepassen van de twee schroeven met de moer aan de basis van de kamer en door de vaststelling van zelfklevende foam (Fig. 1 AC) rond het raam van tegenhanger van de kamer om de dichtheid van de kamer systeem garanderen.
- Verwijder alle ontharing crème van de rug door te wassenhet af met lauw water. Dan droog en ontsmet de huid met een alcohol bevattende oplossing.
- Plaats de muis in buikligging en definiëren de middellijn van de rug. Pak de huid centraal en til hem op om een vouw (Fig. 2A) te creëren. Door trans-verlichting met behulp van enige vorm van lichtbron, beslissen waar provisorisch plaats het titanium frame (Fig. 2B). Zorg ervoor dat de distale takken van de laterale thoracale slagader (LTA) craniaal en de diepe circumflex bekkenslagader (DCIA) caudaal loop door het centrum van het venster van de kamer's (Fig. 2B-D). Zodra de positie van de kamer wordt uitgevoerd, perforeren beide lagen van de huid op de bodem van de vouw voor latere bevestiging van het titanium frame. Verwijder nu de titanium frame, plaatst u de muis in buikligging en herdefiniëren de middellijn van het lot indien nodig.
- Schets de flap loodrecht op de wervelkolom vanaf de middellijn met een breedte-lengte verhouding van 15 x 11 mm resulteren in een lateraal gebaseerde en willekeurig geperfuseerd flap. Schets is een aanvullende huidgebied van 2 mm uitstrekt tot de contralaterale zijde (fig. 2C, D). Dit gebied wordt geplukt met de tang en later gehecht aan de titaniumkader zonder interferentie met de flap zichtbare gebied.
- Na de definitieve markering, incisie de flap. Daarbij doorsnijden zowel de LTA en DCIA en verhogen de klep (Fig. 2E). Er is geen noodzaak voor coagulatie of ligatie van de doorgesneden vaten.
- Plaats de schroef van de kamer door middel van de eerder gemaakte huid perforaties (Fig. 2F) en fixeer de huidplooi zowel anterieur en posterieur in het frame van de verhoogde flap van de kamer aan de achterzijde een deel van het frame met behulp van de gaten in het frame van de kamer en een 5-0 onderbroken hechtingen (fig. 2G).
- Hecht de verticale benen van de klep terug naar de omliggende huid door middel van 5-0 onderbroken hechtingen (
- Accijnzen een hemi-cirkelvormige huidoppervlak lateraal van de kleine huid strook 2 mm, dat is op de andere zijde van de flap aan de vasculatuur flap observeren. Hierdoor is een directe uitzicht door het kijkvenster van de kamer, dat een oppervlak van 90 mm 2 heeft.
- Haal de gelatine-achtige losse areolar weefsel uit de gestreepte spieren met behulp van microchirurgische instrumenten en optische vergrootglas of microscoop om de beeldkwaliteit tijdens microscopie verbeteren. Probeer niet om schepen binnen het spierweefsel lagen beschadigen.
- Tenslotte sluit de kamer door het monteren van de tegenhanger van het frame dat eerder is begiftigd met zelfklevende stroken van schuim voren, craniaal en posterieur, bedew de flap met actuele bisbenzimide en zoutoplossing (Fig. 2J). Daarna gelden de kijkvenster met een dekking van glas met behulp van een borgring. Probeer geen lucht blaren vangen onder het glas (afb. 2K, L). De huid zal zich houden aan de dekking van glas door adhesiekrachten.
2. Intravitale epifluorescentiemicroscopie
- Wacht 24 uur na operatieve voorbereiding van de eerste microscopische analyse voor de ideale optische kwaliteit. Deze analyse geeft de basislijn van microscopie en herhaald op dag 3, 5, 7 en 10 na de operatie. Telkens verdoven de muis beschreven in stap 1.2. Plaats het dier in een laterale decubital positie op een op maat gemaakte plexiglas carrier. Die manier, het spierweefsel lagen van de flap die vastzit aan de dekking van glas worden geconfronteerd met up-afdelingen.
- Injecteer 0,05 ml van 5% groene fluorescentie dextran (moleculair gewicht 150.000) en 0,05 ml 1% zeer fluorescerende Rhodamine familie kleurstof in een staart ader of de retro-bulbaire veneuze plexus. De groene fluorescerende dextran kleurt de niet-cellulaire bestanddelen van het bloed bij intraveneuze toepassing (iv). De fluorescerende vlekken Rhodamine leukocyten en bloedplaatjes die dist kan wordeninguished van andere cellulaire en niet-cellulaire componenten. Tenslotte bisbenzimide vlekken nucleaire componenten die min of meer fluorescentie uitzenden volgens de stand van condensatie.
- Plaats vervolgens de muis onder de microscoop. Zorgen de microscoop omvat een LED-systeem - lichtstraal combinaties 470 en 425 nm, 365 nm en 490 en 540 en 580 nm en het bijbehorende filter sets (62 HE BFP / GFP / HcRed, bereik 1: 350-390 nm excitatie golflengte, gesplitst 395 nm / 402-448 nm; gamma 2: 460-488 nm, gesplitst 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, gesplitst 610 nm / 615 nm tot oneindig 20 Rhodamine, range. : 540-552 nm, gesplitst 560 nm, emissie 575-640 nm).
- Noteer de stills en bewegende-beelden met behulp van een charge-coupled device videocamera en deze opslaan op een computer harde schijf voor verdere off-line analyse.
- Gebruik verschillende doelstellingen (2.5x, NA (numerieke opening) = 0,06 voor het panorama uitzicht op de kamer; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) voor de opnames van de regio's van belang.
- Vrijwel, verdeel de flap oppervlak dat zichtbaar is door het venster van de kamer is in drie gebieden van gelijke hoogte, dat wil zeggen, een proximale, een centrale, en een distale gebied het verst van de vasculaire instroom (Fig. 3F) is. Voor het verwerven, gaat op de volgende manier bij iedere waarneming tijdstip:
- Scan de weefsel afbeelding door afbeelding binnen het venster van de kamer's van proximale naar distaal met de 5X doelstelling.
- In elk gebied van de flap, selecteert tweede- of derde-orde arteriolen en hun begeleidende venulen met gemakkelijk herkenbare vertakking patronen. Met behulp van de 5X, 10X of 20X objectief, maakt afdrukken van de arteriolovenular bundels om op eenvoudige wijze opnieuw lokaliseren de bundels in de hele observatieperiode.
- Met de 20X objectief en de 50X objectief, verder staat 5-6 capillaire velden en "apoptotische"Gebieden per oppervlakte van de klep respectievelijk. Alle beelden die zijn opgenomen met de 10X en 20X doelstellingen gebruiken het blauwe licht (fluorescerende dextran) en groen licht filter respectievelijk (Rhodamine), terwijl beelden die zijn opgenomen met de 5x en 50x objectief gebruik blauw licht (fluorescerende dextran) en wit licht (bisbenzimide) filter, .
3. Analyse van de geregistreerde gegevens
OPMERKING: Bij het gebruik van een computer-ondersteunde beeldanalyse te kwantificeren alle opgenomen parameters off-line als volgt 29.
- Meting van het gebied van de niet-doorbloede, respectievelijk necrose (mm 2).
- Gebruik de volledige afbeelding gescand kamer raam opgenomen met de 5X doelstelling (van 2.6.1) en de fluorescerende dextran aan niet-doorbloede respectievelijk necrotisch weefsel te meten. Gebruik "AreaBo" functie om de niet-doorbloede donkere gebied te meten: de grens van de niet-doorbloede gebied en bereken de oppervlakte in mm 2 met behulp van Area meting algoritmes van de software.
- Meting van microvasculaire diameter arteriolen, capillairen en venulen (pm).
- Load video of foto's van de opgenomen AV-bundels of het capillaire velden in de software. Voor het beste resultaat gebruik maken van de foto's of video's met de hoogste vergroting, waar de definitieve grenzen van het schip zijn duidelijk zichtbaar.
- Gebruik de functie van de software "DiamPe" om ervoor te zorgen dat de metingen worden uitgevoerd loodrecht op de muur van het schip. Om dit te doen markeren twee punten op de muur van het schip en met de derde klik mark de loodrechte diameter van het vat. De software zal de meting uit te voeren in micrometer.
- Herhaal de metingen aan dezelfde vaartuigen alle opnamen op dezelfde plaats. Meten meerdere capillairen gemiddelde diameter accumuleren.
- Analyse van de rode bloedcellen (RBC) snelheid in arteriolen, capillairen van eennd venulen (mm / sec).
- Voor arteriolaire rode bloedcellen (RBC) snelheid (mm / s) metingen gebruiken de "VeloLSD" functie van de software en dezelfde schepen in de fluorescerende dextran venster waarvan de diameters werden gemeten kiezen.
- Analyseren met de computergestuurde beeldanalyse met behulp van de lijn shift methode, die op grond van de meting van de verschuiving (mm) van een individuele intravasculaire grijswaardepatroon tijd (sec).
- Meting van de volumetrische bloedstroming in vaten (pl / sec).
- Bereken volumetrische bloedstroming (pl / sec) in arteriolen, capillairen en venulen van RBC snelheid en verblijf dwarsdoorsnede (π * r 2) volgens de vergelijking van Gross en Aroesty, dat is, Q = V * π * r 2 , uitgaande van een cilindrisch vat vorm 30.
- Meting van functionele capillaire dichtheid van RBC-geperfundeerde capillairen (voedings perfusie: cm / cm
- Plaats een opgenomen fluorescerende capillaire veld met 20X objectiefvergroting in de software. Gebruik de functie "DensLA" om functionele capillaire dichtheid van RBC-geperfuseerde microvessels meten.
- Trace het geperfuseerde haarvaten met de cursor en de doorbloede vaten markeren. Niet markeren niet-doorbloede haarvaten, kleine slagaders of venulen. De software zal functionele capillaire dichtheid van de perfusie haarvaten in cm / cm 2 te meten. Herhaal de stappen voor de andere opgenomen capillaire velden.
- Opgenomen lading video's of frames van fluorescerende capillaire velden in de software. Gyrose schepen te identificeren en de functie van de software "TorqIx". Teken de definitieve vaartuig stroom met de cursus en eindigen met een klik met de rechtermuisknop. De software zaleen rechte lijn voor de directe manier en zal het gesteld in verband met de getraceerd pad.
OPMERKING: let op tekenen van angiogenese, zoals knoppen, spruiten en nieuw gevormde haarvaten, die meestal afkomstig zijn loodrecht uit de reeds bestaande haarvaten. Meet de dichtheid van deze nieuw gevormde vaten zoals beschreven in stap 3.5.
- Laad bisbenzimide-opgenomen video (50X objectief) in de software. Gebruik de functie "DenseNA". Markeer apoptotische cellen volgens de genoemde kenmerken zoals nucleaire condensatie, fragmentatie en marginatie een linker muisknop.
- Na het markeren van alle karakteristieke cellen in de hele video, klik op "N / A" in de software, die automatisch telt alle gemarkeerde cellen en verdeel het in het hele gebied. Het resultaat zal zijn apoptotischecellen / mm2.
- Analyseer de ontstekingsreactie door het tellen van het aantal Rhodamine gelabelde leukocyten die hechten aan de endotheliale bekleding van de post-capillaire venulen gedurende een periode van ≥30 sec ("stickers") en de tussenpozen hechtende leukocyten (<30 sec, "rollen") . Venulaire leukocyt hechting wordt uitgedrukt als cellen per mm2 endotheliale oppervlak.
- Beoordelen macromoleculaire leakage als parameter van microvasculaire permeabiliteit na intraveneuze injectie van een fluorescerende dextran. Densitometrisch bepalen meerdere grijsniveaus in het weefsel direct naast de capillaire vaatwand (E1), alsook in de marginale celvrije plasma van het vat (E2). Bereken vervolgens macromoleculaire extravasatie (E) als de verhouding van E1 / E2 31.
4. postoperatieve zorg
- Terugkeer van het dier in een aparte kooi om het gezelschap van andere dieren te vermijden totdat volledig hersteld. Laat een dier niet zonder toezicht laten totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging behouden. Monitor dieren dagelijks voor bloeden, lokale en systemische tekenen van infectie en de positie van de kamer.
- Evalueer de algemene toestand van het dier door het observeren motorische activiteit, lichaamsgewicht, symptomen van pijn tolerantie voor de dressing en zelfverminking.
- Houd de muizen een per kooi om Mutu te vermijdenal manipulatie van de kamer. Bij enig teken van pijn toepassen buprenorfine in een dosis van 0,05-0,1 mg / kg lichaamsgewicht, subcutaan in 8 uur intervallen.
5. Euthanasie en Explantatie van de huidplooien Kamer
- Op dag 10, offeren dieren met een overdosis van een anestheticum (150 mg / kg pentobarbital).
- Verwijder de kamer en proeven van de flap weefsel voor immunohistochemische en moleculaire eiwit assays. Monster weefsels voor conventionele histologie (formaline) en kwantificeerbare eiwit assays (vloeibare stikstof of droogijs).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Necrose
Het belangrijkste eindpunt van dit model - weefselnecrose na flap elevatie (dwz inductie van acute aanhoudende ischemie) - herhaaldelijk gemeten en macroscopisch weergegeven zoals getoond in figuur 3 over een periode van 10 dagen. Definitieve afbakening van flap necrose komt meestal tussen dag 5 en 7 na de operatie en wordt gekenmerkt door een rode rand, dat wil zeggen zone van vaatverwijding en microvasculaire remodellering, ontstaan tussen de proximale en de distale vitale necrotische zone van de klep (Fig. 3D-F ). Onbehandelde controle muizen ontwikkelen zich gewoonlijk een necrotische gebied van ongeveer 50% na 10 dagen kunnen worden verdeeld in drie verschillende gebieden: het goed doorbloede proximale, de geïntercaleerde en kritisch geperfundeerde centrale gebied en de necrotische distale gebied (figuur 3F.). Eerdere studies van onze groep, zoals vermeld in de inleiding, is gebleken beschermende effects na conditionering verschillende procedures, die worden gekenmerkt door een verschuiving van het kritisch geperfundeerde gebied van de centrale zone naar de distale zone van de flap.
Vaartuig parameters
Microvasculaire diameters en rode bloedcel (RBC) -velocity van arteriolen en venulen van verschillende diameters en van aangrenzende capillairen gemeten en de resulterende volumetrische bloedstroming wordt berekend off-line. Hierdoor kunnen correleren zowel morfologische en functionele veranderingen van verschillende haarvaten van dag 1 tot dag 10 (Fig. 4A-B). Bovendien, de functionele dichtheid van de RBC-geperfundeerde capillairen, de parameter voor voedingszouten perfusie van het weefsel geanalyseerd. De haarvaten zijn meestal georiënteerd in-parallel en heden met een diameter tussen 3-5 micrometer onder fysiologische omstandigheden (Fig. 4C). Doorbloeding, functionele capillaire dichtheid en uiteindelijk zuurstofspanning van de tissUe geleidelijk af van proximaal naar distaal een drempel "levensvatbaar" bereikt (fig. 4C-E), waarbij de capillairen niet perfusie meer (fig. 4E).
Microvasculaire remodeling en angiogenese
Remodeling met dilatatie en verhoogde tortuositeit van de microvaatjes kan worden waargenomen in alle experimentele groepen ondergingen bereiding flap (dwz inductie van acute ischemie persistent: fig. 4F). In dit model, de ischemische stimulus alleen niet voldoende om angiogenese te induceren, zoals bijvoorbeeld gezien in een verscheidenheid van preconditionering experimenten met het hormoon erytropoëtine (fig. 4G-H). De nieuwe functionele microvasculaire netwerken die meestal ontwikkelen van microvasculaire knoppen en spruiten loodrecht afkomstig van de reeds bestaande in-parallel gerangschikt haarvaten zijn eerst zichtbaar tussen dag 3 en 5.
Ontstekingsreactie (leukocyt-endotheel interactie en apoptose)
Acute aanhoudende ischemie veroorzaakt gewoonlijk een aanzienlijke ontstekingsreactie in onbehandelde dieren die wordt vertegenwoordigd door hechtende leukocyten naar de microvasculaire endotheel. Deze ontstekingsreactie wordt gekenmerkt door glooiende (dwz intermitterende adhesie van leukocyten aan het vasculaire endotheel) en plakken (bijvoorbeeld, stevige adhesie van leukocyten aan het vasculaire endotheel) leukocyten (Fig. 5A-B). Bovendien kan een ischemie geïnduceerde toename van apoptotische cellen waargenomen bij alle controledieren met de karakteristieke symptomen van nucleaire condensatie, fragmentatie en marginatie (fig. 5C-D). Beide, leukocyten-endotheliale interactie en apoptose zijn tekenen voor de ischemie geïnduceerde ontstekingsreactie en geleidelijk te verhogen met progressieve microvasculaire dysfunctie en verminderde zuurstofspanning van het weefsel (dwz (Fig. 5A-D)).
Figuur 1. Illustratie van het titanium kamer frame en al haar werkstukken. (A) Gedemonteerde kader, bestaande uit twee framedelen, drie schroeven, vijf noten, een stuk schuim, een cover glas en een borgring. (B) Benodigd gereedschap aan het frame met een hex moersleutel, een borgring tang en een kniptang monteren. Een schroevendraaier is niet vereist maar aanbevolen als kamers meerdere malen worden gebruikt. (C) gemonteerd enkele kamer delen. Links: Achterkant van het frame met twee schroeven en de bijgevoegde moeren op de onderste twee gaten. De achterzijde wordt gebruikt om het frame op de huid hechtdraad en draagt de flap. Rechts: Gemonteerd voorkant vanhet frame met aangehechte schuim om de dichtheid te garanderen. Merk op dat alle drie schroefgaten vrij van schuim worden gehouden. Zorg ervoor dat geen van de schuim in het kijkvenster, dat de dekking van glas draagt zal worden gedrukt. (D) Schematische gemonteerd kamer montuur zonder dorsale huidplooien.
Figuur 2. Afbeelding van de operatieve flap procedure en de uitvoering ervan in de titanium dorsale huidplooi kamer van de muis. (A) Verhoogde trans-verlichte verdubbeld dorsale huidplooi van de muis om vasculaire architectuur te visualiseren voor een overzicht van de stand van de dorsale huidplooi kamer. (B) De achterkant van titanium frame van de kamer's is gepositioneerd en uitgelijnd op de schepen. De incisie van twee gaten voor schroeven om de voorzijde van het frame ha bevestigens aangebracht. (C en D) schetsen van de flap op de dorsale huid lateraal: De breedte-lengte verhouding is 15 mm tot 11 mm en centraliseren de twee loodrecht ontstaan schepen. Een 2 mm afstand tot de contralaterale zijde (alleen tussen dunne flap omtrek en vetgedrukte rand) worden gebruikt om de huid met een tang te grijpen op de flap verheffen. Voor de observatie van de achterzijde huid door de kamer raam aanvullende weefsel moet worden verwijderd (gearceerde gebied). (E) Verhoogde zijdelings gebaseerd huidflap, waaruit de willekeurig gerangschikt vasculaire architectuur afkomstig van de basis van de flap. Het gearceerde gebied is verwijderd, maar is nog op de klep en wordt verwijderd in de volgende stap (opknoping huid onder de tang). (F) Montage van de achterzijde van de kamer frame. Het huidoppervlak van de klep aan de achterkant en de "ruwe" oppervlak onder het raam kant. De chamber`s schroeven worden thr geplaktdoorgedreven de ingesneden gaten aan beide zijden van de dorsale huidplooi. (G) De omliggende huid, naar voren en naar achteren, van de flap is bevestigd in de gaten van de bovenste kamer velg. (H) De huid flap is uitgestrekt en ook gehecht aan de achterzijde van het frame. Om uitdroging van de klep te voorkomen, is 0,9% natriumchlorideoplossing gedruppeld op de flap herhaald. (I) De klep en de omringende huid volledig vastgesteld in de gaten van de bovenste kamer velg. De flap wordt gehecht weer zijdelings in de aangrenzende dorsale huid in beklemming op de kamer te garanderen. (J) Montage-schuim dragende tegenhanger van het frame rond het kijkvenster. (K) Volledig gemonteerd kamer: Een dekglas wordt de waarneming ramen bevestigd en afgedicht met een borgring. Een derde schroef is bevestigd aan de bovenkant van het frame voor extra krapte bevestigd. Het raam in de kamer laat herhaalde analyses van de microvasculature van de flap door opklaren. Voor een gemakkelijkere toegang tijdens microscopie de drie schroeven worden verkort. (L) Awake en bewegende muis met gemonteerde dorsale huidplooien kamer.
Figuur 3. Presentatie van de morfologische ontwikkeling en afbakening van de flap necrose op dag 0 (onmiddellijk na bereiding flap, A), 1 (B), 3 (C), 5 (D), 7 (E) en 10 (F) . Final necrotische afbakening plaatsvindt tussen dag 5 en 7 (D en E). Controles tonen een duidelijke zone van afbakening binnen het centrale flap gebied, waaronder een rode rand en een witte falx (dubbele pijlpunt en asterisk in E), als gevolg van een hyperemic respons en microvasculaire remodeling, evenals een niet-doorbloed maar potentieel levensvatbare gebied afbakenen weefsel necrose ontwikkelen distaal (E). In panel F, de flapweefsel verdeeld in domeinen van 2 horizontale lijnen: een schacht geperfundeerde proximale zone (aan de basis van het beeld), het kritisch geperfundeerde centrale zone (inclusief de rode rand een witte "falx lunatica" overeenkomt met de penumbra in ischemische hersenen weefsel na een beroerte blessure) en de necrotische distale zone (de omtrek gemarkeerd met rode rand). Vergroting 16X.
Figuur 4. Intravitale epi-fluorescentie microscopie tonen afbeeldingen arteriovenular (AV) bundels (A, B), capillaire velden (C, D, E) en morfologische veranderingen zoals remodeling (F) en angiogenese (G, H). Intravitale microscopie toont hetzelfde AV-bundel in een controledier (A, B) op dag 1 (A) en 10 (B). Let op de afwezigheid van traag respons bij de controle over de gehele waarnemingsperiode in beide arteriolar (a) en venulaire (v) diameter. Afbeeldingen C, D en E demonstreren evenwijdig aangebracht capillairen in de put geperfundeerde proximale zone (C), kritisch geperfundeerd centrale overgangszone (D) en de niet-geperfundeerde necrotische distale zone (E) van de flap ischemisch weefsel. In het kritisch geperfundeerde centrale zone controlemuizen alleen weergegeven vasculaire remodellering (F), gekenmerkt door in parallel capillairen met dilatatie en verhoogde tortuositeit. In contrast, muizen erytropoëtine ontvangen voordat flap hoogte als een conditionering regime tonen nieuw gevormde en loodrecht voortvloeiende haarvaten, die duidelijk te onderscheiden is van normale reeds bestaande haarvaten (G, H) zijn. Deze angiogene respons is niet waargenomen in de controlegroep. Contrast enhancement met fluorescerende dextran 150.000. Vergroting 80X.
Figuur 5. </ Strong> Intravitale epi-fluorescentie microscopie weergave AV-bundels in de goed doorbloede proximale flap zone (A) en de kritische geperfundeerde ischemische centrale overgangszone van het weefsel (B). Let op de verhoogde aanwezigheid van hechtende leukocyten (pijlen) in postcapillaire venulen (v) en arteriolen (a) in het ischemische flap zone (B) ten opzichte van de gezonde proximale zone (A). Contrast enhancement met Rhodamine. Vergroting 80X. Intravitaal epi-fluorescentie microscopie weergave kerncondensatie aangeeft apoptotische celdood in het proximale (C) en kritische geperfuseerd centrale flap gebied (D) van de controles. Een verhoogd aantal apoptotische cellen (witte pijlen) wordt waargenomen in de ischemische meer centrale overgangszone (D) in vergelijking met de proximale zone (C). Contrast enhancement met bisbenzimide. Vergroting 250X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om ischemische complicaties te verlagen en zo het verbeteren van de klinische uitkomst, is meer gedetailleerde kennis van pathofysiologische processen in kritisch geperfuseerde flap weefsel nodig. De ontwikkeling van nieuwe diermodellen dat acute persisterende ischemie na te bootsen is daarom verplicht. Daarom konden we een gemakkelijk reproduceerbaar en betrouwbaar model waardoor herhaalde morfologische, functionele en dynamische real-time evaluatie van de verschillende parameters van spier en huid vasculatuur die kunnen worden gecorreleerd met immunohistochemische en moleculaire analyse van het bemonsterde weefsel flap ontwikkelen.
De chirurgische procedure geen specifieke chirurgische vaardigheden vereist, hoewel praktijkvoorbeelden en een handigheid nodig. Een leercurve van ongeveer 25-30 geopereerde dieren is meestal nodig om de montage van de dorsale huidplooi kamer en flap voorbereiding goed te beheersen. In ervaren handen, tijd voor een operatie gemiddeld 35 minuten. Crucialestappen flap preparaat omvatten de correcte plaatsing en omtrek van de flap in het midden van het venster van de kamer met nauwkeurige positionering van de belangrijkste vaartuigen worden doorsneden (met trans-belichting) en de zorgvuldige verwijdering van het gelatine-achtige laag boven de panniculus carnosus met behulp van image-vergroting om de beeldkwaliteit te verbeteren.
Sinds flap afmetingen in millimeters, raden wij het gebruik van een schuifmaat voor de juiste flap markering. Als er sprake is van problemen bij het positioneren van de horizontaal geplaatste dominante schepen binnen het venster van de kamer is, moet men eerder kiezen voor een meer distale dan een meer proximale positie van de schepen. De juiste positionering van deze schepen dat raam de kamer's dwars, garandeert doorsnijding van deze, terwijl het verhogen van de flap van distale naar proximale en resulteert in een willekeurig doorbloed flap. Met andere woorden, het niet doornemen deze grote bloedvaten resulteert in een axiale perfusiepatroon zonder necrose van het weefsel onder het raam. De laatste cruciale stap tijdens chirurgische voorbereiding betreft de verwijdering van de gelatine-achtige areolar weefsel laag. De ervaring leert dat overdreven verwijdering schade toebrengt aan het eronder liggende panniculus carnosus en dus de delicate horizontaal geplaatste gespierde haarvaten. Omgekeerd, conservatieve verwijderen resulteert in oedeem-vorming en uiteindelijk beperkt de zichtbaarheid van de regio's van de rente tijdens de microscopie. Als al deze stappen zijn knie met zorg, de flap zeer constant ontwikkelt ongeveer 50% necrose 10 dagen na de flap hoogte. Dit maakt het bestuderen van verschillende therapeutische strategieën die kunnen verbeteren of verslechteren overleving van de flap weefsel. Tenslotte, de wijze van intravitale fluorescentiemicroscopie is een gevestigde procedure om microvasculaire weefselperfusie evalueren en kan zeer snel worden geleerd.
Het grote nadeel van dit model is de beperkte observatietijd van het weefsel in de kamer217; s raam van ongeveer 10 tot 14 dagen na bereiding flap. Dit komt door de geleidelijke versoepeling van de huid proximaal van de dorsale huidplooi kamer die uiteindelijk resulteert in zijwaarts kantelen van de kamer. Zelden, de sandwich-achtige, vaste huid trekt zich terug uit het frame van de kamer en maakt microscopie onmogelijk. Aangezien necrose wordt meestal volledig afgebakend tussen dag 5 en 7 na de operatie, is dit niet echt een compromis data-acquisitie voor het kantelen van de kamer of het uittrekken van de huid in de kamer.
Voordelen van het model omvatten eenvoudige reproduceerbaarheid en het mogelijke gebruik van genetisch gemodificeerde dieren. De relatief kleine omvang van het venster dat kan worden beoordeeld zou echter afbreuk doen aan de betekenis in het vertalen van de resultaten naar de mens. Daarnaast zijn er anatomische verschillen tussen losse huid dieren en mensen. Terwijl de dieren en chirurgische instrumenten hebben een redelijke kosteneffectiviteit, de hard- en software die nodig zijn om microscopie (epi-verlichting microscoop, met een hoge resolutie camera, fluorescente kleurstoffen en speciale software voor off-line data-analyse) vertegenwoordigt een grotere investering uit te voeren.
Conclusie:
We presenteren een tijd en kosteneffectief diermodel in muizen die visualisatie en kwantificatie van microcirculatie parameters worden bij hoge resolutie. Deze aanpak vormt een ideale methode om kritisch geperfuseerde musculocutane flap weefsel en de onderliggende cellulaire mechanismen te analyseren. Morfologische veranderingen van gebieden van belang kan herhaaldelijk worden onderzocht en gecorreleerd met functionele veranderingen op microvasculaire en celniveau. Na intravitale epi-fluorescentie microscopie, kan het weefsel verder worden verwerkt met behulp van histologische en moleculaire benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Katharina Haberland voor beeldbewerking. Financiering: De senior auteur ontving een KKF Grant van de Technische Universität München voor het opzetten van een nieuw onderzoekslaboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
