Summary
Окно мышиного спинной кожной складки камеры, представленной визуализирует зону острого упорной ишемии мышечного лоскута. Прижизненные разрешения микроскопии эпи-флуоресценции для прямого и повторяющихся оценки микрососудов и количественной оценки гемодинамики. Морфологические и гемодинамики результаты также могут быть связаны с гистологических и молекулярных анализов.
Abstract
Несмотря глубокой экспертизы и передовых хирургических методов, вызванного ишемией осложнений, начиная от ран пробоя некроза обширной ткани по-прежнему происходят, особенно в реконструктивной хирургии лоскута. Несколько экспериментальных моделей закрылков были разработаны для анализа основных причин и механизмов и исследовать стратегии лечения для предотвращения ишемических осложнений. Сдерживающим фактором для большинства моделей является отсутствие возможности непосредственно и повторно визуализировать микрососудистую архитектуры и гемодинамики. Цель протокола было представить устоявшуюся модель мыши присоединения этих прежде упомянутые недостающие элементы. Тяжелее др. Разработали модель мышечного лоскута со случайным перфузии рисунком, который подвергается острой постоянную ишемию и результаты в ~ некроза на 50% через 10 дней, если хранятся лечить. С помощью прижизненной эпи-флуоресцентной микроскопии, эта камера модель позволяет повторяющийся визуализациюМорфология и гемодинамика в различных регионах, представляющих интерес с течением времени. Сопутствующие процессы, такие как апоптоз, воспаление, утечки микрососудов и ангиогенеза могут быть исследованы и коррелирует с иммуногистохимических и молекулярных белковых анализов. На сегодняшний день, эта модель доказала целесообразность и воспроизводимость в нескольких опубликованных экспериментальных исследований, изучающих влияние пре-, пери- и посткондиционирования ишемией оспариваемого ткани.
Introduction
Охват подвергаются сухожилия, кости и имплантата материала в реконструктивной хирургии опирается на использование закрылков. Заслонка блок ткани, которая передается на ее сосудистой ножки, что гарантирует артериальное приток и венозный отток. Несмотря на широкое экспертизы и наличия различных лоскутов, зачисляемые, вызванного ишемией осложнений, начиная от ран пробоя к полной потере тканей по-прежнему встречаются. В то время как консервативное лечение и исцеление вторичным натяжением можно ожидать после некроза незначительной ткани, значительное некроз лоскута обычно требуется хирургического вмешательства, в том числе хирургической обработки раны, раны кондиционирования и вторичной реконструкции. Это повышает заболеваемость, продлевает пребывание в больнице и, следовательно, приводит к увеличению расходов на здравоохранение.
Клапаны с неопределенной структуре сосудистой или случайно перфузированных областях в дистальной зоне наиболее удаленной от притока артериальной особенно склонны к ишемии. Акко rdingly, многочисленные экспериментальные и клинические исследования оценивали развитие некроза в оба, осевая картина закрылки (определяется кровоснабжение) и случайным образом закрылки (определено кровоснабжение) 1-3. Основные результаты, как правило, основаны на макроскопической оценки размера зоны некроза. Для того, чтобы оценить причины и механизмы некроза тканей более подробно, в нескольких исследованиях сосредоточено на анализе микроциркуляции. Различные методы были использованы для измерения тканевой перфузии, в том числе при анализе тканей напряжения кислорода с использованием полярографические электроды 4-5, а также измерением кровотока при помощи лазерной доплеровской флоуметрии 6-7, диффузию красителя 8, и микросферы 9-10. Эти методы, однако, только позволяют для измерения параметров косвенные тканевой перфузии и не дать возможность любому морфологического анализа microhemodynamic процессов внутри отдельной области, представляющей интерес лоскута.
т "> Сандисон, как известно, первым, кто использовал прозрачный камеру для продлен в естественных условиях исследования, которые он совершал в кроликов 11 В 1943 -. около 20 лет спустя - Algire был первым адаптировать такую прозрачную камеру для применения у мышей с целью изучения поведения микро-имплантаты опухолевых клеток 12. В связи с тем, что мыши, которые так называемого дряблая кожа животных и после некоторых технических уточнений в течение последующих лет, Лер и сотрудники смогли адаптироваться такие Спинной кожной складки камера разрабатывает меньше и легче титана камеру. Эта камера включена оценка с помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии, технику, обеспечивающую прямое и повторяющийся визуализацию ряда морфологических и микроциркуляторных особенностей и их изменений во времени при различных физиологических и патофизиологических условиях, например как ишемии-реперфузии травмы 13.При исследовании реrfusion из кожи, мышечных и костных лоскутов при нормальных и патологических условиях две тенденции произошло: во-первых, "острые" модели закрылков, которые не используют в спинной кожной складки камеру, таких как pedicled уха заслонки в мыши 14, в поперечном направлении, основанный лоскут остров кожи в хомяка 15 и pedicled сложного лоскута у крыс 16. Во-вторых, "хронический" лоскут модель, где сочетание клапаном с камеры позволяет спинной кожной складки повторяющихся микроциркуляции анализирует в течение нескольких дней с прижизненной флуоресцентной микроскопии. Он состоит из беспорядочно перфузии мышечный лоскут, который интегрирован в кожной складки камере мыши 17. Его отношение ширины к длине было выбрано, что ситуация острого упорной ишемии последовательно приводит в ~ некроза лоскута ткани 50% от 10 до 14 дней после закрылков высоте. Это воспроизводимая степень некроза тканей позволяет дальнейшую оценку и защитные (т.е. развитие леы некроз) и вредные факторы (то есть, развитие более некроза) на закрылков патофизиологии. В последние годы, несколько экспериментальных публикации, демонстрирующие эффект различной пре-, пери- и процедур пост-кондиционирования, в том числе администрации тканей-защитная веществ 18-24 и местного применения физиологических факторов стресса, таких как тепловой 25 и ударных волн 26, появились.
Количественные анализы некроза, микрососудистой морфологии и микроциркуляции параметров дополнительно могут быть соотнесены с иммуногистохимических анализов и белкового анализа. Различные белки и молекулы в том числе фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), азотной синтазы оксида (NOS), ядерный фактор каппа В (NF-kB) и белков теплового шока (HSP-32: гем-оксигеназы 1 (HO-1) и HSP- 70) было показано, играют важную роль в защите тканей. На основе этой модели камера закрылка, две модификации были разработаны в Ордг проанализировать образование новых сосудов и микроциркуляции во кожей трансплантата исцеления 27 и кровеносных сосудов разработок в pedicled лоскута с осевым образов перфузии 28. Мы представляем воспроизводимую и надежную модель, которая включает в себя ишемически оспариваемый мышечный лоскут в мышь кожной складки камеры. Эта модель позволяет визуализировать и количественно микроциркуляции и гемодинамики по прижизненной эпи-флуоресцентной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед осуществлением представленной модели, законы соответствующий защиты животных необходимо проконсультироваться и разрешение на это должно быть получено от местных властей. В этой работе, все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами для исследований с участием животных и немецкого законодательства о защите животных. Эксперименты были одобрены местным комитетом по уходу за животными.
1. Подготовка животных и Хирургическая Высота створки
- Держите животных в отдельных клетках при комнатной температуре 22-24 ° C и при относительной влажности воздуха 60-65% с 12-часовой день и-ночь цикла. Разрешить мышей свободный доступ к питьевой воде и стандартной лабораторной чау. Всегда поддерживать стерильные условия во время операции выживания.
- Обезболить мышь внутрибрюшинно (IP) инъекция 0,1 мл физиологического раствора на 10 г веса тела, содержащего 90 мг / кг массы тела кетамина гидрохлорид и 25 мг /кг массы тела dihydroxylidinothiazine гидрохлорид. Обезболивание необходимо для подготовки животного, хирургии и последующей микроскопии. Подтвердите правильное обезболивание путем проверки реакции на болезненным стимулом. Во время анестезии, применяется ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость.
- После индукции достаточной анестезии, удалять волосы назад с электрической бритвы. Далее, применяются депиляции крем на бритой области, чтобы удалить оставшиеся волосы.
- Во время пребывания депиляции кремом ~ 7-10 мин, подготовить инструменты, в том числе щипцов кожи и микро щипцы, ножницы и микро ножницы, шовный материал и маркером. Лечить и подготовить титана камеру, применяя два винта с гайкой на базе палаты и фиксируя самоклеящейся пены (рис. 1 переменного тока) вокруг окна коллегой палаты гарантировать герметичность системы камеры.
- Удалить все депиляции кремом от задней промывкойэто прочь с теплой водой. Тогда сухой и дезинфицировать кожу спиртовым раствором содержащих.
- Поместите мышь в положении лежа и определить среднюю линию спины. Возьмитесь за кожей централизованно и поднимите ее вверх, чтобы создать раза (рис. 2A). К транс-подсветкой, используя любой вид источника света, решить, где provisorily разместить титана кадр (рис. 2В). Убедитесь, что дистальные ветви латеральной грудной артерии (LTA) краниально и глубокой огибающей подвздошной артерии (ГАОПК) каудально курса через центр окна палаты (рис. 2В-D). После того, как позиционирование камеры делается, проколите оба слои кожи в самом низу складки для последующего фиксации титана кадр. Теперь удалите титана кадр, поместите курсор в положении лежа и переопределить средней линии спины, если это необходимо.
- Опишите лоскут перпендикулярно позвоночнику, начиная с средней линии с соотношением ширины к длине 15 х 11 мм, чтобы привести в боковом направлении и случайным образом на основе перфузии лоскута. Тогда наметить дополнительную область кожи 2 мм, проходящих на противоположной стороне (рис. 2С, D). Эта область определена с пинцетом, а затем пришивается к титана кадр, не вмешиваясь в видимой области лоскута.
- После финале маркировки, надрезать заслонку. При этом, как секут LTA и ГАОПК и поднять заслонку (фиг. 2е). Там нет необходимости для коагуляции или лигирования перерезанного сосудов.
- Поместите винт камеры через ранее сделанные перфорации кожи (рис. 2F) и фиксировать кожной складки и спереди и сзади в кадре палаты от поднятого лоскута к задней части рамы с помощью отверстия рамы палаты и 5-0 узловыми швами (рис. 2G).
- Шовный вертикальные конечности лоскута обратно в окружающую кожу с помощью 5-0 узловыми швами (
- Вырезания геми-круговой области боковых кожи к небольшой полосе кожи 2 мм, то есть, с другой стороны заглушкой, чтобы наблюдать сосудистую лоскута в. Это позволяет прямой вид через окно наблюдения камеры, которая имеет поверхность 90 мм 2.
- Снимите желатин, как свободную рыхлой соединительной ткани с поперечно-полосатых мышц, используя микрохирургические инструменты и оптическую лупу или микроскоп, чтобы улучшить качество изображения при микроскопии. Старайтесь не повредить сосуды в мышечных слоев ткани.
- Наконец, уплотнения камеры путем установки коллегу кадра, который ранее был наделен Самоклеющаяся полос пены вперед, краниально и кзади, покрывать росой лоскута с местного bisbenzimide и физиологического раствора (рис. 2J). После этого, нанесите смотровое окно с защитным стеклом, используя стопорное кольцо. Старайтесь не обманывать любые воздушные пузыри под стеклом (рис. 2K, L). Кожа будет придерживаться покровного стекла силами адгезии.
2. Прижизненные эпифлуоресцентной микроскопия
- Подождите 24 ч после хирургического подготовки к первому микроскопического анализа для идеального оптического качества. Этот анализ представляет собой базовую микроскопии и повторяется в день 3, 5, 7 и 10 после операции. Каждый раз, анестезию мыши, как описано в шаге 1.2. Место животное в боковом положении Пролежневая на заказ из оргстекла перевозчика. Таким образом, слои мышечной ткани лоскута придерживаясь покровного стекла сталкиваются вверх подопечных.
- Вводят 0,05 мл 5% зеленой флуоресценции декстрана (молекулярная масса 150000) и 0,05 мл 1% высоко флуоресцентный краситель родамин семьи в хвостовую вену или ретро-бульбарной венозного сплетения. Зеленый флуоресцентный декстран окрашивает без клеточных компонентов крови, если применяется внутривенно (IV). Флуоресцентный родамин пятна лейкоцитов и тромбоцитов, которые могут быть расстояниеinguished от других сотовых и не-клеточных компонентов. Наконец, bisbenzimide окрашивает ядерные компоненты, которые излучают более или менее флуоресценции в зависимости от состояния конденсации.
- Впоследствии, место мышь под микроскопом. Убедитесь микроскоп включает систему LED - комбинации светодиодных луча для 470 & 425 нм, 365 и 490 нм, и 540 & 580 нм, а также соответствующие наборы фильтров (62 HE BFP / GFP / HcRed, диапазон 1: 350-390 нм длина волны возбуждения, разделить 395 нм / 402-448 нм; Диапазон 2: 460-488 нм, разделить 495 нм / 500-557 нм; Диапазон 3: 567-602 нм, разделить 610 нм / 615 нм до бесконечности 20 родамин, диапазон. : 540-552 нм, разделить 560 нм, эмиссия 575-640 нм).
- Запишите фото и Motion-изображения с помощью прибора с зарядовой связью видеокамера и сохранять их на жестком диске компьютера для дальнейшего автономного анализа.
- Используйте различные цели (2.5x, NA (числовая апертура) = 0,06 для панорамных камеры; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) для записи в регионах, представляющих интерес.
- Практически, разделить закрылков поверхность, которая видна через окно палаты в трех областях одинаковой высоты, то есть, в проксимальных, центральной и дистальной области наиболее удаленной от сосудистой притока (рис. 3F). Для получения изображения, перейдите следующим образом в каждый момент времени наблюдения точки:
- Сканирование изображения тканей по изображению в окне палаты от проксимальных к дистальной использованием цель 5X.
- В каждой области лоскута, выберите второй или третьей порядка артериол и сопровождающих их венулы с легкостью идентифицируемых видах ветвящихся. Использование цель 5X, 10X, или 20X, сделать распечатки на arteriolovenular пучков для того, чтобы легко повторно локализовать пучки на протяжении всего периода наблюдения.
- С целью 20Х и объектива 50X, дальнейших запись 5-6 капиллярных полях и "апоптоза"полей в зоне закрылка соответственно. Все изображения, записанные с 10X и 20X целей использовать синий свет (люминесцентные декстран) и зеленый свет (родамин) фильтр, в то время как изображения, записанные с 5X и 50X цель использования синего света (люминесцентные декстрана) и белого света (Bisbenzimide) фильтра, соответственно ,
3. Анализ записанных данных
Примечание: с использованием системы анализа изображений с помощью компьютера количественно все записанные параметры офф-лайн следующим образом 29.
- Измерение площади без перфузии, соответственно некротических тканей (мм 2).
- Используйте полный сканируется камерный оконный изображение, записанное с целью 5X (от 2.6.1) и флуоресцентного декстрана производить измерения перфузии соответственно некротические ткани. Используйте функцию "AreaBo" для измерения не-перфузии темную область: на границе с нон-перфузии область и вычислить площадь в мм 2 с помощью алгоритмов измерения в программном обеспечении области.
- Измерение диаметра микрососудов в артериол, капилляров и венул (мкм).
- Загрузите видео или картинки из записанных AV-расслоений или капиллярных полей в программном обеспечении. Для достижения наилучших результатов используйте фотоснимки или видео с наибольшим увеличением где определенные границы судна отчетливо видны.
- Используйте функцию "DiamPe" ПО, чтобы убедиться, измерения проводятся перпендикулярно стене сосуда. Для этого отметьте две точки на стене судна и с третьего щелчка марки перпендикулярной диаметру сосуда. Программное обеспечение будет выполнять измерение в мкм.
- Повторите измерения на тех же судов для всех записей в том же месте. Измерьте несколько капилляров накапливать средний диаметр.
- Анализ эритроцитов (RBC) скорости в артериол, капилляровй венул (мм / с).
- Для артериол красной клетки крови (РБК) скорости (мм / с) измерения использовать функцию "VeloLSD" ПО и выбрать те же сосуды в флуоресцентного декстрана окна, для которого диаметры были измерены.
- Проанализируйте его с системой анализа изображений с помощью компьютера, используя метод линия сдвига, который на основе измерения сдвига (мм) индивидуального внутрисосудистого рисунком серого уровня в течение долгого времени (с).
- Измерение объемного кровотока в сосудах (пл / сек).
- Рассчитать объемный кровоток (пл / сек) в артериол, венул и капилляров от РБК скорости и емкости площади поперечного сечения (π * R 2) в соответствии с уравнением Гросса и Aroesty, то есть, Q = V * π * R 2 , при условии, цилиндрическую форму сосуда 30.
- Измерение функциональной плотности капиллярного РБК-перфузии капилляров (питательная перфузии: см / см
- Загрузите записанный флуоресцентный поле капилляров с 20-кратным объективной увеличении в программном обеспечении. Используйте функцию "DensLA" для измерения функциональной плотности капилляров в РБК-перфузии микрососудов.
- Проследите перфузированных капилляры с курсором и отметьте перфузированных сосуды. Не отмечайте без перфузии капилляров, артериол и венул. Программное обеспечение будет измерять функциональной плотности капилляров из перфузированных капилляров в см / см 2. Повторите шаги для других зарегистрированных капиллярных полях.
- Нагрузка видеозаписей или кадры люминесцентных полей капиллярных в программное обеспечение. Определить извитых сосудов и использовать функцию "TorqIx" программного обеспечения. Проследите определенную поток судно с курса и заканчиваться правой кнопкой мыши. Программное обеспечение будетнарисовать прямую линию на прямой путь и посажу в связи с трассируемого пути.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за признаками ангиогенеза, таких как почки, ростки и вновь образованных капилляров, которые, как правило, исходят перпендикулярно от уже существующих капилляров. Измерения плотности этих новообразованных сосудов, как описано в шаге 3.5.
- Загрузите Bisbenzimide-видеозаписей (50X объективные) в программное обеспечение. Используйте функцию "DenseNA". Отметить апоптоза клеток в соответствии с указанными характеристиками, такими как ядерный конденсации, фрагментации и margination с левой кнопкой мыши.
- После маркировки все характерные клетки по всему видео, нажмите "N / A" в программном обеспечении, которая автоматически рассчитывать все отмеченные клетки и разделить его по всей площади. Результат будет апоптическаяклеток / мм 2.
- Анализ воспалительную реакцию путем подсчета количества родамина помечены лейкоциты, что прилипшие к эндотелиальной выстилки после венул в течение периода времени от ≥30 сек ("наклейки") и периодически прилипших лейкоцитов (<30 сек, "ролики") , Венулярного адгези лейкоцитов выражается в виде клеток на мм 2 эндотелиальной поверхности.
- Оцените макромолекулярный лeakage в качестве параметра микрососудистой проницаемости после внутривенной инъекции флуоресцентного декстрана. Денситометрии определить несколько уровней серого в ткани, непосредственно прилегающей к капиллярной стенки сосуда (E1), а также в краевых бесклеточной плазмы сосуда (E2). Затем рассчитать макромолекул транссудации (E) как отношение E1 / E2 31.
4. Послеоперационный уход
- Вернуться животное в отдельной клетке, чтобы избежать компанию других животных, пока полностью не восстановился. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не восстановил достаточное сознание поддерживать грудины лежачее положение. Монитор животных ежедневно в течение кровотечения, местных и системных признаков инфекции и от положения камеры.
- Оцените общее состояние животного, наблюдая двигательную активность, вес тела, признаки боли, терпимости к заправкой и авто членовредительства.
- Держите мышей один в клетке, чтобы избежать Мутуаль манипулирование камеры. В каких-либо признаков боли, бупренорфин применять в дозе 0,05-0,1 мг / кг массы тела, подкожно в течение 8 ч интервалами.
5. Эвтаназия и Эксплантация от кожной складки палаты
- На 10-й день, приносить в жертву животных с помощью передозировки анестезирующего препарата (150 мг / кг фенобарбитала).
- Снимите камеру и попробовать закрылков ткани для иммуногистохимических и молекулярных белковых анализов. Примеры тканей для обычной гистологии (формалина) и количественному белкового анализа (жидкий азот или сухой лед).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Некроз
Основной конечной точкой этой модели - некроз тканей следующей закрылка высоте (то есть, индукция острого упорной ишемии) - повторно измерены и проиллюстрировано макроскопически, как показано на рисунке 3 в течение 10 дней. Окончательное разграничение некроза лоскута обычно происходит между 5 и день 7 после операции и характеризуется красной бахромой, т.е. зоны вазодилатации и микрососудистых ремоделирования, развивается между проксимальным и жизненно дистальной зоны некроза лоскута (фиг. 3D-F ). Необработанные контрольные мыши, как правило, разработать зону некроза около 50% после 10 дней, которые можно разделить на три направления: хорошо перфузии проксимальных, интеркалированную и критически перфузии центральной площади и некротические дистальной области (рис 3F.). Предыдущие исследования нашей группы, как уже упоминалось во введении, показали защитную еffects после различных процедур предобусловливания, которые характеризуются сдвигом критически перфузии области от центральной зоны в направлении дистального зоне лоскута.
Параметры судно
Микрососудистые диаметры и эритроцитов (RBC) -velocity артериол и венул различного диаметра, а также из соседних капилляров измеряются и полученную объемного кровотока рассчитывается офф-лайн. Это позволяет корреляции и морфологические и функциональные изменения различных микрососудов от дня 1 до дня 10 (рис. 4A-B). Кроме того, функциональный плотность эритроцитов-перфузией капилляров, параметр для питательной перфузии ткани, анализируется. Капилляры, как правило, ориентированы на параллельных и присутствует с диаметром от 3-5 мкм при физиологических условиях (рис. 4в). Кровоток, функциональная плотность капиллярной и в конечном итоге напряжение кислорода в TISSUE постепенно уменьшаться от проксимальных к дистальной достичь порога "жизнеспособности" (рис. 4С-E), где капилляры не перфузии больше (рис. 4е).
Микрососудистой реконструкции и ангиогенез
Ремоделирования с расширение и повышение извитость микрососудов можно наблюдать во всех экспериментальных групп, проходящих подготовку заслонки (т.е., индуцирование острой ишемии упорной:. Рис 4F). Тем не менее, в этой модели, одна ишемического стимула не достаточно, чтобы индуцировать ангиогенез, как, например, видно в различных экспериментах с предобусловливания гормона эритропоэтина (рис. 4 G-H). Новые функциональный микрососудистые сети, которые, как правило, развиваются из капилляров почек и побегов, исходящих перпендикулярно от уже существующих в параллельные расположены капилляры первым видимым между 3-й день и 5.
Воспалительный ответ (лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия и апоптоз)
Острая стойкие ишемия обычно вызывает значительную воспалительную реакцию в необработанных животных, что представлено придерживаясь лейкоциты в микрососудистой эндотелия. Это воспалительная реакция характеризуется прокатки (т.е. периодическое адгезии лейкоцитов к эндотелия сосудов) и торчащий (т.е. фирма адгезии лейкоцитов к эндотелия сосудов) лейкоцитов (рис. 5A-B). Кроме того, ишемия индуцированное увеличение апоптотических клеток можно видеть на всех контрольных животных с характерными признаками ядерной конденсации, фрагментации и margination (рис. 5C-D). Оба, лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия и апоптоз признаки для вызванного ишемией воспалительной реакции и постепенно увеличивать с прогрессивной дисфункции микрососудов и снижение кислорода натяжение ткани (т.е. (рис. 5A-D)).
Рисунок 1. Иллюстрация титана камерной рамой и все его деталей. () В разобранном рама, состоящая из двух каркасных частей, тремя винтами, пять орехов, цельного куска пены, покровным стеклом и стопорного кольца. (B) Необходимые инструменты для сборки рамы, включая водителя ореха шестигранной, в стопорного кольца плоскогубцами и кусачки. Отвертка не требуется, но рекомендуется, если камеры будут использоваться несколько раз. (C) в собранном виде отдельных деталей камеры. Слева: задняя сторона рамы с двумя винтами и придает гайки на нижних двух отверстий. Задняя сторона используется для шов рамы на коже и несет заслонку. Справа: Собранный переднюю сторонурама с прикрепленными пены для обеспечения герметичности. Следует отметить, что все три резьбовые отверстия-были свободными от пены. Убедитесь, что ни один из пены не будет нажата в окне наблюдения, которая носит защитное стекло. (D) Схема собрана камеры кадр без спинного кожной складки.
Рисунок 2. Иллюстрация оперативной процедуры закрылков и ее реализации в титан спинной кожной складки камере мыши. (А) Повышенные транс-подсветкой вдвое спинной кожной складки мыши для визуализации сосудов архитектуру для изложением позиции спинной кожной складки камеры. (В) Задняя часть рамы титана палаты был установлен и приведен в соответствие с сосудами. Разрез двух отверстий для винтов прикрепить лицевую сторону рамы гаы были сделаны. (C и D) Излагая лоскута на спинной кожи с боков: Отношение ширины к длине составляет от 15 мм до 11 мм в то время как централизованные два перпендикулярно возникающие сосуды. 2 мм Расстояние до контралатеральной стороне (немаркированных области между тонкой клапаном контура и толстой границы) будет использоваться, чтобы захватить кожу щипцами, чтобы поднять крышку. Для наблюдения за кожей зад через окно камеры, дополнительные ткани должен быть удален (заштрихованная область). (Е) в поперечном направлении на основе Повышенные кожный лоскут, демонстрируя случайным образом расположенных сосудов архитектуру, происходящий от основания лоскута. Заштрихованная область была вырезана, но по-прежнему привязаны к лоскута и удаляется на следующем этапе (висит кожа под щипцами). (F) Монтажный заднюю сторону камеры кадра. Поверхность кожи лоскута находится на задней стороне и на "сырой" поверхности под стороне стекла оконного. Винты chamber`s застряли Четух надрезанные отверстия с обеих сторон спинного кожной складки. (G) окружающая кожа, спереди и сзади, лоскута фиксируется в отверстиях верхней камеры ободом. (Н) кожный лоскут растягивается, а также пришит к задней стороне рамы. Чтобы избежать дегидратацию лоскута, 0,9% раствор хлорида натрия капает на лоскут неоднократно. (Я) Лоскут и окружающая кожа полностью фиксируется в отверстиях верхней камеры ободом. Лоскут ушивают обратно в боковом направлении в соседнюю кожи спинной, чтобы гарантировать герметичность камеры. (J) Монтаж пены несущих аналог рамы, окружающих окно наблюдения. (K) Полностью смонтированы камеры: Защитное стекло крепится к окнам наблюдения и запечатаны с упорным кольцом. Третий винт прикреплен к верхней части рамы для дополнительной герметичности. Окно в камере позволяет повторные анализы на microvasculaturе лоскута по прижизненной микроскопии. Для облегчения доступа во микроскопии три винта укорачиваются. (L) Проснись и перемещение мыши с установленным спинной кожной складки камеры.
Рисунок 3. Представление морфологического развития и демаркации некроза лоскута на дни 0 (сразу после приготовления закрылка, А), 1 (B), 3 (С), 5 (D), 7 (Е) и 10 (F) . Финал некротических демаркация происходит между дней 5 и 7 (D и E). Органы управления показывают явное зону демаркации в пределах центральной части лоскута, в том числе красной бахромой и белым серп (двойной стрелки и звездочки в Е), что отражает гиперемической ответ и микрососудов ремоделирования, а также не-перфузии, но потенциально жизнеспособных область разграничения ткани некроз развивается дистально (E). В панели F, заслонкаткань делится на три отдельные области на 2 горизонтальных линий: хорошо перфузии проксимального зоны (на базе образа), критически перфузии центральная зона (в том числе красной бахромой белый "серп Lunatica", соответствующий полутени при ишемическом мозге ткани после травмы инсульт) и некротической дистальной зоне (по окружности, отмеченной красной каймой). Увеличение 16X.
Рисунок 4. Прижизненные эпи-флуоресцентной микроскопии отображения изображения arteriovenular (AV) пучки (A, B), капиллярные поля (C, D, E) и морфологические изменения, такие как ремоделирования (F) и ангиогенеза (G, H). Прижизненные микроскопия показывает тот же AV-расслоение в контрольной животного (A, B) на 1 день (A) и 10 (B). Обратите внимание на отсутствие медлительности ответ в контрольной в течение всего периода наблюдения в обеих артериолар (а) и венулярный (v) диаметр. Изображения C, D и E демонстрируют параллельно расположены капилляры в перфузиии проксимального зоне (C), критически перфузии центральной зоны перехода (D) и не-перфузии некротической дистальной зоны (E) от ишемической лоскута ткани. В критическом перфузированных контрольных мышей центральной зоны только показывают ремоделирования сосудов (F), характеризуется в параллельных расположены капилляры с расширением и увеличением извитости. В противоположность этому, у мышей, получавших эритропоэтин перед клапаном высоте, как через схему предварительной обработки показывают вновь образованных и перпендикулярно возникающие капилляры, которые явно отличается от обычных уже существующих капилляров (G, H). Это ангиогенным ответ не наблюдалось в контрольной группе. Повышение контрастности с флуоресцентной декстрана 150000. Увеличение 80X.
Рисунок 5. </ Сильный> Прижизненные эпи-флуоресцентной микроскопии отображения AV-пакеты в перфузиии проксимального зоне закрылков (A) и критически перфузии ишемической центральной переходной зоне ткани (B). Обратите внимание на увеличение присутствия придерживаясь лейкоцитов (стрелки) в посткапиллярных венул (v) и артериолы (а) в пределах от ишемической зоне закрылка (B) по сравнению здорового проксимальный зону (A). Повышение контрастности родамином. Увеличение 80X. Прижизненные эпи-флуоресцентной микроскопии отображения ядерной конденсации, указывающий апоптоза внутри проксимального (С) и критически перфузии площадь центральной заслонки (D) из контрольной группы. Увеличилось количество апоптотических клеток (белые стрелки) наблюдается в более ишемической центральной зоне перехода (D), по сравнению с проксимальной зоне (C). Повышение контрастности с Bisbenzimide. Увеличение 250X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для того чтобы уменьшить ишемических осложнений и тем самым улучшить клинические результаты, более детальное знание патофизиологических процессов в критическом перфузии лоскута ткани требуется. Разработка новых моделей на животных, которые имитируют острый постоянную ишемию Поэтому обязательным. Соответственно, мы смогли разработать легко воспроизводимую и надежную модель, позволяющая для повторного морфологического, динамического и функционального оценки в реальном времени различных параметров мышцы и сосудистой кожи, что может быть связано с иммуногистохимического и молекулярного анализа отобранного лоскута ткани.
Хирургическая процедура не требует каких-либо конкретных хирургических навыков, хотя практика и некоторые ловкость рук необходимо. Кривая обучения около 25-30 оперированных животных, как правило, необходимо освоить установку спинной кожной складки камеры и подготовки лоскута правильно. В опытных руках, время для хирургии средних 35 минут. Решающее значениеЭтапы подготовки лоскута включают правильное размещение и наброски лоскута в центре окна палаты с точного позиционирования магистральных сосудов должны быть перерезана (с использованием транс-освещение) и тщательное удаление желатина как слой над panniculus carnosus используя изображения-увеличение, чтобы улучшить качество изображения.
Поскольку размеры лоскута даны в миллиметрах, мы рекомендуем использовать штангенциркулем для правильной лоскут маркировки. Если есть какие-либо трудности в то время как позиционирование по горизонтали расположены доминирующие сосуды внутри окна палаты, следует скорее выбрать более дистальной чем более проксимального позиции судов. Правильное позиционирование этих судов, что поперечные окно палаты, гарантирует рассечение из них в то время как подъемный люк с дистальной проксимальных и приводит к случайным перфузии лоскута. Другими словами, неспособность секут эти крупные сосуды приведет к осевому перфузииобразец без некроза ткани под окном. Окончательный важным шагом в процессе хирургической подготовки касается удаления слоя рыхлой соединительной ткани желатина типа. Опыт показал, что чрезмерные повреждения удаления нижележащих panniculus carnosus и так тонкая горизонтально мышечные капилляры. Наоборот, консервативные результаты удаления отека-образования и в конечном итоге ограничивается видимость из регионов интереса во время микроскопии. Если все эти шаги будут освоены с осторожностью, заслонка очень постоянно развивается примерно 50% некроз через 10 дней после закрылков высоте. Это позволяет изучать различные терапевтические стратегии, которые могут улучшить или ухудшить выживание лоскута ткани. Наконец, метод прижизненной флуоресцентной микроскопии является хорошо установленной процедуры для оценки тканевой перфузии микрососудов и могут быть извлечены очень быстро.
Основным недостатком этой модели является ограниченное время наблюдения ткани внутри камеры217; ы окно приблизительно от 10 до 14 дней после подготовки лоскута. Это происходит из-за постепенного разрыхления проксимальной кожи на дорсальную кожной складки камере, что в конечном итоге приводит в боковом наклоне камеры. Редко, сэндвич-как, фиксируется кожа вытаскивает из рамы палаты и оказывает микроскопии невозможно. Так как некроз наиболее часто полностью разграничены между днем 5 и 7 после операции, это на самом деле не компромисс сбора данных, прежде чем наклона камеры или вытягивать из кожи в камере.
Преимущества модели включают легкую воспроизводимость и потенциальное использование генетически модифицированных животных. Относительно небольшой размер окна, которые могут быть оценены может поставить под угрозу Однако значимость в переводе результаты в человеческих условиях. Кроме того, существуют анатомические различия между свободными кожей животных и человека. В то время как животные и хирургические инструменты имеют разумную экономическую эффективность, харD- и программное обеспечение, необходимое для выполнения микроскопии (эпи-подсветки микроскоп, камера высокого разрешения, флуоресцентные красители и специальное программное обеспечение для анализа данных от строки) представляет увеличения инвестиций.
Вывод:
Мы представляем время и экономичное животную модель на мышах, что позволяет визуализировать и количественно оценить параметры микроциркуляции в высоком разрешении. Этот подход представляет собой идеальный метод критического анализа перфузии мышечный лоскут ткани и основополагающие клеточные механизмы. Морфологические изменения регионах, представляющих интерес может быть повторно исследованы и коррелирует с функциональными изменениями на микро- и клеточном уровне. После прижизненной эпи-флуоресцентной микроскопии, ткань может быть дополнительно обработан с помощью гистологических и молекулярных подходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Katharina Хаберланд для редактирования изображений. Финансирование: старший автор получил KKF Грант из Technische Universität München, чтобы создать новую исследовательскую лабораторию.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
