Summary
La fenêtre de la chambre du pli cutané dorsal murin présenté visualise une zone d'ischémie aiguë et persistante d'un lambeau musculo. Intravitales épi-fluorescence permet de microscopie pour l'évaluation directe et répétitive de la microvascularisation et la quantification de l'hémodynamique. Morphologique et résultats hémodynamiques peuvent en outre être en corrélation avec des analyses histologiques et moléculaires.
Abstract
Malgré expertise profonde et techniques chirurgicales de pointe, les complications induites par ischémie allant de rupture de la plaie à une nécrose des tissus se produisent encore, notamment en chirurgie reconstructive de rabat. Modèles de volets expérimentaux multiples ont été développés pour analyser les causes et les mécanismes sous-jacents et d'étudier les stratégies de traitement pour prévenir les complications ischémiques. Le facteur limitant de la plupart des modèles est la possibilité manque de visualiser directement et de façon répétitive l'architecture microvasculaire et hémodynamique. L'objectif du protocole est de présenter un modèle de souris bien établie affilier ces éléments qui manquent avant mentionnés. Plus difficile et al. Ont mis au point un modèle de lambeau musculo avec un motif de perfusion aléatoire qui subit une ischémie aiguë et persistante et résultats dans ~ 50% de nécrose après 10 jours si elle est conservée non traitée. A l'aide de la microscopie intravitale épi-fluorescence, ce modèle permet la visualisation de la chambre répétitive demorphologie et l'hémodynamique dans différentes régions d'intérêt au fil du temps. Traitements associés tels que l'apoptose, l'inflammation, l'angiogenèse et microvasculaire fuite peuvent être étudiés et corrélés à des dosages de protéines immunohistochimiques et moléculaires. À ce jour, le modèle a prouvé la faisabilité et la reproductibilité dans plusieurs études expérimentales publiées étudier l'effet de pré-, péri- et post-conditionnement de tissu ischémie contestée.
Introduction
Couverture de exposé tendon, de l'os et l'implant en chirurgie reconstructive matériau repose sur l'utilisation de volets. Un clapet est un bloc de tissu qui est transférée sur son pédicule vasculaire qui garantit afflux artériel et le débit sortant veineux. Malgré une vaste expertise et la disponibilité d'une variété de volets à être transférés, les complications induites par ischémie allant de rupture de la plaie à la perte totale du tissu sont encore rencontrés. Tandis que le traitement conservateur et la guérison par seconde intention sont à craindre après une nécrose des tissus mineure, significative nécrose du lambeau nécessite généralement une reprise chirurgicale, y compris le débridement, le conditionnement des plaies et de la reconstruction secondaire. Cela augmente la morbidité, prolonge l'hospitalisation, et par conséquent conduit à une augmentation des coûts de soins de santé.
Volets avec un modèle indéfini de la vascularisation ou zones perfusés de façon aléatoire dans la zone distale la plus éloignée de l'entrée artérielle sont particulièrement sujettes à des lésions ischémiques. Acco rdingly, de nombreuses études expérimentales et cliniques ont évalué le développement d'une nécrose à la fois, les volets de modèle axial (d'approvisionnement en sang défini) et les volets de façon aléatoire (d'approvisionnement en sang non définie) 1-3. Les principaux résultats sont généralement basées sur l'évaluation macroscopique de la taille de la zone nécrotique. Afin d'évaluer les causes et les mécanismes de la nécrose des tissus plus en détail, plusieurs études ont porté sur l'analyse de la microcirculation. Différentes techniques ont été utilisées pour mesurer la perfusion tissulaire, y compris l'analyse de la tension d'oxygène des tissus en utilisant des électrodes polarographiques 4-5, ainsi que la mesure du flux sanguin en utilisant débitmétrie laser Doppler 6-7, colorant diffusion 8, 9 à 10 et des microsphères. Ces techniques, cependant, ne permettent de mesurer des paramètres indirects de la perfusion tissulaire et ne permettent pas une analyse morphologique des procédés microhemodynamic intérieur d'une zone d'intérêt particulier d'un volet.
t "> Sandison est connu pour être le premier qui a utilisé une chambre transparente pour prolonger les études in vivo, qu'il accomplit chez les lapins 11 En 1943 -. environ 20 ans plus tard - Algire fut le premier à adapter une telle chambre transparent pour être applicable chez la souris afin d'étudier le comportement des micro-implants de cellules tumorales 12. En raison du fait que les souris sont les animaux dits de peau lâche et après quelques améliorations techniques au cours des années suivantes, Lehr et collègues ont pu adapter cette une chambre de pli cutané dorsal développement d'une chambre de titane plus petit et plus léger. Cette chambre permet l'évaluation en utilisant la microscopie à fluorescence intravitale, une technique qui permet la visualisation directe et répétitive d'un certain nombre d'morphologiques et microcirculatoires caractéristiques et leur évolution dans le temps dans différentes conditions physiologiques et pathophysiologiques, tels que l'ischémie-reperfusion 13.Dans l'enquête de perfusion de la peau, des muscles et des os volets dans des conditions normales et pathologiques deux tendances se sont produits: d'abord, les modèles «aiguë» des volets qui ne utilisent pas la chambre dorsale du pli cutané comme le pavillon de l'oreille pédiculé chez la souris 14, le lambeau de peau de l'île sur la base latéralement chez le hamster 15 et le volet composite pédiculé chez le rat 16. Deuxièmement, le modèle «chronique» de rabat où la combinaison d'un rabat avec une microcirculation répétitif dorsale plis cutanés chambre des permis des analyses sur plusieurs jours avec la microscopie à fluorescence intravitale. Il se compose d'un lambeau musculo perfusé de manière aléatoire, qui est intégré dans la chambre de pli 17 de la souris. Son rapport largeur-longueur a été choisie d'une situation d'ischémie aiguë et persistante des résultats toujours dans ~ 50% de nécrose des tissus de rabat 10 à 14 jours après rabat élévation. Cette mesure reproductible de nécrose tissulaire permet une évaluation plus poussée des deux, de protection (c.-à-développement de less nécrose) et des facteurs néfastes (par exemple, le développement de plus de nécrose) sur la physiopathologie rabat. Au cours des dernières années, plusieurs publications expérimentales démontrant l'effet de pré différent, péri- et post-conditionnement des procédures, y compris l'administration de substances de tissus de protection 18-24 et l'application locale de facteurs de stress physiologiques tels que la chaleur et des ondes de choc 25 26, ont vu le jour.
Les analyses quantitatives de nécrose, microvasculaire morphologie et paramètres microcirculatoires peuvent en outre être corrélés à des analyses immunohistochimiques et des dosages de protéines. Différentes protéines et des molécules dont le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), oxyde nitrique synthases (NOS), le facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et les protéines de choc thermique (HSP-32: l'hème-oxygénase 1 (HO-1) et HSP- 70) se sont avérés jouer un rôle dans la protection des tissus. Sur la base de ce modèle, la chambre de clapet, deux modifications ont été développés in order à analyser la néovascularisation et la microcirculation pendant une greffe de peau guérison 27 et développements angiogéniques dans un lambeau pédiculé avec motif axial perfusion 28. Nous présentons un modèle reproductible et fiable qui comprend un lambeau musculo-ischémie contesté dans la chambre du pli cutané de la souris. Ce modèle permet la visualisation et la quantification de la microcirculation et l'hémodynamique par microscopie intravitale épi-fluorescence.
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Protocol
NOTE: Avant la mise en œuvre du modèle présenté, les lois de protection des animaux correspondant doivent être consultés et doit être autorisée par les autorités locales. Dans ce travail, toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les principes directeurs pour les animaux de recherche impliquant et la législation allemande sur la protection des animaux. Les expériences ont été approuvés par le comité de protection des animaux.
1. Préparation des animaux et élévation chirurgicale de la poitrine
- Gardez les animaux dans des cages individuelles à la température ambiante de 22-24 ° C et à une humidité relative de 60-65% avec un cycle jour et nuit de 12 heures. Autoriser souris libre accès à l'eau potable et nourriture de laboratoire standard. Toujours maintenir des conditions stériles pendant la chirurgie de survie.
- Anesthésier les souris par voie intrapéritonéale (ip) par injection de 0,1 ml de solution saline pour 10 g de poids corporel contenant 90 mg de chlorhydrate kg de poids corporel / de la kétamine et 25 mg /kg de chlorhydrate pc dihydroxylidinothiazine. L'anesthésie est nécessaire pour la préparation des animaux, la chirurgie et la microscopie ultérieure. Confirmez anesthésie appropriée en cochant la réponse à un stimulus douloureux. Pendant le temps de l'anesthésie, appliquer la pommade sur les yeux vétérinaire pour prévenir la sécheresse.
- Après l'induction de l'anesthésie suffisante, épiler le dos avec un rasoir électrique. Ci-après, appliquez une crème d'épilation à la zone rasée pour enlever les poils restant.
- Pendant le temps de résidence de la crème d'épilation de ~ 7-10 min, préparer les instruments, y compris les pinces de la peau et pince micro, des ciseaux et ciseaux micro, matériel de suture et un marqueur. Désinfecter et préparer la chambre de titane en appliquant les deux vis avec l'écrou à la base de la chambre et en fixant mousse auto-adhésif (Fig. 1 AC) autour de la fenêtre de son homologue de la chambre à garantir l'étanchéité du système de chambre.
- Retirez toutes les crèmes épilation du dos par lavagele tout avec de l'eau tiède. Puis sécher et désinfecter la peau avec une solution contenant de l'alcool.
- Placer la souris en position couchée et définir la ligne médiane du dos. Saisissez la peau au centre et soulevez-le pour créer un pli (Fig. 2A). Par trans-illumination en utilisant tout type de source de lumière, décider où placer de manière provisoire le cadre de titane (Fig. 2B). Assurez-vous que les branches distales de l'artère thoracique latérale (LTA) céphalique et l'artère circonflexe iliaque profonde (DCIA) caudale cours à travers le centre de la fenêtre de la chambre (Fig. 2B-D). Une fois que le positionnement de la chambre est terminée, les deux couches de perforer la peau au niveau du fond de la pliure pour la fixation ultérieure de la trame de titane. Maintenant, retirez le cadre en titane, placez la souris en position couchée et redéfinir la ligne médiane du dos si nécessaire.
- Exposer brièvement le volet perpendiculairement à la colonne vertébrale à partir de la ligne médiane, avec un rapport largeur-longueur de 15 x 11 mm pour conduire à un rabat latéralement base et perfusé au hasard. Puis définir une zone de peau supplémentaire de 2 mm étendant au côté opposé (Fig. 2C, D). Cette zone est captée par la pince, puis suturé au cadre de titane, sans interférer avec la zone de rabat visible.
- Après la notation finale, inciser le rabat. Ce faisant, les sectionner à la fois la LTA et DCIA et élever le volet (Fig. 2E). Il n'y a pas besoin pour la coagulation ou la ligature des vaisseaux sectionnés.
- Placez la vis de la chambre à travers les perforations de la peau faites précédemment (Fig. 2F) et fixer le pli cutané à la fois avant et en arrière dans le cadre de la chambre du volet élevée à la partie arrière du cadre en utilisant les trous du châssis de la chambre et un 5-0 points séparés (fig. 2G).
- Suturer les branches verticales du volet arrière de la peau environnante au moyen de 5-0 points séparés (
- Exciser une zone semi-circulaire de la peau latérale de la petite bande de peau de 2 mm, soit de l'autre côté de la patte d'observer le système vasculaire du rabat. Ceci permet une vue directe à travers la fenêtre d'observation de la chambre qui a une surface de 90 mm 2.
- Retirez le tissu cellulaire lâche gélatineuse du muscle strié en utilisant des instruments de microchirurgie et loupe optique ou microscope afin d'améliorer la qualité de l'image lors de la microscopie. Essayez de ne pas endommager les vaisseaux dans les couches de tissus musculaires.
- Enfin, étanchéité de la chambre par le montage de la contrepartie de la trame qui a déjà été revêtus de bandes auto-adhésives de mousse en avant, en arrière et crânienne, bedew le rabat avec bisbenzimide actualité et une solution saline (Fig. 2J). Par la suite, appliquer la fenêtre d'observation avec un couvercle en verre à l'aide d'un anneau élastique. Essayez de ne pas prendre au piège des cloques d'air sous le verre (Fig. 2K, L). La peau va adhérer au verre de couverture par les forces d'adhérence.
2. Intravitale épifluorescence Microscopie
- Attendez 24 heures après la préparation chirurgicale pour la première analyse microscopique de la qualité optique idéal. Cette analyse représente la ligne de base de la microscopie et est répétée au jour 3, 5, 7 et 10 après la chirurgie. Chaque fois, anesthésier la souris comme décrit dans l'étape 1.2. Placer l'animal dans une position de décubitus latéral sur un support en plexiglas sur mesure. De cette façon, les couches de tissus musculaires du volet adhérant à la vitre de couverture sont vers le haut-quartiers.
- Injecter 0,05 ml de 5% de la fluorescence verte de dextrane (poids moléculaire 150 000) et 0,05 ml de 1% de colorant fluorescent fortement de la famille de la rhodamine dans une veine de la queue ou le plexus veineux rétro-bulbaire. Le dextran fluorescent vert colore les composants non cellulaires du sang si elle est appliquée par voie intraveineuse (iv). La fluorescence de la rhodamine taches leucocytes et des plaquettes qui peuvent être distinguished des autres composants cellulaires et non cellulaires. Enfin, bisbenzimide colore composants nucléaires qui émettent plus ou moins de fluorescence en fonction de l'état de condensation.
- Par la suite, placer la souris sous le microscope. Vérifiez que le microscope comprend un système LED - combinaisons de feux à LED pour 470 et 425 nm, 365 nm et 490, et 540 et 580 nm, ainsi que les jeux de filtres correspondants (62 HE BFP / GFP / HcRed, entre 1: 350 à 390 nm d'onde d'excitation, divisée 395 nm / 402-448 nm; intervalle de 2: 460-488 nm, 495 nm divisée / 500-557 nm; intervalle de 3: 567-602 nm, 610 nm divisée / 615 nm à l'infini 20 rhodamine, gamme. : 540-552 nm, 560 nm divisée, l'émission de 575 à 640 nm).
- Enregistrez les images fixes et animées-photos à l'aide d'un système caméra vidéo à couplage de charge et de les enregistrer sur un disque dur d'ordinateur pour l'analyse plus loin en ligne.
- Utilisez des objectifs différents (2.5X, NA (ouverture numérique) = 0,06 pour les vues panoramiques de la chambre; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) pour les enregistrements de régions d'intérêt.
- Pratiquement, il faut diviser la surface de rabat qui est visible à travers la fenêtre de la chambre en trois zones d'égale hauteur, à savoir, une extrémité proximale, une centrale et une zone distale la plus éloignée de l'entrée vasculaire (Fig. 3F). Pour l'acquisition de l'image, procédez de la manière suivante à chaque point de temps d'observation:
- Numériser l'image des tissus par l'image dans la fenêtre de la chambre de proximal en distal en utilisant l'objectif 5X.
- Dans chaque région du volet, sélectionnez artérioles de deuxième ou de troisième ordre et leurs veinules d'accompagnement avec des motifs de branchement facilement identifiables. Utilisation de l'objectif 5X, 10X, 20X ou, faire des impressions des faisceaux de arteriolovenular afin de facilement relocaliser les faisceaux tout au long de la période d'observation.
- Avec l'objectif 20X et l'objectif 50X, d'autres dossier 5-6 champs capillaires et "apoptotique"champs par zone du volet respectivement. Toutes les images enregistrées avec le 10X et 20X objectifs utilisent la lumière bleue (dextran fluorescent) et feu vert (rhodamine) filtre, alors que les images enregistrées avec la 5X et 50X utilisation objectif lumière bleue (dextran fluorescent) et la lumière blanche (bisbenzimide) filtre, respectivement .
3. Analyse des données enregistrées
NOTE: Avec l'utilisation d'un système d'analyse d'image assistée par ordinateur quantifier tous les paramètres enregistrés hors ligne comme suit 29.
- Mesure de la zone de non-perfusion, du tissu nécrotique respectivement (mm 2).
- Utilisez l'image complète de la chambre numérisée de fenêtre enregistrée avec l'objectif 5X (de 2.6.1) et le dextran fluorescent pour mesurer tissu non-perfusé respectivement nécrotique. Utilisez la fonction "AreaBo" pour mesurer la surface non-perfusé sombre: border la zone non-perfusé et calculer la surface en mm 2 en utilisant Espace des algorithmes de mesure du logiciel.
- La mesure du diamètre microvasculaire dans les artérioles, capillaires et veinules (um).
- Vidéo ou de chargement des images à partir de l'AV-faisceaux enregistrées ou les champs de capillaires dans le logiciel. Pour de meilleurs résultats, utilisez les images fixes ou des vidéos avec le plus fort grossissement où les frontières définitives de la cuve sont clairement visibles.
- Utilisez la fonction "DiamPe" du logiciel pour vous assurer que les mesures sont effectuées perpendiculairement à la paroi de la cuve. Pour ne marquent donc deux points sur le mur de la cuve et avec le troisième clic marque le diamètre perpendiculaire du navire. Le logiciel effectue la mesure en microns.
- Répéter les mesures sur les mêmes bateaux pour tous les enregistrements au même endroit. Mesurer capillaires multiples pour accumuler diamètre moyen.
- Analyse des globules rouges du sang (RBC) vitesse dans les artérioles, capillaires unee veinules (mm / sec).
- Pour des artérioles de globules rouges (RBC) vitesse (mm / s) mesures utilisent la fonction "VeloLSD" du logiciel et choisir les mêmes navires dans la fenêtre dextran fluorescent dont les diamètres ont été mesurés.
- Analyser avec le système d'analyse d'image assistée par ordinateur à l'aide du procédé de changement de vitesse de la ligne, qui se trouve sur la base de la mesure de la vitesse (mm) d'un motif élémentaire de niveau de gris intravasculaire au cours du temps (sec).
- Mesure de débit de sang dans les vaisseaux volumétrique (pl / s).
- Calculer le débit volumétrique du sang (pl / sec) dans artérioles, veinules et les capillaires de RBC vitesse et récipient zone de section transversale (π * r 2) conformément à l'équation de Gross et Aroesty, soit Q = V * π * r 2 , en supposant une forme de cuve cylindrique 30.
- Mesure de la densité capillaire fonctionnelle des capillaires RBC perfusés (perfusion nutritive: cm / cm
- Chargez un domaine capillaire fluorescent enregistré avec objectif 20X dans le logiciel. Utilisez la fonction "DensLA" pour mesurer la densité capillaire fonctionnelle des microvaisseaux RBC perfusés.
- Tracer les capillaires perfusés avec le curseur et marquer les vaisseaux perfusés. Ne pas marquer non-perfusé capillaires, artérioles ou veinules. Le logiciel va mesurer la densité capillaire fonctionnelle des capillaires perfusés en cm / cm 2. Répétez les étapes pour les autres champs capillaires enregistrées.
- Charge de vidéos ou de cadres de champs capillaires fluorescents dans le logiciel. Identifier les navires Gyrose et utiliser la fonction "TorqIx" du logiciel. Suivre le flux des vaisseaux définitive avec le cours et se terminer par un clic droit. Le logiciel seratracer une ligne droite pour la voie directe et le mettra en relation avec la voie tracée.
NOTE: Attention aux signes de l'angiogenèse tels que les bourgeons, les pousses et les capillaires nouvellement formés, qui émanent généralement perpendiculairement à partir des capillaires préexistants. Mesurer la densité de ces vaisseaux nouvellement formés de la manière décrite dans l'étape 3.5.
- Chargez les vidéos bisbenzimide-enregistrées (objectif 50x) dans le logiciel. Utilisez la fonction "DenseNA". Marquer les cellules apoptotiques selon les caractéristiques mentionnées comme la condensation nucléaire, la fragmentation et la marginalisation d'un clic gauche.
- Après avoir marqué toutes les cellules caractéristiques tout au long de la vidéo, cliquez sur "N / A" dans le logiciel, qui comptera automatiquement toutes les cellules marquées et diviser toute la région. Le résultat sera apoptotiquecellules / mm 2.
- Analyser la réponse inflammatoire en comptant le nombre de Rhodamine leucocytes qui ont adhéré à la paroi endothéliale des veinules post-capillaires, pour une période de temps de ≥30 sec ("stickers") et les leucocytes adhèrent de façon intermittente étiquetés (<30 sec, «rouleaux») . Veinulaire adhérence des leucocytes est exprimée en cellules par mm 2 de surface de l'endothélium.
- Évaluer l macromoléculaireeakage en tant que paramètre de la perméabilité microvasculaire après une injection intraveineuse d'un dextrane fluorescent. Densitométrie déterminer plusieurs niveaux de gris dans le tissu directement adjacent à la paroi du vaisseau capillaire (E1), ainsi que dans le plasma acellulaire marginale de la cuve (E2). Puis calculer extravasation macromoléculaire (E) comme le rapport de E1 / E2 31.
4. Soins postopératoires
- Retour de l'animal dans une cage séparée pour éviter la compagnie des autres animaux jusqu'à guérison complète. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. De surveiller les animaux tous les jours de saignement, locale et des signes systémiques d'infection et de la position de la chambre.
- Évaluer l'état général de l'animal par l'observation de l'activité motrice, le poids corporel, les signes de la douleur, de la tolérance à la vinaigrette et auto-mutilation.
- Gardez la souris un par cage pour éviter mutual manipulation de la chambre. Au moindre signe de douleur, appliquer la buprénorphine à une dose de 0,05-0,1 mg / kg de poids corporel, voie sous-cutanée dans des intervalles de 8 h.
5. L'euthanasie et explantation de la Chambre des plis cutanés
- Au jour 10, sacrifier des animaux en utilisant une surdose d'un anesthésique (150 mg / kg pentobarbital).
- Retirer la chambre et un prélèvement de tissu à rabat pour les dosages de protéines immunohistochimiques et moléculaires. Exemples tissus pour l'histologie conventionnelle (formol) et des dosages de protéines quantifiables (azote liquide ou neige carbonique).
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Representative Results
Nécrose
Le critère d'évaluation principal de ce modèle - élévation de nécrose du lambeau de tissu suivant (ie, l'induction de l'ischémie aiguë et persistante) - est à plusieurs reprises mesurée et illustré macroscopique comme le montre la figure 3, sur une période de 10 jours. Délimitation final du rabat nécrose survient généralement entre 5 et 7 jours après l'intervention chirurgicale et est caractérisé par une frange rouge, à savoir, d'une zone de vasodilatation micro-vasculaire et le remodelage, se développant entre le vital proximale et distale de la zone nécrotique du volet (Fig. 3D-F ). Souris témoins non traitées se développent habituellement une zone nécrotique d'environ 50% après 10 jours qui peuvent être divisés en trois zones distinctes: la proximales bien perfusé, la zone centrale intercalé et perfusé critique et la zone distale nécrotique (figure 3F).. Des études antérieures de notre groupe, comme mentionné dans l'introduction, ont montré e de protectionAffecte après des procédures différentes de préconditionnement, qui se caractérisent par un déplacement de la zone perfusée de façon critique à partir de la zone centrale vers la zone distale du rabat.
paramètres de navires
Diamètres microvasculaires et des globules rouges (RBC) -velocity des artérioles et veinules de différents diamètres ainsi que des capillaires voisins sont mesurées et le flux sanguin volumétrique en résulte est calculé hors ligne. Cela permet la corrélation des changements à la fois morphologiques et fonctionnelles des microvaisseaux distinctes du jour 1 au jour 10 (Fig. 4A-B). En outre, la densité des capillaires fonctionnels RBC-perfusés, le paramètre de perfusion nutritive du tissu, est analysé. Les capillaires sont généralement orientées en parallèle et présente avec des diamètres compris entre 3-5 pm dans des conditions physiologiques (Fig. 4C). La circulation du sang, de la densité capillaire fonctionnelle et, éventuellement, la tension d'oxygène de la tissUe diminuer progressivement à partir de proximal à distal pour atteindre un seuil "de viabilité" (Fig. 4C-E), où les capillaires perfusés sont pas plus (Fig. 4E).
Remodelage microvasculaire et l'angiogenèse
Rénovation avec dilatation et une augmentation de la tortuosité des microvaisseaux peut être observée dans tous les groupes expérimentaux soumis à la préparation du volet (c.-à induction d'une ischémie aiguë et persistante. Fig 4F). Cependant, dans ce modèle, le stimulus ischémique seule ne suffit pas à induire l'angiogenèse comme vu par exemple dans une série d'expériences de préconditionnement avec l'érythropoïétine, l'hormone (Fig. 4G-H). Les nouveaux réseaux microvasculaires fonctionnel qui se développent généralement à partir de bourgeons et les pousses microvasculaires émanant perpendiculairement à partir de la pré-existants en parallèles disposés capillaires sont d'abord visible entre le jour 3 et 5.
Réponse inflammatoire (interaction et l'apoptose des leucocytes-endothélial)
Ischémie aiguë et persistante induit généralement une réponse inflammatoire considérable chez les animaux non traités qui est représenté par l'adhésion des leucocytes à l'endothélium microvasculaire. Cette réponse inflammatoire est caractérisée par roulement (par exemple, l'adhérence intermittent de leucocytes à l'endothélium vasculaire) et de collage (par exemple, l'adhérence ferme des leucocytes à l'endothélium vasculaire), les leucocytes (Fig. 5A-B). En outre, une augmentation induite par l'ischémie des cellules apoptotiques peut être vue dans tous les animaux de contrôle avec les signes caractéristiques de la condensation nucléaire, la fragmentation et la margination (Fig. 5C-D). Les deux, l'interaction et l'apoptose des leucocytes-endothélial des signes pour la réponse inflammatoire induite par l'ischémie et augmentent progressivement avec la dysfonction microvasculaire progressive et une baisse de la tension en oxygène du tissu (c.-à- (Fig. 5A-D)).
Figure 1. Illustration de la trame de la chambre de titane et de toutes ses pièces. (A) cadre démonté constitué de deux parties de cadre, trois vis, cinq noix, un morceau de mousse, un verre de couverture et un anneau élastique. (B) les outils nécessaires pour assembler le cadre notamment d'un pilote d'écrou, une pince à anneau de retenue et un coupe-fil. Un tournevis est pas obligatoire mais recommandée si les chambres seront utilisées plusieurs fois. (C) assemblé les pièces à une seule chambre. Gauche: côté arrière du châssis avec deux vis et joint écrous sur les deux trous inférieurs. La face arrière est utilisé pour suturer le cadre sur la peau et qui porte le rabat. Droite: assemblées côte devantle cadre de mousse attachée à garantir l'étanchéité. Notez que les trois trous de vis sont exempts de mousse. Assurez-vous qu'aucun de la mousse sera pressée dans la fenêtre d'observation, qui porte le couvercle en verre. (D) Schéma assemblé cadre de la chambre sans pli cutané dorsal.
Figure 2. Illustration de la procédure de rabat opératoire et sa mise en œuvre dans la chambre du pli cutané dorsal de titane de la souris. (A) Elevated trans-éclairé doublé dorsale pli cutané de la souris pour visualiser l'architecture vasculaire pour tracer la position de la chambre dorsale du pli cutané. (B) La face arrière de l'armature de titane de la chambre a été placée et alignée sur les navires. L'incision de deux trous pour des vis pour fixer la partie avant du châssis haa été. (C et D) Décrivant du volet sur la peau du dos latéralement: Le rapport largeur-longueur est de 15 mm à 11 mm tout en centralisant les deux navires découlant perpendiculairement. Une distance de 2 mm pour le côté opposé (de zone non marquée entre mince contour de rabat et bordure épaisse) sera utilisé pour saisir la peau avec une pince à élever le rabat. Pour l'observation de la face arrière de la peau à travers la fenêtre de la chambre, le tissu supplémentaire doit être enlevé (zone hachurée). (E) latéralement en plongée basé lambeau de peau, ce qui montre l'architecture vasculaire disposés de manière aléatoire provenant de la base du volet. La zone hachurée a été coupé, mais est encore attaché à la patte et est retiré à l'étape suivante (suspendu peau en dessous des pinces). (F) de montage du côté arrière du châssis de chambre. La surface de la peau de la patte est à l'arrière et la surface "brut", sous le côté de la fenêtre en verre. Les vis de chamber`s sont coincés Through les trous sur les deux côtés du pli cutané dorsal incisé. (G) La peau environnante, en avant et en arrière, le rabat de fixation dans les trous de la jante de la chambre supérieure. (H) Le lambeau de peau est allongé et également suturé à la face arrière du cadre. Afin d'éviter la déshydratation de la trappe, une solution de chlorure de sodium à 0,9% est égouttée sur le volet de manière répétée. (I) Le volet et la peau environnante est complètement fixé dans les trous de la jante de la chambre supérieure. Le lambeau est suturé latéralement dans la peau du dos adjacent à garantir l'étanchéité de la chambre. (J) de montage de la contre-mousse portant de l'armature, qui entoure la fenêtre d'observation. Chambre (K) monté complètement: Un verre de couverture est fixé aux fenêtres d'observation et scellé avec un jonc. Une troisième vis est fixée à la partie supérieure du cadre pour l'étanchéité supplémentaire. La fenêtre de la chambre permet des analyses répétées de la microvasculature du volet par microscopie intravitale. Pour faciliter l'accès au cours de microscopie les trois vis sont raccourcies. (L) de souris Awake et se déplaçant avec chambre dorsale du pli cutané monté.
Figure 3. Présentation du développement morphologique et la démarcation de la nécrose du lambeau à 0 jours (immédiatement après la préparation volet, A), 1 (B), 3 (C), 5 (D), 7 (E) et 10 (F) . nécrotique démarcation finale a lieu entre les jours 5 et 7 (D et E). Les contrôles démontrent une zone distincte de démarcation dans la zone de rabat central, y compris une frange rouge et un faux du blanc (le double flèche et astérisque dans E), reflétant une réponse hyperémique et microvasculaire remodelage ainsi que d'un tissu non-perfusé mais potentiellement viable zone délimitant développer une nécrose distale (E). Dans le panneau F, le volettissu est divisé en trois zones distinctes par deux lignes horizontales: la zone proximale bien perfusé (à la base de l'image), la zone centrale perfusé critique (y compris la frange rouge un blanc "faux du lunatica" correspondant à la pénombre ischémique cérébrale tissus après une blessure de la course) et la zone distale nécrotique (circonférence marqué par une bordure rouge). Grossissement 16X.
Figure 4. Intravitale épi-fluorescence microscopie afficher des images de arteriovenular (AV) faisceaux (A, B), les champs capillaires (C, D, E) et des changements morphologiques tels que le remodelage (F) et l'angiogenèse (G, H). Microscopie intravitale montrant le même faisceau AV à un animal témoin (A, B) au jour 1 (A) et 10 (B). Notez l'absence de réponse dilatoire dans les contrôles sur l'ensemble de la période d'observation à la fois arteriolar (a) et de veinules (v) de diamètre. Images C, D et E démontrent parallèlement capillaires disposés dans la zone proximale bien perfusé (C), d'une zone de transition centrale perfusé critique (D) et la zone non perfusée nécrose distale (E) du tissu de la patte ischémique. Chez les souris perfusés critique de la zone centrale de contrôle ne montrent remodelage vasculaire (F), caractérisé par en parallèles disposés capillaires avec dilatation et une augmentation de la tortuosité. En revanche, les souris recevant l'érythropoïétine avant rabat élévation comme un préconditionnement régime montrent nouvellement formés et découlant perpendiculairement capillaires, qui se distinguent nettement des capillaires préexistants normales (G, H). Cette réponse angiogénique n'a pas été observé chez les témoins. Amélioration du contraste avec le dextran fluorescent 150.000. Grossissement 80X.
Figure 5. </ Strong> Intravitale épi-fluorescence microscopie affichage AV-faisceaux dans la zone bien perfusé proximale de rabat (A) et la zone ischémique central de transition perfusé critique du tissu (B). A noter la présence accrue de l'adhérence des leucocytes (flèches) en veinules post-capillaires (v) et artérioles (A) dans la zone de rabat ischémique (B) par rapport à la zone proximale sain (A). Amélioration du contraste avec la rhodamine. Grossissement 80X. Intravitale microscopie à épifluorescence condensation nucléaire affichage indiquant la mort par apoptose des cellules à l'intérieur de l'extrémité proximale (C) et perfusé critique zone de rabat central (D) de contrôle. Une augmentation du nombre de cellules apoptotiques (flèches blanches) est observée à l'intérieur de la zone de transition centrale plus ischémique (D) par rapport à la zone proximale (C). Amélioration du contraste avec bisbenzimide. Grossissement 250X.
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Discussion
Afin de diminuer les complications ischémiques et ainsi améliorer le résultat clinique, une connaissance plus approfondie des processus physiopathologiques dans le tissu rabat perfusé critique est nécessaire. Le développement de nouveaux modèles animaux qui miment l'ischémie aiguë et persistante est donc obligatoire. En conséquence, nous avons pu développer un modèle facilement reproductible et fiable permettant l'évaluation en temps réel morphologique, dynamique et fonctionnel répétitif de divers paramètres de muscle et de la vascularisation de la peau qui peuvent être corrélées avec l'analyse immunohistochimique et moléculaire du tissu rabat échantillonnée.
L'intervention chirurgicale ne nécessite pas de compétences chirurgicales spécifiques, bien pratique et une certaine dextérité manuelle est nécessaire. Une courbe d'apprentissage d'environ 25-30 animaux opérés est généralement nécessaire de maîtriser le montage de la chambre dorsale du pli cutané et la préparation du volet correctement. Dans des mains expérimentées, le temps pour la chirurgie des moyennes de 35 minutes. Crucialétapes de la préparation du volet comprennent le placement correct et les grandes lignes du volet au centre de la fenêtre de la chambre avec un positionnement précis des principaux vaisseaux à être sectionné (avec trans-illumination) et l'élimination minutieuse de la couche de gélatine-comme-dessus de la panniculus carnosus en utilisant un grossissement de l'image pour améliorer la qualité de l'image.
Depuis dimensions de volets sont données en millimètres, nous vous recommandons d'utiliser un pied à coulisse pour le marquage correct rabat. Si il ya des difficultés, tout en positionnant les vaisseaux dominantes disposées horizontalement dans la fenêtre de la chambre, il faut plutôt choisir un plus distale que une position plus proximale des vaisseaux. Le positionnement correct de ces navires qui transversale de la fenêtre de la chambre, garantit sectionnement de ces tout en élevant le rabat de distal à proximal et résultats dans un volet perfusé au hasard. En d'autres termes, l'absence de transect ces grands vaisseaux se traduira par une perfusion axialemotif sans nécrose du tissu sous la fenêtre. L'étape cruciale finale au cours de la préparation chirurgicale est relative au retrait de la couche de tissu cellulaire comme la gélatine. L'expérience a montré que les dommages de suppression excessive de la panniculus carnosus sous-jacent et donc la délicate disposées horizontalement capillaires musculaires. Au contraire, des résultats d'enlèvement conservatrices œdème formation et la visibilité finalement limité de régions d'intérêt au cours de la microscopie. Si toutes ces étapes sont maîtrisées avec soin, le volet se développe très permanence environ 50% de nécrose 10 jours après rabat élévation. Ceci permet l'étude de diverses stratégies thérapeutiques qui peuvent améliorer ou aggraver la survie du tissu rabat. Enfin, la méthode de microscopie à fluorescence intravitale est une procédure bien établie pour évaluer la perfusion tissulaire microvasculaire et peut être appris très rapidement.
Le principal inconvénient de ce modèle est la durée d'observation limitée du tissu à l'intérieur de la chambre217; s fenêtre d'environ 10 à 14 jours après la préparation rabat. Ceci est dû au relâchement progressif de l'extrémité proximale de la peau à la chambre de pli cutané dorsal qui résulte finalement en inclinaison latérale de la chambre. Rarement, la peau en sandwich fixe sort du cadre de la chambre et rend impossible la microscopie. Depuis nécrose est le plus souvent entièrement délimitée entre 5 et 7 jours après la chirurgie, cela ne compromet pas vraiment l'acquisition de données avant de basculer de la chambre ou en tirant sur la peau à l'intérieur de la chambre.
Avantages du modèle comprennent reproductibilité facile et l'utilisation potentielle des animaux génétiquement modifiés. La taille relativement petite de la fenêtre qui peut être évaluée pourrait toutefois compromettre l'importance de traduire les résultats en conditions humaines. En outre, il existe des différences anatomiques entre les animaux et les humains à la peau lâche. Alors que les animaux et les outils chirurgicaux ont un rapport coût-efficacité raisonnable, le hard- et les logiciels nécessaires pour effectuer la microscopie (épi-illumination microscope, caméra à haute résolution, des colorants fluorescents et un logiciel spécial pour l'analyse des données hors ligne) représente un investissement plus important.
Conclusion:
Nous présentons un temps et modèle animal rentable chez les souris qui permet la visualisation et la quantification des paramètres de la microcirculation à haute résolution. Cette approche représente une méthode idéale pour analyser les tissus lambeau musculo-perfusé critique et les mécanismes cellulaires sous-jacents. Les modifications morphologiques de régions d'intérêt peuvent être étudiés de façon répétée et en corrélation avec des modifications fonctionnelles sur un microvasculaire et le niveau cellulaire. Après intravital microscopie épi-fluorescence, le tissu peut encore être traité en utilisant des approches moléculaires et histologiques.
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Acknowledgments
Nous remercions Katharina Haberland pour l'édition d'image. Financement: L'auteur principal a reçu une subvention de la KKF Technische Universität München à mettre en place un nouveau laboratoire de recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
