En<em> In Vitro</em> Modell for studier av Cellular Patofysiologi i Globoid Cell leukodystrophy
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
Den nøyaktige funksjon av flerkjerneholdige mikroglia, kalt Globoid celler, som er unikt rikelig i det sentrale nervesystemet av Globoid celle leukodystrophy (GLD) er uklart. Dette gap i kunnskap er blitt hindret ved mangelen på en egnet in vitro-modell for studiet. Heri beskriver vi en primær murine glial kultur system der behandling med psychosine resultater i multinucleation av mikroglia ligner de karakteristiske Globoid celler som finnes i GLD. Ved hjelp av denne romanen system, vi definerte vilkår og moduser av analyse for studie av Globoid celler. Den potensielle bruken av denne modellen systemet ble validert i vår forrige undersøkelse, som identifiserte en potensiell rolle for matriksmetalloproteinase (MMP) -3 i GLD. Denne novel in vitro-system kan være en nyttig modell for å studere dannelsen og funksjon, men også den potensielle terapeutiske manipulering av disse unike celler.
Introduction
Globoid celle leukodystrophy (GLD), også kjent som Krabbe sykdom, er en dødelig demyeliniserende sykdom som følge av tap av funksjon mutasjoner i galatocerebrosidase (galc) gen 1. Den mest utbredte formen for GLD er den infantile variant som er preget av utbruddet i tidlig barndom og preget av en aggressiv klinisk løpet av motor og kognitiv svikt som fører til tidlig død ofte før fem år 2,3. Genetisk testing brukes til å bekrefte en diagnose av GLD fire. Nevropatologi av GLD avslører utbredt demyelinisering, neuronal atrofi, astrogliosis og tilstedeværelse av engorged flerkjerneholdige mikroglia kalt Globoid celler 5-7. Identifiseringen av Globoid celler, ofte inneholder tubulous slutninger i sin cytoplasma, har vært et definerende trekk ved GLD for de siste 97 år, selv om den spesifikke funksjonen til disse synlige celler har vært unnvikende.
Involvering av ikke-myelinating gliaceller (mikroglia og astrocytter) i patogenesen av GLD har lenge vært betraktet som en sekundær reaksjon på den dype demyelinisering i denne sykdommen åtte. Interessant, den første beskrivelsen av denne sykdommen, laget av Knud Krabbe i 1916 5, rapportert dannelse av multinucleated fagocytter som inneholder lipid rusk som har blitt kalt "Globoid celler" og er et særtrekk ved denne sykdommen.
Globoid Celler er særtrekket GLD patologi, selv om deres rolle i GLD har lenge blitt ignorert. Interessant nok har disse celler er blant de tidligste karakteristiske forandringer i CNS-vev av GLD. Denne mangelen på kunnskap kan ha vært på grunn av antagelsen om at dannelsen av multinucleated phagocytes, kalt gigantiske celler i andre sykdommer, er vanligvis betraktet som en konsekvens av patologi i stedet for en innledende patogene pådriver ni. Derfor har det vært få studier som undersøker den mekanismen which Globoid celler blir dannet fra fagocytter, særlig i CNS av GLD. Prosedyren er beskrevet i denne rapporten fokuserer på viktigheten av Globoid celle formasjon i CNS og vår forrige demonstrasjon at psychosine-indusert multinucleation av mikroglia in vitro, og disse cellene viste høyere nivåer av fagocytisk aktivitet. I samsvar med disse observasjonene, Globoid celler i twitcher hjerner ofte inneholde PAS-positive rusk, noe som tyder på høye nivåer av fagocytisk aktivitet. Globoid celler er også funnet å være immunopositive for ferritin (en mikroglia markør) 10, KP-1 / CD68 (en monocyte markør), og noen er også positivt for vimentin (en mellomliggende filament protein og markør for astrocytter og aktivert mikroglia) 11, HLA-DRA (en MHCII overflate-reseptor), og TNF-α 7, og Iba-1 (en kalsium-bindende protein som brukes for å identifisere mikroglia) 12. Basert på denne samlingen av markører, Globoid celler stammer fra mikroglia som utvikleren unik fenotype.
Til tross for sin unikhet, har den ønskede funksjonen og bidrag GCS til GLD patogenesen vært i stor grad oversett. Globoid celler har blitt antatt å være en sekundær konsekvens av kronisk demyelinisering. Imidlertid har tidligere studier som undersøker tidsmessig assosiasjon av Globoid celler til hvit substans patologi GLD identifisert tilstedeværelsen av Globoid celler i slutten av embryonale til tidlig postnatal perioder; ganger foregående oligodendrocyte apoptose og utilslørt demyelinisering 13. Således foreslår den tidsmessige sekvens av utviklingen av nevro i GLD Globoid at cellene er dannet i forkant av demyelinisering i denne sykdommen 14. Dette førte til vår hypotese om at den tidlige dannelsen av Globoid celler i GLD kan representere et definerende sykdomsfremkallende hendelse i stedet for en sekundær, reaktiv respons på oligodendrocyte skade 15. I tillegg har feilregulering av microglial aktivitet i GLD vært betraktet som en factor begrense den langsiktige effekten av hematopeotic stamcelleterapi for behandling av denne sykdommen 16. Dermed undersøke cellulære funksjoner og regulering av mikroglia og Globoid celler, som svar på psychosine forventes å gi ny innsikt i patogenesen av GLD.
Inntil nylig, var mangelen på en egnet modell for å studere cambered celledannelsen begrenset forståelse av den nøyaktige funksjon og bidraget av disse cellene til patologien av GLD. I nyere studier, ble det fastslått at Globoid-lignende celler kan dannes i direkte respons til psychosine, en patogen lipid gift som akkumuleres i GLD. Vi fant ut at mikroglia, men ikke makrofager, aktiveres og forvandlet til Globoid celler i primær glial kulturer som svar på psychosine 15. Denne transformasjonen til Globoid celler ble funnet å være mediert av ekstracellulær protease, matriksmetalloproteinase (MMP) -3 15. Mer nylig, har vihar utvidet disse funnene og fastslo at psychosine-aktivert microglia og Globoid celler utviklet i denne in vitro modellsystemet er potent giftig for oligodendrocytter og oligodendrocyte stamceller. Derfor, når vurderes i sammenheng med GLD, tidlig opphopning av psychosine og dannelse av Globoid celler før demyelinisering ville støtte en ny primær og muligens patogene rolle for mikroglia i denne sykdommen.
Vi foreslår at studiet av Globoid celle formasjon vil avdekke ny informasjon om patogenesen av GLD som vil bidra til vår forståelse av denne sykdommen. Videre kan denne nye cellemodell av GLD gi et nytt format for nye terapeutiske tilnærminger for å løse patologiske forandringer i denne sykdommen kan bli testet. Derfor, i denne rapporten gir vi en detaljert protokoll for in vitro utvikling av psychosine-indusert Globoid celler fra primærkulturer av ikke-myelinating gliaceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet heri gir en ny modellsystem for å studere utviklingen og funksjonell karakterisering av aktiverte mikroglia og Globoid celler. Før arbeid av Im et al. ved hjelp av en HEK293 cellelinje gitt en mal for utvikling av denne protokoll for studiet av Globoid celle formasjon 21. Det er også viktig å påpeke at de Globoid celler avledet i modellen skiller seg fra de innfødte Globoid celler identifiserbare i GLD. For eksempel har vi rutinemessig observert quadranucleation av mikr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter’s Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O’Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
