Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

En doi: 10.3791/51903 Published: October 21, 2014

Abstract

Den nøyaktige funksjon av flerkjerneholdige mikroglia, kalt Globoid celler, som er unikt rikelig i det sentrale nervesystemet av Globoid celle leukodystrophy (GLD) er uklart. Dette gap i kunnskap er blitt hindret ved mangelen på en egnet in vitro-modell for studiet. Heri beskriver vi en primær murine glial kultur system der behandling med psychosine resultater i multinucleation av mikroglia ligner de karakteristiske Globoid celler som finnes i GLD. Ved hjelp av denne romanen system, vi definerte vilkår og moduser av analyse for studie av Globoid celler. Den potensielle bruken av denne modellen systemet ble validert i vår forrige undersøkelse, som identifiserte en potensiell rolle for matriksmetalloproteinase (MMP) -3 i GLD. Denne novel in vitro-system kan være en nyttig modell for å studere dannelsen og funksjon, men også den potensielle terapeutiske manipulering av disse unike celler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Globoid celle leukodystrophy (GLD), også kjent som Krabbe sykdom, er en dødelig demyeliniserende sykdom som følge av tap av funksjon mutasjoner i galatocerebrosidase (galc) gen 1. Den mest utbredte formen for GLD er den infantile variant som er preget av utbruddet i tidlig barndom og preget av en aggressiv klinisk løpet av motor og kognitiv svikt som fører til tidlig død ofte før fem år 2,3. Genetisk testing brukes til å bekrefte en diagnose av GLD fire. Nevropatologi av GLD avslører utbredt demyelinisering, neuronal atrofi, astrogliosis og tilstedeværelse av engorged flerkjerneholdige mikroglia kalt Globoid celler 5-7. Identifiseringen av Globoid celler, ofte inneholder tubulous slutninger i sin cytoplasma, har vært et definerende trekk ved GLD for de siste 97 år, selv om den spesifikke funksjonen til disse synlige celler har vært unnvikende.

Involvering av ikke-myelinating gliaceller (mikroglia og astrocytter) i patogenesen av GLD har lenge vært betraktet som en sekundær reaksjon på den dype demyelinisering i denne sykdommen åtte. Interessant, den første beskrivelsen av denne sykdommen, laget av Knud Krabbe i 1916 5, rapportert dannelse av multinucleated fagocytter som inneholder lipid rusk som har blitt kalt "Globoid celler" og er et særtrekk ved denne sykdommen.

Globoid Celler er særtrekket GLD patologi, selv om deres rolle i GLD har lenge blitt ignorert. Interessant nok har disse celler er blant de tidligste karakteristiske forandringer i CNS-vev av GLD. Denne mangelen på kunnskap kan ha vært på grunn av antagelsen om at dannelsen av multinucleated phagocytes, kalt gigantiske celler i andre sykdommer, er vanligvis betraktet som en konsekvens av patologi i stedet for en innledende patogene pådriver ni. Derfor har det vært få studier som undersøker den mekanismen which Globoid celler blir dannet fra fagocytter, særlig i CNS av GLD. Prosedyren er beskrevet i denne rapporten fokuserer på viktigheten av Globoid celle formasjon i CNS og vår forrige demonstrasjon at psychosine-indusert multinucleation av mikroglia in vitro, og disse cellene viste høyere nivåer av fagocytisk aktivitet. I samsvar med disse observasjonene, Globoid celler i twitcher hjerner ofte inneholde PAS-positive rusk, noe som tyder på høye nivåer av fagocytisk aktivitet. Globoid celler er også funnet å være immunopositive for ferritin (en mikroglia markør) 10, KP-1 / CD68 (en monocyte markør), og noen er også positivt for vimentin (en mellomliggende filament protein og markør for astrocytter og aktivert mikroglia) 11, HLA-DRA (en MHCII overflate-reseptor), og TNF-α 7, og Iba-1 (en kalsium-bindende protein som brukes for å identifisere mikroglia) 12. Basert på denne samlingen av markører, Globoid celler stammer fra mikroglia som utvikleren unik fenotype.

Til tross for sin unikhet, har den ønskede funksjonen og bidrag GCS til GLD patogenesen vært i stor grad oversett. Globoid celler har blitt antatt å være en sekundær konsekvens av kronisk demyelinisering. Imidlertid har tidligere studier som undersøker tidsmessig assosiasjon av Globoid celler til hvit substans patologi GLD identifisert tilstedeværelsen av Globoid celler i slutten av embryonale til tidlig postnatal perioder; ganger foregående oligodendrocyte apoptose og utilslørt demyelinisering 13. Således foreslår den tidsmessige sekvens av utviklingen av nevro i GLD Globoid at cellene er dannet i forkant av demyelinisering i denne sykdommen 14. Dette førte til vår hypotese om at den tidlige dannelsen av Globoid celler i GLD kan representere et definerende sykdomsfremkallende hendelse i stedet for en sekundær, reaktiv respons på oligodendrocyte skade 15. I tillegg har feilregulering av microglial aktivitet i GLD vært betraktet som en factor begrense den langsiktige effekten av hematopeotic stamcelleterapi for behandling av denne sykdommen 16. Dermed undersøke cellulære funksjoner og regulering av mikroglia og Globoid celler, som svar på psychosine forventes å gi ny innsikt i patogenesen av GLD.

Inntil nylig, var mangelen på en egnet modell for å studere cambered celledannelsen begrenset forståelse av den nøyaktige funksjon og bidraget av disse cellene til patologien av GLD. I nyere studier, ble det fastslått at Globoid-lignende celler kan dannes i direkte respons til psychosine, en patogen lipid gift som akkumuleres i GLD. Vi fant ut at mikroglia, men ikke makrofager, aktiveres og forvandlet til Globoid celler i primær glial kulturer som svar på psychosine 15. Denne transformasjonen til Globoid celler ble funnet å være mediert av ekstracellulær protease, matriksmetalloproteinase (MMP) -3 15. Mer nylig, har vihar utvidet disse funnene og fastslo at psychosine-aktivert microglia og Globoid celler utviklet i denne in vitro modellsystemet er potent giftig for oligodendrocytter og oligodendrocyte stamceller. Derfor, når vurderes i sammenheng med GLD, tidlig opphopning av psychosine og dannelse av Globoid celler før demyelinisering ville støtte en ny primær og muligens patogene rolle for mikroglia i denne sykdommen.

Vi foreslår at studiet av Globoid celle formasjon vil avdekke ny informasjon om patogenesen av GLD som vil bidra til vår forståelse av denne sykdommen. Videre kan denne nye cellemodell av GLD gi et nytt format for nye terapeutiske tilnærminger for å løse patologiske forandringer i denne sykdommen kan bli testet. Derfor, i denne rapporten gir vi en detaljert protokoll for in vitro utvikling av psychosine-indusert Globoid celler fra primærkulturer av ikke-myelinating gliaceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i samsvar med politikken på human behandling og bruk av forsøksdyr fastsatt av Office of Laboratory Animal Welfare (NIH) og bare med godkjenning fra Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Universitetet i Connecticut Health Center.

1. Utarbeidelse av Mixed Glial kulturer

  1. Steriliser alle instrumenter før bruk. Tilsett 3 ml av iskald steril Hanks balanserte saltløsning (HBSS) inneholdende ingen kationer (Mg 2 + eller Ca 2 +) til tre sterile 60 mm petriskåler opprettholdt på is for å holde kalde.
  2. Isolere cortices fra postnatal P0-P2 museunger, som tidligere beskrevet 17,18.
    MERK: subkortikale strukturer, slik som hippocampi, er ikke inkludert i disse kulturene.
  3. Fjern forsiktig hjernehinnene og deretter overføre de isolerte cortices til frisk HBSS og distansere vev enzymatisk, ved hjelp av en neural vev disseksjon kit i henhold til produsentens protokoll.
  4. Plate cellene inn i sterile T-175 kolber og inkuber over natten i medier [Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) inneholdende 1 x penicillin / streptomycin].
  5. Bytt ut alle medier dagen etter med fersk medier. Fortsett å ruge kulturer, med regelmessige medie endringer, for ca 3 uker eller til en mobil monolayer er etablert.
    MERK: Dette monolayer vil bestå av astrocytter og mikroglia med en ca 10: 1 ratio 19.

2. Globoid Cell Induksjon i Mixed Glial kulturer

  1. Forbered ECM-belagt dekkglass.
    1. Sug sirkulære dekkglass med steril 1 N saltsyre (HCl), i en steril petriskål i 30 min. Vask Dekk med sterilt vann 3x og deretter suge i 95% EtOH i minst 20 min. og deretter la lufttørke.
    2. Plasser dråper av utvannet ekstracellulære matriseix (ECM) protein overtrekksmaterialer på et ark av Parafilm (for eksempel 150-250 mL / dråpe av laminin 10 pg / ml, oppløst i steril fosfatbufferoppløsning [PBS]). Fordel dråpene slik at Dekk ikke vil berøre når den plasseres på disse dråpene. Forsiktig plassere hvert tørket dekkglass på en dråpe med tang.
    3. La Dekk på dråpene i ca. 4-6 timer inne i kulturen hette med rammen lukket.
    4. Plasser ECM-belagte dekkglass (ECM-belagte side opp) inn i hver av brønnene i en 24-brønns plate. Vask hver brønn med sterilt PBS 3x og holde ved 4 ° C inntil nødvendig.
  2. Forbereder gliaceller for belegging på Dekk.
    1. Aspirer medier fra glial kulturer og forsiktig vaske glial ettlagskulturer 3x med 10 ml sterilt PBS. Deretter legger 8-10 ml trypsin-EDTA-løsning til T-175, og inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C.
    2. Når mesteparten av monolaget er blitt løsnet, tilsett 20 ml komplett mediertil kolben for å stoppe trypsinisering. Samle mediet som inneholder de frittliggende cellene i et 50 ml konisk rør og spinn i 10 min ved 300 x g ved romtemperatur.
    3. Aspirer supernatanten uten å forstyrre pelleten, og deretter re-suspendere cellene i 2 ml friskt komplett medier ved forsiktig pipettering oppløsningen ved hjelp av en pipette P1000.
    4. Bestem antall celler ved hjelp av et hemocytometer, og deretter re-suspendere celler i fullstendig medium ved den ønskede tetthet (for eksempel 10 5 celler / ml). Plate cellene til ECM-belagte dekkglass (for eksempel 500 ul i hver brønn av 24-brønns plate). Legg ytterligere frisk fullstendige media til hver brønn for 3-5 dagers inkubasjon ved 37 ° C, eller inntil cellene vokse til den ønskede visuelle løpet.
  3. Behandling med Psychosine.
    1. Rekonstituer psychosine til en lagerkonsentrasjon (108,3 mM) i dimetylsulfoksyd (DMSO). Fortynne denne bestanden i 100% EtOH å lage en fungerende aksje som kann bli lagt inn i hver brønn av 24-brønners plate for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 10 uM.
    2. På tidspunktet for å legge til psychosine, forsiktig virvel kultur plate å blande psychosine i kulturmedier. Supplement psychosine ved tilsetning av tilsvarende 10 uM hver annen dag i en uke.
  4. Etter 7 dager med psychosine behandling, samle media og pipette 500 mL av kulde 4% paraformaldehyde (PFA) i hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter for å løse cellene. Deretter vaskes hver brønn 3 ganger med PBS og deretter holde platene ved 4 ° C inntil bearbeidet for immunocytokjemi (se nedenfor).
    MERK: cellekultur media kan samles for enzymatisk eller ELISA-analysen på dette punktet hvis ønskelig.

3. Immunocytochemistry (ICC) for å visualisere Globoid Cells

  1. Erstatt PBS med blokkeringsbuffer [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% normalt geiteserum (NGS)], og inkuberes cellene i 1 time ved romtemperatur.
  2. Icubate de faste celler i primære antisera mot Iba-1-[(1: 1,000) fortynnet i PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] i minst 1 time ved romtemperatur, deretter vaske hver brønn med PBS 3 x 5 min / vaske.
  3. Tilsett passende sekundære fluorescens-konjugert antistoff for å identifisere det primære antistoff merking og kontra flekken med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1,000) for å identifisere kjerner. Inkuber i sekundær antistoff-løsning i 1 time ved romtemperatur og vaskes med PBS 3 x 5 min.
  4. Monter hver coverglass mikroskop lysbilder ved hjelp av en monteringsmedium. Vis lysbilder på en fluorescerende mikroskop for visuelle og kvantitative analyser.

4. Analyse og karakterisering av Globoid Celler i Primær Kultur

  1. Bruk følgende tre morfologiske kriterier for å identifisere en Globoid celle i kultur:
    1. Identifiser Globoid celler ved hjelp av fluorescerende mikroskopi av immunopositive merking for microglial markør, Iba-1 +.
    2. IdentifiserGloboid celler som polynucleated (dvs. som inneholder to eller flere DAPI positive kjerner).
    3. Identifiser Globoid celler ved en avrundet morfologi skiller seg fra svært forgrenet utseendet hviler microglial celler.
      MERK: Celler kan også samles for celleoverflaten markør analyse og kvantifisering av flowcytometri fra disse kulturene.
  2. Måle phagocytic aktivering av mikroglia og Globoid celler
    1. For å vurdere fagocyttisk aktiviteten psychosine behandlet mikroglia, legge FITC-merket latekskuler til brønnene i henhold til produsentens instruksjoner. Legg fluorescerende-konjugerte latex perler 48 timer før fiksering med PFA. Fix celler behandlet med perler (som nevnt i § 2.4), og prosessen for immunocytochemistry (som beskrevet i avsnitt 3).
    2. Velg fluoroforen-konjugerte sekundære antistoffer slik at de ikke overlapper fluorescensemisjonen spektra av fluoroforen som er merket perler.
    3. Analyze de phagocytotic profiler av Iba-1 + mikroglia ved å identifisere de cellene som co-lokalisere med fluorescently-merket perler.
      MERK: Psychosine vil aktivere microglia. Fagocytterte perler vil bli identifisert innen mononukleærerte og multinucleated Iba-1 + celler i denne innstillingen kultur.

5. Induksjon av Globoid Celler fra Purified microglial kulturer

MERK: En alternativ tilnærming til å dechiffrere intracellulære signal mellom astrocyte og mikroglia er en annen fordel med denne in vitro Globoid celle modell. Rensing av primære microglial celler for replating eller co-dyrking kan oppnås ved deres lavere tilslutning eiendom i kultur, slik det er beskrevet i følgende trinn (se punkt 5.2).

  1. Samle medier fra konfluent blandede glial kulturer inn i 50 ml konisk rør og vedlikeholde den ved 37 ° C i kuvøse.
  2. Microglial Isolasjon fra Primær Mixed Glial kulturer.
    1. Etter fjerning av mediet fra en sammenflytende kultur blandet glial T175 kolbe, legge varme risting medier [som består av komplette medier + 25 mM 4-(2-hydroksyetyl) -1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) + 25 mM natriumbikarbonat (Sigma)]. Rist kolbene i 3-4 timer på en orbital-rysteapparat ved 100 rpm (37 ° C). Samle media fra disse rystet kolber inn 50 ml koniske rør.
      MERK: Dette mediet vil omfatte mindre tilhenger mikroglia fra kolbene.
    2. Spin mediet ved 300 xg i 10 min ved romtemperatur. Aspirer supernatanten og deretter re-suspendere cellene i 2 ml av astrocyte kondisjonerte media (samlet i trinn 5.1).
    3. Etablere antall celler anskaffet ved hjelp av en hemocytometer og deretter plate microglial celler på substrat-belagt dekkglass (se punkt 2.1) for immunocytokjemi, eller plate på ultralav tilslutning brønners plater for fremtidig samling av Globoid celler for co-kultur med andre celletyper, slik som oligodendrocytter (som described i neste avsnitt).
      MERK: Når belagt på mikroglia kan behandles med psychosine (10 uM) som beskrevet ovenfor (se avsnitt 2.3).
  3. Co-kultur med Primary oligodendrocytter for analyse av cytotoksisitet.
    MERK: Samling av psychosine behandlet mikroglia fra de lave adherens plater for etterfølgende ko-kultur på primærkulturer av oligodendrocytter eller oligodendrocyte stamceller, kan brukes til å undersøke den potensielle cytotoksiske funksjon av disse cambered-lignende celler in vitro.
    1. Utvikle kulturer av primær oligodendrocytter gjennom etablerte metoder 18,20. Å samle psychosine behandlet mikroglia, forsiktig pipettér å løsne løst heftende celler fra bunnen av brønnene. Samle cellene, sentrifuger ved 300 xg i 10 min, og deretter forsiktig resuspender i oligodendrocyte differensiering medier [sammensatt av Neurobasal medier, L-glutamin (1x), B-27 supplement (1x), og trijodtyronin (T3, 10 ng / ml )].
    2. Tell antall celler ved hjelp av et hemocytometer og deretter seede de mikroglia bort på oligodendrocyte kultur på en 5 x 10 celler / ml, noe som resulterer i en omtrentlig 1: 2 mikroglia / oligodendrocyte forhold. Inkuber som en co-kultur i inntil 3 dager.
    3. Fix cellene for immunocytochemistry (se kapittel 2.4). Samle cellekulturmedier for ELISA eller kjemiske analyser etter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen, som skrevet, er ventet å ta ca 36 dager å fullføre fra start til slutt (Se Figur 1: Experimental Arbeidsflyt Scheme). Det har vært vår erfaring at utviklingen av "Globoid-lignende celler i denne primære kultur systemet er både pålitelig og reproduserbar: dannelsen av flerkjernede celler i respons til psychosine er konsekvent observert med 7 dagers behandling.

Immuncytokjemisk farging av mikroglia bruker Iba-en i forbindelse med et kjernefysisk mot flekken vil muliggjøre identifisering av store, avrundede flerkjernede celler (Figur 1b). I noen tilfeller atominnholdet i disse Globoid-lignende celler, vises med distinkte kjerner. Imidlertid, i mange tilfeller, brutto forstørrelse av størrelsen av kjernen reflekterer multinucleated statusen til disse celler (Figur 1b). Antallet Globoid-lignende celler kan variere fra synsfeltet til synsfeltet,men det er verdt å merke seg at andelen av Globoid celler dannet in vitro representerer <5-10% av den totale microglial cellepopulasjon. Det er også viktig å påpeke at psychosine behandling fremkaller også en generalisert aktivering av mikroglia (dvs. målbar økning i phagocytic aktivitet) som oppstår i respons til psychosine behandling blant mononukleærerte mikroglia og multinucleated Globoid celler (GCS) i disse kulturene. Som vist i figur 1c, kan phagocytically aktive profiler av Iba-1 + mikroglia lett identifiseres da satt i ko-kultur med oligodendrocyte progenitorceller (OPCs).

Dette cellekultursystem er mottagelig for eksperimentell manipulasjon som et middel for å vurdere biologi Globoid celler. For eksempel har vi nylig vist et nytt rolle for ekstracellulær protease, matriksmetalloproteinase-3 (MMP-3 / stromelysin-1) som en viktig mediator av psychosine-indusert GC-dannelsen ved hjelp av denne blindture assay 15.

Figur 1
Figur 1:. Experimental Arbeidsflyt for Primær Culture in vitro modell av Globoid celle formasjon (A) Flytskjema som viser de viktigste trinnene og intervenere ganger (i dager) for utvikling av Globoid celler i kultur. Hvert trinn er merket med tilhørende tekst delen fra protokollen. Denne arbeidsflyten gir både en logisk progresjon fra blandet (astrocyte og microglial kulturer; seksjon 1) og en alternativ startkultur renset mikroglia (§ 5) (B) Representant immuncytochemical farging av en multinucleated microglial celle etter 7 sammenhengende dager med psychosine (10. mikrometer) behandling som er identifisert av Iba1 (grønn) og DAPI (blå). (C) Eksempel på presumptive fagocyttfunksjon microglial celle (grønn) etter psychosine behandling i co-kultur med Olig2 + (rød) OPC. Scale bar (i panel B) = 90 mikrometer for 'B' og = 150 mikrometer for 'C'. Vennligst klikk her for å se en større versjon av figur 1B, og her for å se en større versjon av figur 1C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen er beskrevet heri gir en ny modellsystem for å studere utviklingen og funksjonell karakterisering av aktiverte mikroglia og Globoid celler. Før arbeid av Im et al. ved hjelp av en HEK293 cellelinje gitt en mal for utvikling av denne protokoll for studiet av Globoid celle formasjon 21. Det er også viktig å påpeke at de Globoid celler avledet i modellen skiller seg fra de innfødte Globoid celler identifiserbare i GLD. For eksempel har vi rutinemessig observert quadranucleation av mikroglia i våre murine kulturer, mens Globoid celler i GLD er ofte blitt observert inneholder i overkant av 10 kjerner. Dernest, Globoid celler dannet i den in vitro-system er også liten i diameter i forhold til de som er observert in vivo. Det er sannsynlig å være flere årsaker til disse fenotypiske forskjeller som kan omfatte den relative enkelhet av kultursystemet som brukes. For eksempel er det ingennevroner eller oligodendrocytter stede under induksjonsfasen av Globoid celle formasjon ved hjelp av denne primære glial kultur prosedyre. Også tidspunktet for syv dagers protokollen gir en betydelig tetthet av Globoid celler; kan imidlertid lengre behandlingstider ytterligere forsterke likheten av murine Globoid celler dannet av denne protokollen med naturlige fordeler med Globoid celler observert i GLD.

Et viktig trekk ved denne modellen er at den bruker primær blandede glial kulturer, som inkluderer både astrocytter og microglia 15,19. Dette er en viktig fordel med denne Globoid cellemodell for sin nytteverdi i å vurdere bidragene og samspillet mellom astrocytter og microglia. Begge disse ikke-myelinating celletyper blir aktivert i GLD, men deres rolle i denne sykdommen er, som ennå dårlig karakterisert. Viktigere, hadde vi tidligere bestemt at astrocytter i GLD uttrykke høyere nivåer av MMP-3 uttrykk og at dette antagelig astrocyte-derived faktor var avgjørende for transformasjon av mikroglia svar på psychosine. Fremtidige anvendelser av denne in vitro modellen av Globoid celle formasjon kunne ansette kimære kulturer av astrocytter og mikroglia av ulik genetisk bakgrunn, som kan brukes for å fremme vår forståelse av cellespesifikke bidrag til sykdomsfremkallende effektene av psychosine på microglia.

Oppsummert gir denne protokollen en ny tilnærming for å studere patogenesen av GLD. Rollen til Globoid celler har vært gåtefulle og hypoteser om deres beskyttende eller skadelige funksjoner i GLD har vært foreslått. Tidlig identifisering av Globoid celler i naturhistorie i GLD vil ytterligere støtte vårt syn på dette tidspunktet at aktivering av mikroglia i GLD er en primær sykdomsfremkallende respons og en sannsynlig formidler av myelin patologi i denne sykdommen. Tilpasning av denne in vitro modellen Systemet forventes å videreutvikle vår forståelse på celle etiology av GLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). Life technologies 14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi 130-092-628
40 μm cell-strainer Fisherbrand 22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). Gibco 14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 11995-065
fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Penicilin/Streptomycin Life technologies 15070-063
Laminin Sigma L2020
Trypsin-EDTA solution Life technologies 25299-056
Psychosine Sigma P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 19208
Normal Goat Serum (NGS) Invitrogen PCN5000
Iba-1 WAKO 019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera Life Technologies Various
Mounting Media Southern Biotech OB100-01
Phagocytic Assay Kit Cayman Chemicals 500290
HEPES Sigma BP310-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
  2. Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).
  3. Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter's Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
  4. Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
  5. Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
  6. Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
  7. Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
  8. Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
  9. McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
  10. Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
  11. Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
  12. Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
  13. Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
  14. Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
  15. Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. (2013).
  16. Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
  17. Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
  18. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (2013).
  19. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
  20. Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
  21. Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell for studier av Cellular Patofysiologi i Globoid Cell leukodystrophy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).More

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter