Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

doi: 10.3791/51903 Published: October 21, 2014

Abstract

Точная функция мульти-зародышевого микроглии, называется глобоидных клетки, которые являются уникальными в изобилии в центральной нервной системе глобоидных лейкодистрофия клеток (ООВ), неясно. Этот пробел в знаниях, тормозились отсутствием соответствующей в пробирке модель для исследования. Здесь мы описываем начальную мышиный глиальных систему культуры, в которой лечение psychosine результатов в многоядерных микроглии, напоминающих характерные глобоидных клетки, найденные в GLD. Используя эту новую систему, мы определили условия и режимы анализа для изучения глобоидных клеток. Потенциальное использование этой модельной системы была подтверждена в нашем предыдущем исследовании, в котором определены потенциальную роль металлопротеиназы матрикса (ММР) -3 в GLD. Этот роман в пробирке системы может быть полезной модели, в которых исследовано образование и функцию, но и потенциальную лечебные манипуляции, этих уникальных клеток.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Глобоидных клеток лейкодистрофия (GLD), известный также как болезнь Краббе, является смертельным заболеванием демиелинизирующая результате потери функциональных мутаций в galatocerebrosidase (Galc) гена 1. Наиболее распространенной формой GLD является инфантильный вариант, который символизируется начала в раннем детстве и характеризуется агрессивным клиническим течением двигателя и снижение когнитивных, ведущей к преждевременной смерти часто до пяти лет 2,3. Генетическое тестирование используется для проверки диагноза GLD 4. Невропатологии из GLD показывает широкое демиелинизации, атрофия нейронов, астроглиоз и присутствие налиты кровью нескольких ядросодержащих микроглии названием глобоидных клетки 5-7. Идентификация глобоидных клеток, часто содержащие tubulous включений в их цитоплазме, был определяющей чертой GLD за последние 97 лет, хотя специфическая функция этих заметных клеток остается неуловимым.

Участие не-MYELinating глии (микроглии и астроциты) в патогенезе GLD уже давно считается вторичным ответом на глубокой демиелинизации при этом заболевании 8. Интересно, что первое описание этого заболевания, сделаны Кнуд Краббе в 1916 5, сообщили образование многоядерных фагоцитов, содержащих липидов мусора, которые были с именем 'глобоидных клетки »и является определяющей характеристикой этой болезни.

Глобоидных клетки являются отличительной чертой особенностью GLD патологии, хотя их роль в GLD уже давно игнорируются. Интересно, что эти клетки являются одними из первых характерных изменений в ЦНС ткани ООВ. Этот недостаток знаний может быть связано с предположением, что образование многоядерных фагоцитов, называемых гигантских клеток в других заболеваний, как правило, рассматривается как следствие патологии, а не начальной патогенного движущей силы 9. Поэтому, было мало исследований, изучающих механизм по WHICH глобоидных клетки образуются из фагоцитов, особенно в ЦНС ООВ. Процедура, описанная в этом отчете основное внимание уделяется важности формирования глобоидных клеток в ЦНС и нашей предыдущей демонстрации, что psychosine вызванной многоядерных микроглии в пробирке и этих клеток выставлены более высокие уровни фагоцитарной активности. В соответствии с этими наблюдениями, глобоидных клетки в мозге Twitcher часто содержат PAS-положительных мусора, предлагая высокий уровень фагоцитарной активности. Глобоидных клетки также установлено, что иммунопозитивных для ферритина (микроглии маркер) 10, КП-1 / CD68 (моноциты маркер), а некоторые также положительны для виментина (белок промежуточных накаливания и маркер астроцитов и активируется микроглии) 11, HLA-DRA (поверхность рецепторов MHCII), и TNF-α 7, и МБА-1 (кальция связывающий белок используется для идентификации микроглии) 12. На основе этой коллекции маркеров, глобоидных клетки происходят из микроглии, которые развиваютсяуникальный фенотип.

Несмотря на их уникальности, специфическая функция и вклад ГК в GLD патогенезе в значительной степени игнорируется. Глобоидных клетки были считается вторичным следствием хронического демиелинизации. Тем не менее, последние исследования, посвященные изучению временную ассоциацию глобоидных клеток белой материи патологии GLD определили присутствие глобоидных клеток в конце эмбрионального к ранних послеродовых периодов; раз предшествующие олигодендроцитов апоптоз и открытой демиелинизацию 13. Таким образом, временная последовательность развития невропатологии в ООВ предполагает, что глобоидных клетки формируются в заранее демиелинизации при этом заболевании 14. Это привело к нашей гипотезе о том, что рано формирование глобоидных клеток в GLD может представлять определяющую патогенную событие, а не вторичной, реактивной ответ на повреждение олигодендроцитов 15. Кроме того, нарушение регуляции микроглии деятельности в GLD был рассмотрен фактог ограничения долгосрочного эффективность hematopeotic терапии стволовыми клетками для лечения этого заболевания 16. Таким образом, исследования клеточных функций и регулирование микроглии и глобоидных клетки, в ответ на psychosine, как ожидается, обеспечит новый взгляд на патогенез GLD.

До недавнего времени, отсутствие соответствующей модели, в которой можно изучать формирование глобоидных клеток не ограничил понимание функции точного и вклад этих клеток в патологии GLD. В недавних исследованиях было установлено, что глобоидных-подобные клетки могут образовываться в качестве прямого ответа на psychosine, патогенную липидный токсин, который накапливается в GLD. Мы обнаружили, что микроглии, но не макрофаги, активируются и превращаются в глобоидных клеток в первичных глиальных культур в ответ на psychosine 15. Это превращение в глобоидных клеток было обнаружено, что при посредничестве внеклеточной протеазы, металлопротеиназы матрикса (ММР) -3 15. Совсем недавно мырасширили эти выводы и решил, что psychosine активированные микроглии и глобоидных клетки, разработанные в этом экстракорпорального модельной системы являются мощно токсичен для олигодендроцитов и клеток олигодендроцитов предшественников. Следовательно, если рассматривать его в контексте GLD, в начале накопления psychosine и формирования глобоидных клеток перед демиелинизации поддержит формирующийся первичный и, возможно, патогенную роль для микроглии при данном заболевании.

Мы предлагаем, что изучение формирования глобоидных клеток откроет новую информацию о патогенезе GLD, что будет способствовать нашему пониманию этого заболевания. Кроме того, этот новый сотовый модель GLD может обеспечить новый формат, из которого новые терапевтические подходы для решения патологические изменения при этом заболевании могут быть проверены. Следовательно, в данном отчете мы предоставляем подробный протокол для развития в пробирке psychosine вызванной глобоидных клеток из первичных культурах не-myelinating глии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с Политикой по гуманное лечение и использования лабораторных животных изложены Управлением лабораторных животных благосостояния (NIH) и только с одобрения уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) университета Коннектикут Центр здоровья.

1 Получение смешанных глиальных культур

  1. Стерилизовать все инструменты перед использованием. Добавить 3 мл охлажденного льдом стерильный сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS), не содержащего катионы (Mg 2 + или Ca 2 +) к трем стерильных 60 мм чашках Петри, поддерживаемых на льду, чтобы сохранить холод.
  2. Изолировать кору от послеродовых P0-P2 щенков мыши, как описано выше 17,18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: подкорковых структур, таких как гиппокампе, не включены в этих культурах.
  3. Осторожно снимите мозговые оболочки, а затем перевести выделенные кору на свежий ССРХ и отделить ткани ферментами, используя пеурал ткани рассечение комплект в соответствии с протоколом производителя.
  4. Пластина клеток в стерильных Т-175 колб и инкубировать в течение ночи в среде [изменение Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), содержащую 1x пенициллина / стрептомицина].
  5. Заменить все средства массовой информации на следующий день со свежей информации. Продолжали инкубировать культур, с регулярными изменениями СМИ, в течение приблизительно 3 недель или до сотовой монослоя устанавливается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это монослой будет состоять из астроцитов и микроглии с примерно 10: 1 соотношении 19.

2 глобоидных сотовый Индукционная в смешанных глиальных культур

  1. Подготовьте ECM-покрытием покровные.
    1. Замачивание круговые покровные стерильной 1 N соляной кислоты (HCl) в стерильную чашку Петри в течение 30 мин. Вымойте покровные стерильными 3x воды, а затем замочить в 95% этанола в течение не менее 20 мин. а потом пусть воздушно-сухой.
    2. Место капельки разбавленной внеклеточной MATRIX (ЕСМ) белок, покрывающие материалы на листе парафильмом (например, 150-250 мкл / капелька ламинин 10 мкг / мл, растворенного в стерильном растворе фосфатного буфера [PBS]). Распределите капель так, чтобы покровные не коснется при размещении на этих капель. Аккуратно поместите каждую высушенную покровное на капли с помощью щипцов.
    3. Оставьте покровные на каплях в течение ок. 4-6 ч внутри капот культуры с створки.
    4. Поместите ECM-покрытием покровные (ECM-покрытием вверх) в каждой из лунки 24-луночного планшета. Вымойте каждую лунку стерильной PBS 3x и держать при температуре 4 ° С до использования.
  2. Подготовка глиальные клетки для Покрытие на покровные.
    1. Аспирируйте носители из глиальных культур и аккуратно мыть глиальных однослойных 3 раза с 10 мл стерильной PBS. Далее, добавляют 8-10 мл раствора трипсина-ЭДТА в Т-175, и инкубируют в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С.
    2. Когда большинство из монослоя была отдельно, добавляют 20 мл полной средыВ колбу, чтобы остановить трипсинизации. Соберите носителей, содержащих отдельные клетки в 50 мл коническую трубку и вращаться в течение 10 мин при 300 мкг в при комнатной температуре.
    3. Аспирируйте супернатант, не нарушая гранул, а затем повторно суспендирования клеток в 2 мл свежей полной среды, осторожно пипеткой раствора с помощью пипетки P1000.
    4. Определить количество клеток с помощью гемоцитометра, а затем вновь приостановить клеток в полной среде при желаемой плотности (например, 10 5 клеток / мл). Пластина клеток на ECM-покрытием покровные (например 500 мкл в каждую лунку 24-луночного планшета). Добавить дополнительные свежие полные СМИ в каждую лунку для 3-5 дней инкубации при 37 ° С, или пока клетки растут в нужное визуального слияния.
  3. Лечение Psychosine.
    1. Развести psychosine к фондовой концентрации (108,3 мм) в диметилсульфоксиде (ДМСО). Развести этот запас в 100% этанола, чтобы сделать рабочую запас, который можетн быть добавлены в каждую лунку 24-луночного планшета для достижения конечной концентрации 10 мкМ.
    2. Во время добавления psychosine, нежно вихревой культуральный планшет для смешивания psychosine в культуральной среде. Дополнить psychosine, добавив эквивалент 10 мкМ через день в течение одной недели.
  4. После 7 дней psychosine лечения, собрать средства массовой информации и пипеткой 500 мкл холодного 4% параформальдегида (PFA) в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы зафиксировать клетки. Затем промыть каждую лунку 3x с PBS, а затем сохранить пластины при 4 ° С, пока не обработаны для иммуногистохимии (смотри ниже).
    Примечание: культуральные среды клеток могут быть собраны для ферментативного анализа ELISA или в этом пункте, если это необходимо.

3 Иммуноцитохимия (ICC), чтобы визуализировать глобоидных клеток

  1. Заменить PBS с блокирующим буфером [PBS + 0,3% Твин-20 + 5% нормальной козьей сыворотки (NGS)], и инкубируют клетки в течение 1 часа при комнатной температуре.
  2. Вcubate фиксированные клетки в первичной антисыворотки против Iba-1 [(1: 1000), разведенного в PBS + 0,3% Твин-20 + 2% NGS] в течение по крайней мере 1 ч при комнатной температуре, затем промыть каждую лунку PBS с 3-кратным 5 мин / мыть.
  3. Добавить соответствующий вторичный флуоресценции-конъюгированного антитела для выявления первичной маркировки антитела и против пятен с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 1: 1000), чтобы определить ядра. Инкубировать в растворе вторичного антитела в течение 1 часа при комнатной температуре и промывают PBS, 3-кратным 5 мин.
  4. Установите каждый покровного стекла для микроскопа слайды, используя монтажную среду. Просмотреть скользит по флуоресцентным микроскопом для визуальных и количественного анализа.

4 Анализ и характеристика глобоидных клеток в первичной культуре

  1. Используйте следующие три морфологические критерии для идентификации глобоидных клетку в культуре:
    1. Определить глобоидных клеток с использованием флуоресцентной микроскопии на иммунопозитивных маркировки для микроглии маркера, МБА-1 +.
    2. Определитьглобоидных клетки как polynucleated (т.е. содержащих два или более DAPI положительных ядер).
    3. Определить глобоидных клетки округлой морфологии отличной от сильно разветвленного появления отдыхает клеток микроглии.
      Примечание: Клетки могут быть собраны на поверхности клетки анализа и количественного маркера путем проточной цитометрии из этих культур.
  2. Измерение фагоцитарную активацию микроглии и глобоидных клеток
    1. Для оценки фагоцитарной активности psychosine обращению микроглии, добавить FITC-меченных латексные шарики в лунки в соответствии с инструкциями изготовителя. Добавить люминесцентная-сопряженные латексные шарики 48 ч до фиксации с PFA. Fix клетки, обработанные с бисером (как уже упоминалось в разделе 2.4), и процесс иммуноцитохимии (как описано в разделе 3).
    2. Выберите флуорофорные-сопряженных вторичными антителами, так что они не перекрываются флуоресцентного спектры излучения флуорофорные помечены бисером.
    3. Analyzэ то phagocytotic профили МБА-1 + микроглии путем выявления тех клеток, которые ко-локализуются с флуоресцентно-меченых бисером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Psychosine активирует микроглии. Фагоцитированы шарики будут определены в Мононуклеированные и многоядерными МБА-1 + клеток в этой обстановке культуры.

5 Индукция глобоидных клеток из Очищенная микроглии культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативный подход к расшифровать межклеточной сигнализации между астроцитов и микроглии является еще одним преимуществом этого в пробирке глобоидных ячеечной модели. Очистка первичных клеток микроглии для replating или совместного культивирования может быть достигнуто за счет их более низкой имущества присоединения в культуре, как описано в следующих этапов (см раздел 5.2).

  1. Сбор средств массовой информации в конфлюентных смешанных глиальных культур в 50 мл коническую трубку и поддерживать его при 37 ° С в инкубаторе.
  2. Микроглии Изоляция от первичных смешанных глиальных культур.
    1. После удаления носителя из сливной смешанной культуры глиальных T175 колбу, добавьте теплые встряхивания сред [состоящие из полной среды + 25 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислоты (HEPES) + 25 мМ бикарбоната натрия (Sigma)]. Встряхнуть колбы для 3-4 ч в орбитальном шейкере при 100 об (37 ° C). Сбор средств массовой информации из этих потрясших колбах на 50 мл конические пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот носитель будет включать в себя менее клейкий микроглии от колб.
    2. Спин носитель при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и затем повторно суспендирования клеток в 2 мл астроцитов-кондиционированной среды (собранные на шаге 5.1).
    3. Установить количество клеток получали с использованием гемоцитометра, а затем пластины в клетки микроглии на подложку с покрытием покровные (смотри раздел 2.1) для иммуногистохимии, или пластину на сверхнизких следование луночных планшетах для будущего сбора глобоидных клеток для совместного культивирования с другими типами клеток, такие как олигодендроциты (как алфавитуribed в следующем разделе).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После покрытием микроглии можно лечить с psychosine (10 мкм), как описано выше (см раздел 2.3).
  3. Co-культура с первичных олигодендроцитов для анализа цитотоксичности.
    Примечание: Сбор psychosine обработанных микроглии от низкого прилипания пластин для последующего совместного культивирования на первичных культурах олигодендроцитов, клеток или клеток-предшественников олигодендроцитов, может быть использован для изучения потенциальной цитотоксической функции этих глобоидных-подобных клеток в пробирке.
    1. Разработка культур первичных олигодендроцитов, применяющих установленные методы 18,20. Чтобы собрать psychosine обработанных микроглии, осторожно пипеткой, чтобы отделить слабо прилипшие клетки из нижней части скважины. Сбор клеток, центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин, а затем осторожно ресуспендируют в среде для дифференцировки олигодендроцитов [состоящей из Neurobasal сред, L-глутамин (1x), В-27 добавки (1x), и трийодтиронина (Т3, 10 нг / мл )].
    2. Подсчитайте число клеток с помощью гемоцитометра, а затем семена микроглии на олигодендроцитов культуры в 1 × 10 5 клеток / мл, в результате чего приближенного 1: 2 / микроглии соотношении олигодендроцитов. Выдержите в качестве со-культуры на срок до 3 дней.
    3. Fix клетки для иммуноцитохимии (см раздел 2.4). Соберите культуры клеток для ELISA или химические анализы по мере необходимости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол, как написано, как ожидается, займет около 36 дней, чтобы завершить от начала до конца (см Рисунок 1: Экспериментальная Workflow Scheme). Это был наш опыт, что развитие «глобоидных-как" клеток в этой первичной системе культуры является одновременно надежным и воспроизводимым: формирование многоядерных клеток в ответ на psychosine последовательно наблюдается с 7 дней лечения.

Иммуноцитохимическая окрашивание микроглии использованием МБА-1 в сочетании с ядерной контратаки пятна позволит идентифицировать крупные, округлые многоядерные клетки (рисунок 1b). В некоторых случаях ядерного содержание в этих глобоидных-подобных клеток появится с различных ядер. Тем не менее, во многих случаях, валовой увеличение размера ядра отражает многоядерные статуса этих клеток (Фигура 1В). Количество глобоидных-подобных клеток может варьироваться от поля зрения, чтобы поле зрения,но стоит отметить, что доля глобоидных клеток образуется в пробирке представляет <5-10% от общего микроглии клеточной популяции. Важно также отметить, что psychosine лечение также вызывает обобщенную активацию микроглии (т.е. заметное увеличение фагоцитарной активности), которая возникает в ответ на psychosine лечение к Мононуклеированные микроглии и многоядерными глобоидных клеток (ГСК) в этих культурах. Как показано на рисунке 1c, phagocytically активные профили МБА-1 + микроглии могут быть легко идентифицированы, если положить в совместной культуре с клетками олигодендроцит предшественников (OPCS).

Эта система культуры клеток поддается экспериментальной манипуляции в качестве средства для оценки биологию глобоидных клеток. Например, недавно мы продемонстрировали новую роль внеклеточной протеазы, матриксной металлопротеиназы-3 (ММР-3 / стромелизин-1) в качестве важного медиатора формирования GC psychosine-индуцированного с помощью этого CULтура анализ 15.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Экспериментальная Workflow для первичной культуре пробирке модель в части глобоидных Cell формирования () Блок-схема, изображающая основные этапы и вмешательства раза (в днях) для развития глобоидных клеток в культуре. Каждый шаг имеет свое соответствующее текстовое участке от протокола. Этот рабочий процесс обеспечивает как логический переход от смешанной (астроцитов и микроглии культур, в разделе 1) и альтернативный отправной культуру очищенной микроглии (раздел 5) (B) представитель immuncytochemical окрашивания из многоядерных микроглии клетки ближайшие 7 дней подряд psychosine (10. мкМ) лечение, как определить по Iba1 (зеленый) и DAPI (синий). (C) Пример предполагаемого фагоцитарной микроглии клетки (зеленый) после psychosine лечения в совместной культуре с Olig2 + (красный) OPC. Шкала бар (на панели В) = 90 мкм для 'B' и = 150 мкм для 'C'. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию рисунке 1b, и здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию фиг.1С.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протокол, описанный здесь предоставляет новую модель системы, в которой для изучения развития и функциональные характеристики активированных микроглии и глобоидных клеток. До работы на Im соавт. с использованием клеточной линии HEK293 условии шаблон для разработки настоящего протокола для изучения формирования глобоидных клеток 21. Важно также отметить, что глобоидных клетки, полученные в модели отличаются от родных глобоидных клеток идентифицируемых в GLD. Например, мы регулярно наблюдали quadranucleation микроглии в наших мышиных культур, в то время как глобоидных клетки в GLD были часто наблюдается, содержащий более 10 ядер. Во-вторых, глобоидных клетки, образованные в системе ин витро также небольшие в диаметре по сравнению с тем, которые наблюдаются в естественных условиях. Есть, вероятно, будет несколько причин для этих фенотипических различий, которые могут включать относительную простоту системы культуры, используемой. не, например, есть ненейроны или олигодендроциты присутствующие во время фазы индукции формирования глобоидных клеток, используя эту первичную процедуру глиальных культуры. Кроме того, сроки протокола семидневного дает значительное плотность глобоидных клеток; Однако, более длительное время лечения может еще больше увеличить сходство мышиных глобоидных ячеек, образованных этим протоколом с родных особенностей глобоидных клеток, наблюдаемых в GLD.

Важной особенностью этой модели является то, что он использует первичные смешанные глиальные культуры, которые включают в себя как астроциты и микроглии 15,19. Это является важным преимуществом этого глобоидных модели клеток для его полезности в отношении исчисления взносов и взаимодействие между астроцитов и микроглии. Оба эти типа не-myelinating клеток активируются в GLD, хотя их роль в этой болезни являются, пока еще, слабо изучен. Важно отметить, что мы ранее определили, что астроциты в GLD выразить более высокие уровни MMP-3 выражения и что этой предположительно астроцитов-вытекающейред фактором решающее значение для трансформации микроглии в ответ на psychosine. Будущие приложения этой модели в пробирке формирования глобоидных клеток может использовать химерные культур астроцитов и микроглии из различных генетических фонов, которые могут быть использованы для улучшения нашего понимания вкладов клеток, специфичных для патогенного воздействия psychosine на микроглии.

Таким образом, этот протокол обеспечивает новый подход к изучению патогенеза GLD. Роль глобоидных клеток был загадочный и гипотезы о своих защитных или вредных функций в GLD были предложены. Своевременное выявление глобоидных клеток в естественной истории GLD бы еще более подтверждают наш взгляд на этот раз, что активация микроглии в GLD являются основным патогенным ответ и вероятным медиатором миелиновой патологии при этом заболевании. Адаптация этого в пробирке модельной системы, как ожидается, более глубокого понимания на клеточном еtiology из GLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). Life technologies 14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi 130-092-628
40 μm cell-strainer Fisherbrand 22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). Gibco 14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 11995-065
fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Penicilin/Streptomycin Life technologies 15070-063
Laminin Sigma L2020
Trypsin-EDTA solution Life technologies 25299-056
Psychosine Sigma P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 19208
Normal Goat Serum (NGS) Invitrogen PCN5000
Iba-1 WAKO 019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera Life Technologies Various
Mounting Media Southern Biotech OB100-01
Phagocytic Assay Kit Cayman Chemicals 500290
HEPES Sigma BP310-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
  2. Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).
  3. Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter's Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
  4. Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
  5. Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
  6. Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
  7. Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
  8. Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
  9. McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
  10. Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
  11. Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
  12. Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
  13. Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
  14. Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
  15. Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. (2013).
  16. Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
  17. Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
  18. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (2013).
  19. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
  20. Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
  21. Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель для изучения клеточной патофизиологии в глобоидных Cell Leukodystrophy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).More

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter