Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Methylnitrosourea (MNU) يسببها الشبكية البقعي والتجدد في الزرد: التركيب النسيجي والخصائص الوظيفية

Published: October 20, 2014 doi: 10.3791/51909
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 3, 1
1Department of Ophthalmology, Inselspital, University of Bern, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Basel, 3Department of Biology, University of Fribourg

Summary

هنا علينا أن نظهر الكمي لاجتثاث الشبكية وتجديد وأثره على وظيفة البصرية باستخدام N -methyl- N -nitrosourea في الزرد الكبار. وتلت فقدان البصر وانخفضت أعداد مبصرة من انتشار في الطبقة النووية الداخلية. وقع تجديد كامل المورفولوجية والوظيفية بعد 30 يوما من العلاج الأولي.

Abstract

أمراض الشبكية التنكسية، مثل التهاب الشبكية الصباغي، مع ما يترتب على حساب الضرر مبصرة لغالبية فقدان البصر في العالم الصناعي. النماذج الحيوانية ذات أهمية محورية لدراسة مثل هذه الأمراض. في هذا الصدد السم مبصرة محددة N -methyl- N -nitrosourea (MNU) وقد استخدم على نطاق واسع في القوارض للحث على دواء تنكس الشبكية. سابقا، أنشأنا نموذجا تنكس الشبكية الناجم MNU في الزرد، ونظام آخر نموذج شعبية في البحث البصري.

وهناك فرق رائعة على الثدييات هو تكوين الخلايا العصبية الكبار المستمر في شبكية العين الزرد وتجديد لها بعد الضرر. لتحديد هذه الملاحظة لقد استخدمنا قياسات حدة الإبصار في الزرد الكبار. وبالتالي، تم استخدام منعكس حركة العين لمتابعة التغييرات الوظيفية في الأسماك غير تخدير. واستكمل هذا مع الأنسجة وكذلك staini المناعىنانوغرام لموت الخلايا المبرمج (النفق) وانتشار (PCNA) لربط التغيرات المورفولوجية النامية.

باختصار، موت الخلايا المبرمج للخلايا مستقبلة للضوء يحدث بعد ثلاثة أيام العلاج MNU، والذي يليه انخفاض ملحوظ من الخلايا في الطبقة الخارجية النووية (ONL). بعد ذلك، لوحظ تكاثر الخلايا في الطبقة النووية الداخلية (INL) وONL. هنا، نحن تكشف أن ليس فقط النسيجية كاملة ولكن أيضا حدوث تجديد وظيفية على مدار الساعة من 30 يوما. نحن الآن توضيح الأساليب لقياس ومتابعة اجتثاث الشبكية الزرد وتجديد باستخدام MNU في تنسيق الفيديو.

Introduction

الرؤية هي الشعور الأكثر أهمية للإنسان وضعف لها أثر اجتماعي واقتصادي عال. في العالم المتقدم، والأمراض التنكسية الشبكية هي السبب الرئيسي لفقدان البصر والعمى بين كبار السن 1. يفهم سبب معظم الأمراض التنكسية الشبكية جزئيا فقط، والحلول العلاجية لاستعادة الرؤية المفقودة محدودة جدا. التهاب الشبكية الصباغي هو مثال نموذجي من الأمراض التنكسية الشبكية مع فقدان مبصرة الأولية 2-3. -methyl- N N -nitrosourea (MNU) يدفع تنكس الشبكية، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع في القوارض لنموذج الأمراض مع خلية مستقبلة للضوء الرئيسي فاة 4. وهي وكيل مؤلكل ويؤدي إلى الأورام الحميدة والخبيثة، التي تظهر عادة بعد عدة أشهر من التعرض 5-7. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتسبب موت الخلايا مبصرة محددة ضمن فترة المراقبة على المدى القصير. وبالتالي، فقدان طبقة الشبكية structuوإعادة وحظت ترقق الشبكية كبير بطريقة تعتمد على التركيز. تم تنشيط الخلايا الدبقية الشبكية، ولكن لا توجد تغييرات في الظهارة الصبغية الشبكية (RPE). شبكية هيولي باطني (ER) الخلايا المرتبطة بالتوتر ويبدو أن المسار الرئيسي للعمل MNU في شبكية العين 8.

أدخلنا مؤخرا MNU كنموذج الكيميائية للحث على انحطاط مستقبلة للضوء في الزرد 9. من بين أسباب أخرى، أصبح الزرد (دانيو rerio) مهم في البحث البصري بسبب التشابه نظامها البصري إلى أن من الفقاريات الأخرى 10. شبكية العين تحتوي على المستقبلات الضوئية الخارجية، التي يمكن تصنيفها إلى أربعة أنواع مختلفة مع مخروط الحساسيات الذروة في الأشعة فوق البنفسجية، قصيرة، متوسطة، وطويلة الطول الموجي من الطيف المرئي وقضيب واحد نوع مبصرة. في الطبقة النووية الداخلية (INL)، وعثر على جثث خلية من القطبين، الأفقي، وinterneurons عديم الاستطالات، وأهلا وسهلال كما سوما خلية من خلايا الدبقية مولر. في طبقة ضفيري الخارجي (اوبل) تتشكل الاتصالات متشابك بين المستقبلات الضوئية في شبكية العين والداخلية، في حين أن طبقة الخلايا الأقرب إلى العدسة هي طبقة الخلايا العقدية (GC)، المكونات التي تشكل محاور عصبية طويلة تضم العصب البصري والجهاز البصري . وتشكل الاتصالات المشبكية بين الخلايا العقدية والخلايا في الطبقة النووية الداخلية في طبقة ضفيري الداخلية (IPL) 11. وRPE تقع خارج الشبكية العصبي الحسي ويحيط شرائح مبصرة الخارجي مع زغيبات قمية طويلة 12. وعلاوة على ذلك، الزرد هو التجديدي للغاية وقادرة على تنمو الدماغ lesioned، شبكية العين، والحبل الشوكي والقلب والأنسجة الأخرى 13. عندما يحدث تلف في شبكية العين، والخلايا في INL، والتي يعتقد أن خلايا مولر، يتم تنشيط ولها القدرة على التمايز إلى مختلف أنواع الخلايا في شبكية العين. وبالإضافة إلى ذلك، كما أنها تولد قضيب الأسلاف، والتي تقع في ONL. حتى آخرurce التي تزود الشبكية من الزرد الكبار مع خلايا جديدة هو منطقة هامشية الهدبية. وهناك حاجة لتحقيق هذا المصدر كثافة مستمرة من المستقبلات الضوئية قضيب في العين الزرد تزايد مستمر 14.

نموذج MNU يمكن استخدام نهج الضمور / تجديد بسيطة وقابلة للتكرار للأنسجة الشبكية. بسبب التشابه معينة من العمليات البيولوجية في الزرد والبشر هذا يمكن أن يفتح الأبواب لتحديد مسارات موت الخلايا المعنية لفحص المخدرات واعصاب المحتملة. واستنادا إلى دراسة سابقة من مجموعتنا، ونحن الآن توضيح أساليب هذا النموذج الزرد MNU التي يسببها من اجتثاث الشبكية وما يترتب تجديد بما في ذلك التغيرات الوظيفية وفقا أشرطة الفيديو مع مختبر 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع التجارب انضمت إلى بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية لجمعية أبحاث طب العيون في الرؤية و(ARVO).

1. الحيوانات

  1. الحفاظ على النوع البري الزرد (دانيو rerio) من AB (أوريغون) سلالة الذين تتراوح أعمارهم بين 6-12 شهرا في ظل ظروف قياسية في المياه مع درجة حرارة 26.5 درجة مئوية و14/10 ضوء ساعة / دورة الظلام 15.
  2. اتباع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من المؤسسات المعنية للالتجارب على الحيوانات بعد موافقة المكتب البيطري الكانتونات.

2. MNU العلاج

  1. تعد المياه التي تحتوي على 150 ملغ / لتر من المادة الجافة N -methyl- N -nitrosourea (MNU). تنبيه! MNU سامة. قد تسبب السرطان، والضرر الجيني الموروثة أو أذى للطفل الذي لم يولد بعد.
  2. احتضان الزرد في المياه التي تحتوي على MNU لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. شطف الزرد بسرعة معالمياه العذبة ووضع الأسماك إلى حوض للأسماك الجديد دون MNU. الحفاظ على الأسماك تحت ظروف قياسية طالما المرجوة للتجارب.

3. قياس حدة البصر

  1. بدء نظام optomotor، اختر 'اختبار' من القائمة وتعيين الخيارات ل"الدرج بسيط"، "البراعة (التكرار)" و "العشوائية / منفصلة" 16.
  2. تثبيت زجاجة مليئة ضخ 500 مل من الماء حوالي 1 متر فوق النظام optomotor.
  3. وضع الزرد واحد في غرفة الفحص وتوصيله إلى زجاجة التسريب. وضع غرفة الفحص في النظام optomotor.
  4. بدء قياس ومراقبة حركة العين في الوقت الحقيقي على شاشة الكمبيوتر. وبالتالي، يتم تعريف ردا إيجابيا ("نعم") كما saccades متتالية في الاتجاه الصحيح، في حين أن الاستجابة السلبية ("لا") يمثل حركات العين العشوائية مماثلة لتلك التي لوحظت مع محطةحواجز شبكية آرى. إذا كانت العينان من المعرض الزرد ثلاثة أو أكثر من الردود اللاحقة عينية حركية (OKR)، اضغط على 'نعم'؛ إن لم يكن، اضغط على "لا".
  5. استخراج حدة البصر، والتي تم حسابها بواسطة البرنامج عن طريق تحديد عتبة التردد المكاني للتحفيز حركة العين، تحت عنوان "نتائج" في القائمة.

4. علم الأنسجة

  1. الموت ببطء الزرد بواسطة جرعة زائدة من إيثيل 3 أمينوبنزوات methanesulfonate (200-300 ملغم / لتر) واستأصل العينين.
  2. إصلاح العيون كلها في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ثم يذوى العينات في سلسلة متدرجة الكحول.
  3. تضمين العينات في البارافين، وقطع 5 ميكرون من خلال أقسام رأس العصب البصري (ONH) وجبل لهم على الشرائح الزجاجية.
  4. وصمة عار على أقسام البارافين deparaffized مع شب هيماتوكسليني لمدة 4 دقائق وتراجع الشرائح مرتين في الماء المقطر تليها 0.2٪ ACI الهيدروكلوريكد و 0.8٪ الأمونيا. وصمة عار على أقسام مع يوزين لمدة 3 دقائق بعد تطوير تلطيخ شب هيماتوكسليني توجد فى ماء الصنبور لمدة 10 دقيقة على الأقل (H & E).
  5. تضمين الشرائح المجففة في تصاعد المتوسطة ومراقبة الشرائح تحت المجهر الضوئي.

5. المناعية

  1. محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز dUTP نيك وسم نهاية (النفق)
    1. احتضان أقسام deparaffinized مع 20 ميكروغرام / مل K بروتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. غسل أقسام ثلاث مرات مع تريس مخزنة المالحة (TBS) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    2. احتضان المقاطع مع 50 ميكرولتر خليط التفاعل النفق (10٪ محلول وضع العلامات و 90٪ محلول أنزيم) في غرفة ترطيب عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. يغسل ثلاث مرات مع TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. جبل الشرائح مع تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي ومراقبة الشرائح تحت المجهر مضان.
  2. المتكاثرة خلية مستضد النووية (PCNA) تلطيخ
    1. تغلي الأقسام deparaffinized في المخزن استرجاع مستضد (تريس، EDTA + 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 9.0) لمدة 3 دقائق ويغسل ثلاث مرات مع TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. منع مع 100 ميكرولتر عرقلة الحل (TBS + 10٪ الماعز العادي المصل + 1٪ ألبومين المصل البقري، pH7.6) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    2. وصمة عار مع مكافحة PCNA الأجسام المضادة الأولية في 1: 200 التخفيف في غرفة ترطيب عند 4 درجات مئوية خلال الليل. يغسل ثلاث مرات مع TBS + توين 20 لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. إنهاء الكشف مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 1: 500 التخفيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    4. جبل الشرائح مع تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي ومراقبة الشرائح تحت المجهر مضان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البصرية حدة:

التجريبية مجموعة المتابعة [التردد المكاني: 0.042 الدوائر / درجة (C / D). النقيض: 100٪؛ سرعة الانجراف: 20 درجة / ثانية (د / SRC). العودة الخفيفة الإنارة: 152 شمعة / م 2] من هذه الدراسة مكنت تقييم OKR من الزرد الكبار. كان متوسط ​​مدة قياس VA حوالي 5 - 10 دقائق لكل الزرد، والتي تحمله الإجراء أيضا. وكانت حدة البصر قبل التعرض MNU 0.577 ± 0.014 دورة / درجة (C / D). الشكل 1 يبين بالطبع حدة البصر بعد تطبيق 150 ملغ / L MNU. بدءا من يوم 1، كشفت القياسات انخفاضا ملحوظا في حدة البصر، تصل إلى القيم الدنيا في يوم 3. ابتداء من يوم 8 بزيادة حدة الإبصار يحدث، مما يدل على الشفاء الكامل من حدة البصر بعد 30 يوما من التعرض MNU. للتحليل الإحصائي تم تطبيق ANOVA في اتجاه واحد تليها التجارب المقارنة متعددة Bonferroni ل. وبالتالي، فإن الاختلافات في حدة betwe البصريأون خط الأساس وقياسات كبيرة بعد العلاج لعدة أيام 1 و 3 و 5 و 8 (P <0.001، لكل منهما)، ولكن ليس لأيام 15 و 30.

تقييم النسيجي من تنكس الشبكية:

تم استخدام H & E تلطيخ لقياس التغيرات المورفولوجية في عين واحدة من الزرد في نقطة زمنية (ن = 3) في الأساس وكذلك 3، 8، 15، و 30 يوما بعد العلاج (الشكل 2). تم إجراء الأنسجة كما وصفها آخرون Tappeiner 9. وبالتالي، لوحظ تنكس الشبكية بما في ذلك تعطيل تشكيل INL ​​وتجويف ONL ابتداء من يوم 3. عدد الخلايا في طبقة الخلايا العقدية (GC)، وطبقة داخلية النووية (INL) وعدد من قضيب (RN) وتم تحديد مخروط (CN) المستقبلات الضوئية يدويا 250 ميكرون من مركز ONH على كلا الجانبين من قسم العين (حجم المنطقة عدها يشير إلى قسم الشبكية من 100 ميكرون طول). وأعقب انحطاط ل30بعد أيام من العلاج مع الحد أقصى من قضيب ONL فقدان عثر عليه يوم 8. وبالتالي، انخفض عدد المستقبلات الضوئية قضيب (RN) إلى 82٪ في اليوم 3، 71٪ في يوم 8 و 77٪ في أيام 15 و 30 من العدد الأصلي . وعلاوة على ذلك، تم العثور على تراكم مجموعات الخلايا، وخاصة في INL.

الكمي لموت الخلايا المبرمج:

تم تنفيذ النفق تلطيخ وفقا لالصانع (في الخلية الموقع كشف الموت كيت، علوم التطبيقية روش، Rotkreuz الفندقية، سويسرا). تنكس الشبكية لوحظ بعد العلاج MNU كان سببه موت الخلايا المبرمج. تم الكشف عن ذلك من خلال تلطيخ النفق إيجابي في طبقات مختلفة من الخلايا الحسية في الشبكية. لالكمي، تم تحديد عدد الخلايا النفق إيجابية يدويا في مجالين الشبكية من 450 ميكرون طول كل، بدءا من محيط الشبكية. وبالتالي، تم العثور على معظم خلايا النفق إيجابية في ONL في اليوم 3. ومع ذلك، شوهدت الخلايا الميتة أيضا في INL في ذلك الوقت نقطة (الشكل 3). لم تكن هناك أية خلايا النفق إيجابية ذات الصلة للكشف قبل العلاج.

الكمي لتكاثر الخلايا:

لتقييم انتشار بعد موت الخلايا، كانت ملطخة شبكية العين لتكاثر الخلايا مستضد النووي (PCNA) كما وصفها آخرون Tappeiner 9. لالكمي، تم تحديد عدد الخلايا PCNA إيجابية يدويا كما هو موضح أعلاه. وأعقب موت الخلايا التي يسببها انتشار ينظر إليها على أنها خلايا PCNA الإيجابي (الشكل 4). وأظهرت الخلايا في ONL (أساسا قضبان) وبالتالي، تم قياس الحد الأقصى من الخلايا المتكاثرة في INL في يوم 5. بالإضافة إلى تلطيخ إيجابي لPCNA حتى نهاية الدراسة (يوم 30). كانت خلايا قليلة PCNA إيجابية في المنطقة الهدبية هامشية كشف قبل وعلى جميع نقاط الوقت بعد العلاج.

د / 51909 / 51909fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 1: حدة البصر قياس حدة البصر في الزرد الكبار بعد تطبيق 150 ملغ / L MNU. وأعقب انخفاض كبير في حدة الإبصار مع حد أدنى في 3 يوم بعد العلاج قبل الشفاء التام، ابتداء من يوم 5 حتى يوم 30 (يعني ± SD، ن = 3).

الشكل 2
الشكل 2: علم ​​الأنسجة أمثلة من H & E الملون المقاطع النسيجية من شبكية العين الزرد في الأساس (A) و 3 (ب) و 8 (C) و 15 (D)، و 30 (E) أيام بعد العلاج MNU. CN، نوى مخروط. RN، نوى قضيب. INL، الطبقة النووية الداخلية. GC، طبقة الخلايا العقدية. السهام علامة مجموعات الخلايا في INL. يساوي شريط النطاق 50 ميكرون.

gether.within الصفحات = "دائما"> الرقم 3
الخلايا خلايا النفق النفق إيجابي إيجابية (الحمراء) في شبكية العين الزرد في يوم 3 بعد العلاج MNU: الرقم 3. وتقع الخلايا أساسا في ONL لكن تم العثور أيضا في INL. لوحة ويصور السيطرة، في حين وحة B يظهر الصور بعد العلاج MNU. يشير شريط النطاق 50 ميكرون.

الرقم 4
الشكل 4: خلايا PCNA إيجابية خلايا PCNA إيجابية (الحمراء) في شبكية العين الزرد في يوم 5 MNU بعد العلاج بالمقارنة مع العينة الضابطة. لوحة ويصور السيطرة، في حين وحة B يظهر الصور بعد العلاج MNU. يشير شريط مقياس 100 ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

سابقا، وقد نقل مجموعتنا نموذج MNU انحطاط مبصرة من القوارض في النظام الزرد 9. ووصف الأحداث التي تلت ذلك ويتبع لمدة تصل إلى 30 يوما. في هذه الفترة الزمنية حدث انحطاط كامل الصرفي الشبكية وتجديد بعد العلاج الأولي. أولا، الأنسجة تكشف خلية قضيب خفض العد من اليوم على 3 مع حد أدنى في اليوم 8. المقابل، يحدد النفق تلطيخ موت الخلايا المبرمج للخلايا مستقبلة للضوء قضيب بعد 3 أيام العلاج MNU. يبدأ تجديد في INL في اليوم 3، مع كحد أقصى في اليوم 5. في ONL، ويمكن ملاحظة الخلايا المتكاثرة حتى نهاية فترة المراقبة مع كحد أقصى في اليوم 5. هذا هو على النقيض من INL حيث لا زيادة انتشار لوحظ بعد يوم 15. منطقة هامشية الهدبية هو الموقع الوحيد في شبكية العين حيث تم العثور على بعض الخلايا إيجابية PCNA في شبكية العين غير المعالجة. وهذا يدل منطقة ذات تكوين الخلايا العصبية في شبكية العين باستمرار ماراالحوت عمر 14. كان تحديد أنواع الخلايا المشاركة في تجديد خلايا مستقبلة للضوء تضررت دواء في الزرد ليس في محور هذه المخطوطة. ومع ذلك، في المنشورات السابقة وقد تم تتبع عملية تجديد الخلايا في INL التي اقترحت أن تكون خلايا مولر 9،17،18.

في هذه الدراسة، قمنا بتقييم أيضا تغييرات وظيفية في نموذج الزرد MNU التي يسببها. لتحديد وظيفة البصرية في الأسماك البالغة، واستخدمت تقييم OKR، واحدة من عدة تقنيات لقياس موثوق حدة البصر (VA) من الحيوانات الصغيرة 19. وبالتالي، فإن OKR، استنادا إلى سلوك فطري، لا يحتاج التدريب مضيعة للوقت مسبق من الحيوانات 20. وعلاوة على ذلك، كما OKR يمكن استخلاصها مرارا مستقل التعاون الحيوانات، ويمكن بسهولة عيون كبيرة يتعين مراعاتها، وتقييم OKR هو الأسلوب الأمثل لمتابعة حدة البصر الزيتوز انحطاط والتجدد في الزرد. وكشفت قياسات OKR في الدراسة الحالية على تقليل حدة البصر حتى يوم 3، تليها الاستعادة الكاملة لوظيفة البصرية في يوم 30. هذا هو وفقا للتغييرات اجتثاث والتجدد النسيجي بعد تطبيق MNU أن يظهر أقصى موت الخلايا المبرمج في اليوم 3.

وهناك فائدة من هذا النموذج هو بساطته وMNU سريعة لإعداد ويمكن حله مباشرة في خزان المياه في الزرد. يتم تنفيذ العلاج من الزرد مع MNU في ساعة واحدة. عدد الأسماك التي يمكن علاجها بشكل جماعي محدود فقط من حجم خزان الأسماك. وعموما، هذا يسمح تحريض بسيط من انحطاط الشبكية في عدد كبير من الزرد دون الحاجة للتلاعب من الأسماك الفردية. لذلك، هذا النموذج هو أقل الغازية من نماذج أخرى من انحطاط الشبكية التي تستخدم تقنيات جراحية أو intravitreal يسببها 21-23 وبالتالي قد تظهر على استنساخ أفضل.

بشكل عام، وهذا النموذج MNU الزرد هو أداة مرنة للحث على انحطاط مبصرة محددة وتصور تجديد التالية ليس شكليا فحسب، بل أيضا وظيفيا. ولذلك، فإننا واثقون من أن هذا النموذج يساعد على فهم أفضل للانحطاط وعملية التجدد في شبكية العين الحسية بشكل عام، ويفتح إمكانية لمقارنة نتائجه مع نظام الثدييات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland A6283
Ammonia Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 294993 0.80%
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 05470
Dako Pen Dako, Glostrup, Danmark S2002
DAPI mounting medium Vector Labs, Burlingame, CA, USA H-1200
Eosin Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 45260
Ethanol Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 2860 100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland E10521 Tricaine
Eukitt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 3989
Goat anti-rabbit Alexa 594 Life Technologies, Zug, Switzerland  A11012
Goat normal serum Dako, Glostrup, Danmark X0907
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 320331 0.20%
In situ Cell Death Detection Kit Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland 11684795910 TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution Merck, Darmstadt, Germany 109249
Methylnitrosourea (MNU) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland N4766 Toxic
OptoMotry CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada n.a.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5368
Proteinase K Dako, Glostrup, Danmark S3004
Rabbit anti-PCNA  Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA sc-33756
Superfrost Plus glass slides Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany 10149870
Tris buffered saline (TBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5912
Trizma base Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland T1503
Tween 20 Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P1379
Xylene Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain University of Fribourg, Dept. of Biology n.a. Own fish facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
  3. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  4. Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
  5. Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
  6. Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
  7. Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
  8. Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
  9. Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
  10. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
  11. Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
  12. Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
  13. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  14. Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
  15. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
  16. Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10 (2012).
  17. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
  18. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  19. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  20. Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
  21. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  22. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  23. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 92،
Methylnitrosourea (MNU) يسببها الشبكية البقعي والتجدد في الزرد: التركيب النسيجي والخصائص الوظيفية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner,… More

Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner, C., Sallin, P., Jazwinska, A., Enzmann, V. Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics. J. Vis. Exp. (92), e51909, doi:10.3791/51909 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter