Methylnitrosourea (MNU) يسببها الشبكية البقعي والتجدد في الزرد: التركيب النسيجي والخصائص الوظيفية
Summary
هنا علينا أن نظهر الكمي لاجتثاث الشبكية وتجديد وأثره على وظيفة البصرية باستخدام N -methyl- N -nitrosourea في الزرد الكبار. وتلت فقدان البصر وانخفضت أعداد مبصرة من انتشار في الطبقة النووية الداخلية. وقع تجديد كامل المورفولوجية والوظيفية بعد 30 يوما من العلاج الأولي.
Abstract
أمراض الشبكية التنكسية، مثل التهاب الشبكية الصباغي، مع ما يترتب على حساب الضرر مبصرة لغالبية فقدان البصر في العالم الصناعي. النماذج الحيوانية ذات أهمية محورية لدراسة مثل هذه الأمراض. في هذا الصدد السم مبصرة محددة N -methyl- N -nitrosourea (MNU) وقد استخدم على نطاق واسع في القوارض للحث على دواء تنكس الشبكية. سابقا، أنشأنا نموذجا تنكس الشبكية الناجم MNU في الزرد، ونظام آخر نموذج شعبية في البحث البصري.
وهناك فرق رائعة على الثدييات هو تكوين الخلايا العصبية الكبار المستمر في شبكية العين الزرد وتجديد لها بعد الضرر. لتحديد هذه الملاحظة لقد استخدمنا قياسات حدة الإبصار في الزرد الكبار. وبالتالي، تم استخدام منعكس حركة العين لمتابعة التغييرات الوظيفية في الأسماك غير تخدير. واستكمل هذا مع الأنسجة وكذلك staini المناعىنانوغرام لموت الخلايا المبرمج (النفق) وانتشار (PCNA) لربط التغيرات المورفولوجية النامية.
باختصار، موت الخلايا المبرمج للخلايا مستقبلة للضوء يحدث بعد ثلاثة أيام العلاج MNU، والذي يليه انخفاض ملحوظ من الخلايا في الطبقة الخارجية النووية (ONL). بعد ذلك، لوحظ تكاثر الخلايا في الطبقة النووية الداخلية (INL) وONL. هنا، نحن تكشف أن ليس فقط النسيجية كاملة ولكن أيضا حدوث تجديد وظيفية على مدار الساعة من 30 يوما. نحن الآن توضيح الأساليب لقياس ومتابعة اجتثاث الشبكية الزرد وتجديد باستخدام MNU في تنسيق الفيديو.
Introduction
الرؤية هي الشعور الأكثر أهمية للإنسان وضعف لها أثر اجتماعي واقتصادي عال. في العالم المتقدم، والأمراض التنكسية الشبكية هي السبب الرئيسي لفقدان البصر والعمى بين كبار السن 1. يفهم سبب معظم الأمراض التنكسية الشبكية جزئيا فقط، والحلول العلاجية لاستعادة الرؤية المفقودة محدودة جدا. التهاب الشبكية الصباغي هو مثال نموذجي من الأمراض التنكسية الشبكية مع فقدان مبصرة الأولية 2-3. -methyl- N N -nitrosourea (MNU) يدفع تنكس الشبكية، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع في القوارض لنموذج الأمراض مع خلية مستقبلة للضوء الرئيسي فاة 4. وهي وكيل مؤلكل ويؤدي إلى الأورام الحميدة والخبيثة، التي تظهر عادة بعد عدة أشهر من التعرض 5-7. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتسبب موت الخلايا مبصرة محددة ضمن فترة المراقبة على المدى القصير. وبالتالي، فقدان طبقة الشبكية structuوإعادة وحظت ترقق الشبكية كبير بطريقة تعتمد على التركيز. تم تنشيط الخلايا الدبقية الشبكية، ولكن لا توجد تغييرات في الظهارة الصبغية الشبكية (RPE). شبكية هيولي باطني (ER) الخلايا المرتبطة بالتوتر ويبدو أن المسار الرئيسي للعمل MNU في شبكية العين 8.
أدخلنا مؤخرا MNU كنموذج الكيميائية للحث على انحطاط مستقبلة للضوء في الزرد 9. من بين أسباب أخرى، أصبح الزرد (دانيو rerio) مهم في البحث البصري بسبب التشابه نظامها البصري إلى أن من الفقاريات الأخرى 10. شبكية العين تحتوي على المستقبلات الضوئية الخارجية، التي يمكن تصنيفها إلى أربعة أنواع مختلفة مع مخروط الحساسيات الذروة في الأشعة فوق البنفسجية، قصيرة، متوسطة، وطويلة الطول الموجي من الطيف المرئي وقضيب واحد نوع مبصرة. في الطبقة النووية الداخلية (INL)، وعثر على جثث خلية من القطبين، الأفقي، وinterneurons عديم الاستطالات، وأهلا وسهلال كما سوما خلية من خلايا الدبقية مولر. في طبقة ضفيري الخارجي (اوبل) تتشكل الاتصالات متشابك بين المستقبلات الضوئية في شبكية العين والداخلية، في حين أن طبقة الخلايا الأقرب إلى العدسة هي طبقة الخلايا العقدية (GC)، المكونات التي تشكل محاور عصبية طويلة تضم العصب البصري والجهاز البصري . وتشكل الاتصالات المشبكية بين الخلايا العقدية والخلايا في الطبقة النووية الداخلية في طبقة ضفيري الداخلية (IPL) 11. وRPE تقع خارج الشبكية العصبي الحسي ويحيط شرائح مبصرة الخارجي مع زغيبات قمية طويلة 12. وعلاوة على ذلك، الزرد هو التجديدي للغاية وقادرة على تنمو الدماغ lesioned، شبكية العين، والحبل الشوكي والقلب والأنسجة الأخرى 13. عندما يحدث تلف في شبكية العين، والخلايا في INL، والتي يعتقد أن خلايا مولر، يتم تنشيط ولها القدرة على التمايز إلى مختلف أنواع الخلايا في شبكية العين. وبالإضافة إلى ذلك، كما أنها تولد قضيب الأسلاف، والتي تقع في ONL. حتى آخرurce التي تزود الشبكية من الزرد الكبار مع خلايا جديدة هو منطقة هامشية الهدبية. وهناك حاجة لتحقيق هذا المصدر كثافة مستمرة من المستقبلات الضوئية قضيب في العين الزرد تزايد مستمر 14.
نموذج MNU يمكن استخدام نهج الضمور / تجديد بسيطة وقابلة للتكرار للأنسجة الشبكية. بسبب التشابه معينة من العمليات البيولوجية في الزرد والبشر هذا يمكن أن يفتح الأبواب لتحديد مسارات موت الخلايا المعنية لفحص المخدرات واعصاب المحتملة. واستنادا إلى دراسة سابقة من مجموعتنا، ونحن الآن توضيح أساليب هذا النموذج الزرد MNU التي يسببها من اجتثاث الشبكية وما يترتب تجديد بما في ذلك التغيرات الوظيفية وفقا أشرطة الفيديو مع مختبر 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
سابقا، وقد نقل مجموعتنا نموذج MNU انحطاط مبصرة من القوارض في النظام الزرد 9. ووصف الأحداث التي تلت ذلك ويتبع لمدة تصل إلى 30 يوما. في هذه الفترة الزمنية حدث انحطاط كامل الصرفي الشبكية وتجديد بعد العلاج الأولي. أولا، الأنسجة تكشف خلية قضيب خفض العد من اليوم على 3 مع ح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
- Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura, T., Usui, Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
- Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
- Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
- Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
- Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
- Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10 (2012).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
- Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
- Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
