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Biology

Histological और कार्यात्मक विशेषताओं: Methylnitrosourea (MNU) रेटिना अध: पतन और उत्थान zebrafish में -induced

doi: 10.3791/51909 Published: October 20, 2014

Summary

इस के साथ साथ हम रेटिना डे और उत्थान और वयस्क zebrafish में एन -methyl- एन -nitrosourea का उपयोग दृश्य समारोह पर इसके प्रभाव की मात्रा का ठहराव प्रदर्शित करता है. दृश्य तीक्ष्णता की हानि और कमी हुई फोटोरिसेप्टर संख्या भीतर परमाणु परत में प्रसार द्वारा पीछा किया गया था. पूरा रूपात्मक और कार्यात्मक उत्थान 30 दिनों के प्रारंभिक उपचार के बाद हुई.

Abstract

औद्योगिक दुनिया में दृष्टि हानि के बहुमत के लिए फोटोरिसेप्टर नुकसान खाते परिणामस्वरूप के साथ रेटिना अपक्षयी रोग, जैसे रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा,. पशु मॉडलों जैसे रोगों का अध्ययन करने के लिए निर्णायक महत्व के हैं. इस संबंध में एन -methyl- एन -nitrosourea (MNU) व्यापक रूप से कृन्तकों में इस्तेमाल किया गया है फोटोरिसेप्टर विशिष्ट विष औषधीय रेटिना अध: पतन के लिए प्रेरित करने के लिए. इससे पहले, हम zebrafish में एक MNU प्रेरित रेटिना अध: पतन मॉडल, दृश्य अनुसंधान में एक और लोकप्रिय मॉडल प्रणाली की स्थापना की है.

स्तनधारियों के लिए एक आकर्षक अंतर वयस्क zebrafish रेटिना और नुकसान के बाद अपने उत्थान में लगातार न्यूरोजेनेसिस है. हम वयस्क zebrafish में दृश्य तीक्ष्णता माप कार्यरत है इस अवलोकन यों. इस प्रकार, optokinetic पलटा गैर anesthetized मछली में कार्यात्मक परिवर्तन का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस immunohistochemical staini के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक विज्ञान के साथ पूरक किया गया थाapoptosis के लिए एनजी (TUNEL) और प्रसार (PCNA) के विकास morphological परिवर्तन सहसंबंधी.

संक्षेप में, photoreceptors के apoptosis तीन दिनों बाहरी परमाणु परत (ONL) में कोशिकाओं का एक उल्लेखनीय कमी के बाद है जो MNU उपचार के बाद होता है. इसके बाद भीतर परमाणु परत (लीग) और ONL में कोशिकाओं के प्रसार को मनाया जाता है. इस के साथ साथ, हम एक पूर्ण ऊतकीय लेकिन न केवल भी एक कार्यात्मक उत्थान 30 दिन का समय कोर्स पर होता है कि पता चलता है. अब हम यों और एक वीडियो प्रारूप में MNU का उपयोग zebrafish रेटिना डे और उत्थान पालन करने के लिए तरीकों को वर्णन.

Introduction

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विजन इंसान के लिए सबसे आवश्यक भावना है और इसकी हानि एक उच्च सामाजिक आर्थिक प्रभाव पड़ता है. विकसित दुनिया में, रेटिना अपक्षयी रोगों पुराने वयस्कों 1 के बीच दृष्टि हानि और अंधापन का प्रमुख कारण हैं. सबसे अपक्षयी रेटिना रोगों का कारण केवल आंशिक रूप से समझा जाता है और therapeutical समाधान खो दृष्टि हासिल करने के लिए बहुत सीमित हैं. रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा एन -nitrosourea (MNU) रेटिना अध: पतन लाती -methyl- प्राथमिक फोटोरिसेप्टर नुकसान 2-3. एन के साथ एक रेटिना अपक्षयी रोग का एक विशिष्ट उदाहरण है और इसलिए व्यापक रूप से प्राथमिक फोटोरिसेप्टर कोशिका मृत्यु 4 के साथ रोगों मॉडल के कृन्तकों में प्रयोग किया जाता है. यह एक क्षारीकरण एजेंट है और आमतौर पर जोखिम 5-7 के बाद कई महीनों प्रकट जो सौम्य और घातक ट्यूमर की ओर जाता है. इसके अलावा, यह एक अल्पकालिक प्रेक्षण अवधि के भीतर विशिष्ट फोटोरिसेप्टर कोशिका मृत्यु का कारण बनता है. इस प्रकार, रेटिना परत structu का नुकसानफिर से और महत्वपूर्ण रेटिना thinning एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग से मनाया गया. रेटिना glia कोशिकाओं को सक्रिय कर रहे थे, लेकिन रेटिना वर्णक उपकला (RPE) में कोई बदलाव नहीं पाया गया. Endoplasmic जालिका (ईआर) तनाव संबंधी apoptosis रेटिना 8 में MNU कार्रवाई का मुख्य मार्ग होने के लिए प्रकट होता है.

हमने हाल ही में zebrafish 9 में फोटोरिसेप्टर अध: पतन के लिए प्रेरित करने के लिए एक रासायनिक मॉडल के रूप में MNU शुरू की है. अन्य कारणों के बीच, zebrafish (Danio rerio) क्योंकि अन्य रीढ़ 10 की है कि अपने दृश्य प्रणाली की समानता का दृश्य अनुसंधान में महत्वपूर्ण बन गया है. बाहरी रेटिना पराबैंगनी, लघु, मध्यम में शिखर संवेदनशीलता, और दिखाई स्पेक्ट्रा की लंबी तरंगदैर्ध्य और एक रॉड फोटोरिसेप्टर प्रकार के साथ चार अलग शंकु प्रकार में वर्गीकृत किया जा सकता है जो फोटोरिसेप्टर, शामिल हैं. भीतर परमाणु परत (लीग) में, द्विध्रुवी, क्षैतिज, और amacrine interneurons की सेल शरीर wel के रूप में पाए जाते हैंमुलर glia कोशिकाओं की कोशिका सोमा के रूप में एल. बाहरी उलझन परत (OPL) में फोटोरिसेप्टर और भीतरी रेटिना के बीच synaptic संपर्क लेंस के लिए निकटतम सेल परत जबकि ऑप्टिक तंत्रिका और ऑप्टिक पथ जिसमें लंबे axons फार्म जो घटकों नाड़ीग्रन्थि सेल परत (जीसी), है, का गठन कर रहे हैं . नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और भीतर परमाणु परत में कोशिकाओं के बीच synaptic संपर्कों भीतरी उलझन परत (आईपीएल) के 11 में बनते हैं. RPE neurosensory रेटिना के बाहर स्थित है और लंबे समय तक शिखर माइक्रोविली 12 फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों के चारों ओर. इसके अलावा, zebrafish अत्यधिक पुनर्योजी और lesioned मस्तिष्क, रेटिना, रीढ़ की हड्डी, हृदय, और अन्य ऊतकों 13 regrow करने में सक्षम है. रेटिना क्षति होती है, तो मुलर कोशिकाओं माना जाता है, जो लीग में कोशिकाओं, सक्रिय और विभिन्न रेटिना सेल प्रकार में अंतर करने की क्षमता है कर रहे हैं. इसके अलावा, वे भी ONL में स्थित हैं जो रॉड progenitors, उत्पन्न करते हैं. एक और तोनई कोशिकाओं के साथ वयस्क zebrafish के रेटिना कि आपूर्ति urce सिलिअरी सीमांत क्षेत्र है. इस स्रोत लगातार बढ़ zebrafish आँख 14 में रॉड photoreceptors के एक निरंतर घनत्व प्राप्त करने की आवश्यकता है.

MNU मॉडल रेटिना ऊतक के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अध: पतन / उत्थान दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. कारण zebrafish में जैविक प्रक्रियाओं के कुछ समानता के लिए और मानव में इस शामिल कोशिका मृत्यु रास्ते की पहचान करने के लिए दरवाजे खोल सकता है और संभावित न्यूरोप्रोटेक्टिव दवाओं स्क्रीन करने के लिए. हमारे समूह से पिछले एक अध्ययन के आधार पर हमने अब रेटिना डे और प्रयोगशाला वीडियो 9 अनुसार साथ कार्यात्मक परिवर्तन सहित फलस्वरूप उत्थान के इस MNU प्रेरित zebrafish मॉडल के तरीकों को वर्णन.

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Protocol

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सभी प्रयोगों नेत्र और दृष्टि में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन की दृष्टि अनुसंधान और नेत्र विज्ञान (ARVO) में पशुओं के उपयोग के लिए कथन का पालन.

1 पशु

  1. 26.5 डिग्री सेल्सियस के तापमान और एक 14/10 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र 15 के साथ पानी में मानक परिस्थितियों में 6-12 महीने की आयु के बीच अटल बिहारी (ओरेगन) तनाव के जंगली प्रकार zebrafish (Danio rerio) बनाए रखें.
  2. केंटन पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा अनुमोदन के बाद पशु प्रयोगों के लिए शामिल संस्थाओं के जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों का पालन करें.

2 MNU उपचार

  1. एन -methyl- एन -nitrosourea (MNU) की 150 मिलीग्राम / एल शुष्क पदार्थ युक्त पानी तैयार करें. सावधानी! MNU विषैला होता है; अजन्मे बच्चे को कैंसर, पैतृक आनुवंशिक क्षति या हानि हो सकती है.
  2. कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए MNU युक्त पानी में zebrafish सेते हैं.
  3. जल्दी से zebrafish कुल्लाताजा पानी और MNU बिना एक नई मछली टैंक के लिए मछली डाल दिया. प्रयोगों के लिए वांछित के रूप में लंबे समय के मानक परिस्थितियों में मछली बनाए रखें.

3 दृश्य तीक्ष्णता मापन

  1. , Optomotor प्रणाली शुरू मेनू से 'परीक्षण' का चयन और विकल्प सेट "सरल सीढ़ी", "तीक्ष्णता (freq)" और "यादृच्छिक / अलग" 16 के लिए.
  2. Optomotor प्रणाली ऊपर 1 मीटर के बारे में 500 मिलीलीटर पानी से भरा एक प्रेरणा बोतल स्थापित करें.
  3. परीक्षा कक्ष में एक zebrafish प्लेस और निषेचन की बोतल से कनेक्ट. Optomotor प्रणाली में परीक्षा कक्ष रखें.
  4. माप आरंभ और कंप्यूटर स्क्रीन पर वास्तविक समय में आंख आंदोलन का पालन. इस प्रकार, एक सकारात्मक प्रतिक्रिया ("हाँ") एक नकारात्मक प्रतिक्रिया ("नहीं"), जबकि सही दिशा में लगातार saccades के रूप में परिभाषित किया गया है स्टेशन के साथ मनाया लोगों के समान यादृच्छिक आँख आंदोलनों का प्रतिनिधित्व करता हैआरे तारों. Zebrafish प्रदर्शनी की आंखें तो तीन या अधिक बाद optokinetic प्रतिक्रियाओं (OKR), प्रेस 'हां'; अगर नहीं, प्रेस 'नहीं'.
  5. मेनू में "परिणाम" के अंतर्गत, optokinetic प्रोत्साहन के स्थानिक आवृत्ति की सीमा निर्धारित करने से सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की गई है जो दृश्य तीक्ष्णता, निकालें.

4 प्रोटोकॉल

  1. एथिल 3 aminobenzoate methanesulfonate (200-300 मिलीग्राम / एल) के एक ज्यादा से zebrafish Euthanize और आंखों enucleate.
  2. एक वर्गीकृत शराब श्रृंखला में नमूने निर्जलीकरण तो 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर खारा में 4% paraformaldehyde (पीएफए) (पीबीएस) में पूरे आँखों फिक्स और.
  3. आयल में नमूने शामिल करें, ऑप्टिक तंत्रिका सिर (ONH) के माध्यम से 5 माइक्रोन वर्गों में कटौती और एक गिलास स्लाइड पर उन्हें माउंट.
  4. 4 मिनट के लिए hemalum साथ deparaffized आयल वर्गों दाग और 0.2% हाइड्रोक्लोरिक ACI द्वारा पीछा आसुत जल में स्लाइड्स दो बार डुबकीडी और 0.8% अमोनिया. कम से कम 10 मिनट (एच एंड ई) के लिए नल के पानी में hemalum धुंधला के विकास के बाद 3 मिनट के लिए eosin साथ वर्गों दाग.
  5. मध्यम बढ़ते में निर्जलित स्लाइड्स शामिल करें और प्रकाश खुर्दबीन के नीचे स्लाइड निरीक्षण करते हैं.

5 Immunohistochemistry

  1. टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL)
    1. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 20 माइक्रोग्राम / एमएल proteinase कश्मीर के साथ deparaffinized वर्गों सेते हैं. Tris साथ वर्गों तीन बार धोएं 5 मिनट प्रत्येक के लिए खारा (टीबीएस) buffered.
    2. 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में 50 μl TUNEL प्रतिक्रिया मिश्रण (10% लेबलिंग समाधान और 90% एंजाइम समाधान) के साथ वर्गों सेते हैं. 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
    3. DAPI युक्त मध्यम बढ़ते के साथ स्लाइड माउंट और प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे स्लाइड निरीक्षण करते हैं.
  2. Proliferating सेल परमाणु प्रतिजन (PCNA) धुंधला
    1. 3 मिनट के लिए प्रतिजन पुनर्प्राप्ति बफर (Tris-EDTA + 0.05% के बीच 20, पीएच 9.0) में deparaffinized वर्गों उबाल लें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस के साथ तीन बार धोएं. 100 μl 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर समाधान (टीबीएस + 10% बकरी सामान्य सीरम + 1% गोजातीय सीरम albumin, pH7.6) अवरुद्ध साथ ब्लॉक.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर एक humidified कक्ष में 200 कमजोर पड़ने: एक 1 में विरोधी PCNA प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग. 5 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस + बीच 20 के साथ तीन बार धोएं.
    3. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 500 कमजोर पड़ने: एक 1 में उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पता लगाने खत्म करो.
    4. DAPI युक्त मध्यम बढ़ते के साथ स्लाइड माउंट और प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे स्लाइड निरीक्षण करते हैं.

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Representative Results

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दृश्य तीक्ष्णता:

प्रयोगात्मक सेट अप [स्थानिक आवृत्ति: 0.042 हलकों / डिग्री (सी / डी); इसके विपरीत: 100%; बहाव की गति: 20 डिग्री / सेकंड (डी / एसआरसी); वापस प्रकाश luminance: 152 सीडी / मी 2] इस अध्ययन के वयस्क zebrafish के OKR आकलन सक्षम होना चाहिए. अच्छी तरह से प्रक्रिया सहन जो प्रत्येक zebrafish, 10 मिनट - वीए माप का मतलब अवधि के बारे में 5 था. MNU प्रदर्शन से पहले दृश्य तीक्ष्णता 0,577 ± 0.014 साइकिल / डिग्री (सी / डी) था. 1 150 मिलीग्राम / एल MNU के आवेदन के बाद दृश्य तीक्ष्णता पाठ्यक्रम से पता चलता है. दिन 1 से शुरू, माप, दृश्य तीक्ष्णता में एक उल्लेखनीय कमी का पता चला सुबह 8 से शुरू दिन 3 पर न्यूनतम मूल्यों तक पहुंच गया, दृश्य तीक्ष्णता की वृद्धि 30 दिनों MNU प्रदर्शन के बाद दृश्य तीक्ष्णता की एक पूरी वसूली दिखा, होता है. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए Bonferroni के एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद एक तरह से एनोवा लागू किया गया है. इस प्रकार, दृश्य तीक्ष्णता betwe में मतभेदआधारभूत और माप उपचार दिन 1, 3, 5 के लिए महत्वपूर्ण था के बाद, और 8 (पी <0.001, प्रत्येक), लेकिन नहीं दिन 15 और 30 के लिए एन.

रेटिना अध: पतन के histological आकलन:

एच एंड ई धुंधला समय बिंदु प्रति zebrafish की एक आंख (एन = 3) आधार रेखा के रूप में अच्छी तरह से 3, 8, 15, और उपचार के बाद 30 दिनों में (चित्रा 2) में morphological परिवर्तन यों इस्तेमाल किया गया था. Tappeiner एट अल द्वारा वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया था. 9. इस प्रकार, onl के लीग और गुहा गठन के विघटन सहित रेटिना अध: पतन दिन 3 पर शुरू मनाया गया नाड़ीग्रन्थि सेल परत (जीसी) में कोशिकाओं की संख्या, भीतर परमाणु परत (लीग) और रॉड की संख्या (आर एन) और कोन (सीएन) फोटोरिसेप्टर आंख खंड के दोनों किनारों पर मैन्युअल 250 माइक्रोन ONH के केंद्र से निर्धारित किया गया है (गिना क्षेत्र का आकार 100 माइक्रोन लम्बाई की एक रेटिना अनुभाग को संदर्भित करता है). अध: पतन 30 के लिए पीछा किया गया थादिन इस प्रकार दिन 8 पर पाया रॉड onl नुकसान की अधिकतम के साथ उपचार के बाद, रॉड फोटोरिसेप्टर की संख्या (आर एन) दिन 3 पर 82% तक की कमी हुई, सुबह 8 पर 71% और दिन 15 पर 77% और मूल संख्या का 30 . इसके अलावा, सेल समूहों के संचय मुख्य रूप से लीग में पाया गया था.

Apoptosis की मात्रा:

TUNEL के धुंधला निर्माता के अनुसार प्रदर्शन किया था (सीटू सेल डेथ जांच किट में, रॉश एप्लाइड साइंसेज, Rotkreuz, स्विट्जरलैंड). MNU उपचार के बाद मनाया रेटिना अध: पतन apoptosis की वजह से हुई. यह संवेदी रेटिना में अलग सेल परतों में सकारात्मक TUNEL के धुंधला द्वारा पता चला था. मात्रा का ठहराव के लिए, TUNEL पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या रेटिना की परिधि में शुरू, 450 माइक्रोन लंबाई प्रत्येक के दो रेटिना क्षेत्रों में मैन्युअल निर्धारित किया गया था. इस प्रकार, TUNEL पॉजिटिव कोशिकाओं के बहुमत हालांकि दिन 3 पर ONL में पाया गया था, मर कोशिकाओं को भी उस समय बिंदु पर लीग में देखा गया (चित्रा 3). कोई प्रासंगिक TUNEL पॉजिटिव कोशिकाओं के इलाज से पहले पता लगाने योग्य थे.

सेल प्रसार की मात्रा:

कोशिका मृत्यु के बाद प्रसार का आकलन करने के लिए, retinas Tappeiner एट अल. 9 द्वारा वर्णित के रूप में सेल परमाणु प्रतिजन (PCNA) proliferating के लिए दाग रहे थे. जैसा कि ऊपर वर्णित मात्रा का ठहराव के लिए, PCNA पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या मैन्युअल निर्धारित किया गया था. कोशिका मृत्यु PCNA पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 4) के रूप में देखा प्रेरित प्रसार के द्वारा किया गया. इस प्रकार, proliferating कोशिकाओं की अधिकतम ही दिन 5 पर लीग में मापा गया था, onl (मुख्य रूप से छड़) में कोशिकाओं के अध्ययन (सुबह 30) के अंत तक PCNA के लिए सकारात्मक धुंधला दिखाया. सिलिअरी सीमांत क्षेत्र में कुछ PCNA पॉजिटिव कोशिकाओं से पहले और इलाज के बाद सभी समय बिंदुओं पर detectable थे.

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चित्रा 1:. 150 मिलीग्राम / एल MNU के आवेदन के बाद वयस्क zebrafish में दृश्य तीक्ष्णता के दृश्य तीक्ष्णता मापन. 3 दिन के इलाज के बाद कम से कम से कम दृश्य तीक्ष्णता की महत्वपूर्ण कमी दिन 30 तक (एसडी ± मतलब, n = 3), दिन 5 पर शुरुआत, पूरी वसूली के द्वारा किया गया.

चित्रा 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल MNU उपचार के बाद आधारभूत (ए) और 3 (बी), 8 (सी), 15 (डी), और 30 (ई) दिन में zebrafish रेटिना के ऊतकीय वर्गों दाग एच एंड ई के उदाहरण.. सीएन, शंकु नाभिक; आर.एन., रॉड नाभिक; लीग, भीतर परमाणु परत; जीसी, नाड़ीग्रन्थि सेल परत. तीर लीग में सेल समूहों निशान. स्केल बार 50 माइक्रोन के बराबर होती है.


चित्रा 3:. MNU उपचार के बाद 3 दिन में zebrafish रेटिना में TUNEL पॉजिटिव कोशिकाओं TUNEL पॉजिटिव कोशिकाओं (लाल). कोशिकाओं को मुख्य रूप ONL में स्थित थे लेकिन यह भी लीग में पाए गए. पैनल बी MNU उपचार के बाद छवियों से पता चलता है जबकि पैनल, नियंत्रण दर्शाया गया है. स्केल बार 50 माइक्रोन इंगित करता है.

चित्रा 4
चित्रा 4:. नियंत्रण नमूना की तुलना MNU उपचार के बाद सुबह 5 पर zebrafish रेटिना में PCNA पॉजिटिव कोशिकाओं PCNA पॉजिटिव कोशिकाओं (लाल). पैनल बी MNU उपचार के बाद छवियों से पता चलता है जबकि पैनल, नियंत्रण दर्शाया गया है. स्केल बार 100 माइक्रोन इंगित करता है.

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Discussion

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इससे पहले, हमारे समूह zebrafish प्रणाली 9 में कृन्तकों से फोटोरिसेप्टर अध: पतन की MNU मॉडल स्थानांतरित कर दिया है. आगामी घटनाओं का वर्णन किया है और 30 दिनों के लिए पीछा किया गया था. इस समय अवधि में पूरा रेटिना रूपात्मक अध: पतन और उत्थान के प्रारंभिक उपचार के बाद हुई. सबसे पहले, ऊतक विज्ञान एक कम रॉड सेल तदनुसार दिन 8 पर एक न्यूनतम के साथ पर सुबह 3 से गिनती से पता चलता है, TUNEL के धुंधला 3 दिन MNU उपचार के बाद रॉड photoreceptors के apoptosis को पहचानती है. पुनर्जनन proliferating कोशिकाओं यह कोई प्रसार में वृद्धि हुई है, जहां लीग के विपरीत है दिन 5 पर एक अधिकतम के साथ प्रेक्षण अवधि के अंत तक मनाया जा सकता है, onl में सुबह 5 पर एक अधिकतम के साथ, दिन 3 में लीग में शुरू होता है सुबह 15 सिलिअरी सीमांत क्षेत्र के बाद मनाया गया कुछ PCNA सकारात्मक कोशिकाओं अनुपचारित रेटिना में पाया गया जहां रेटिना के केवल स्थान है. यह लगातार रेटिना न्यूरोजेनेसिस throug के साथ एक क्षेत्र को इंगित करता हैHout जीवनकाल 14. zebrafish में औषधीय क्षतिग्रस्त photoreceptors के उत्थान में शामिल प्रकार की कोशिकाओं की पहचान इस पांडुलिपि के ध्यान में नहीं था. हालांकि, पिछले प्रकाशनों में प्रक्रिया मुलर कोशिकाओं 9,17,18 होने का सुझाव दिया गया है कि लीग में regenerating कोशिकाओं का पता लगाया गया है.

वर्तमान अध्ययन में, हम भी MNU प्रेरित zebrafish मॉडल में कार्यात्मक परिवर्तन का मूल्यांकन किया है. वयस्क मछली में दृश्य समारोह यों, OKR का आकलन कई तकनीकों में से एक मज़बूती से छोटे जानवरों 19 के दृश्य तीक्ष्णता (VA) को मापने के लिए, नियोजित किया गया है. इस प्रकार, एक सहज व्यवहार के आधार पर OKR, जानवरों 20 की पूर्व समय लेने वाली प्रशिक्षण की जरूरत नहीं है. OKR बार बार 'जानवरों सहयोग की स्वतंत्र रूप से हासिल किया जा सकता है, और बड़ी आँखें आसानी से देखा जा सकता है के रूप में इसके अलावा, OKR के आकलन durin दृश्य तीक्ष्णता का पालन करने के लिए एक आदर्श तरीका हैzebrafish में जी अध: पतन और उत्थान. वर्तमान अध्ययन में OKR माप apoptosis की एक अधिकतम पर पता चलता है कि इस MNU आवेदन के बाद ऊतकीय डे और पुनर्योजी परिवर्तन के अनुसार है दिन 30 दृश्य समारोह की एक पूरी बहाली द्वारा पीछा 3 दिन तक एक कम दृश्य तीक्ष्णता, पता चला दिन 3.

MNU तैयार करने के लिए तेजी से और सीधे zebrafish की पानी की टंकी में भंग किया जा सकता है के रूप में मॉडल का एक लाभ यह अपनी सादगी है. MNU साथ zebrafish के उपचार में एक घंटे में किया जाता है. सामूहिक रूप से इलाज किया जा सकता है कि मछली की संख्या केवल मछली टैंक के आकार के द्वारा सीमित है. कुल मिलाकर, इस व्यक्ति मछली की गड़बड़ी की आवश्यकता के बिना zebrafish की एक बड़ी संख्या में रेटिना अध: पतन की साधारण प्रेरण की अनुमति देता है. इसलिए, इस मॉडल intravitreal या शल्य प्रेरित तकनीक 21-23 उपयोग करने वाले रेटिना अध: पतन के अन्य मॉडलों की तुलना में कम आक्रामक है और यह इस तरह एक बेहतर reproducibility प्रदर्शन कर सकते हैं.

सामान्य में, इस zebrafish MNU मॉडल फोटोरिसेप्टर विशिष्ट अध: पतन के लिए प्रेरित करने के लिए और न ही आकृति विज्ञान लेकिन यह भी कार्यात्मक निम्नलिखित उत्थान कल्पना करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है. इसलिए, हम मॉडल बेहतर सामान्य में संवेदी रेटिना में अध: पतन और उत्थान की प्रक्रिया को समझने में मदद करता है और स्तनधारी प्रणाली के साथ अपने परिणाम की तुलना करने की संभावना को खोलता है कि विश्वास कर रहे हैं.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland A6283
Ammonia Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 294993 0.80%
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 05470
Dako Pen Dako, Glostrup, Danmark S2002
DAPI mounting medium Vector Labs, Burlingame, CA, USA H-1200
Eosin Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 45260
Ethanol Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 2860 100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland E10521 Tricaine
Eukitt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 3989
Goat anti-rabbit Alexa 594 Life Technologies, Zug, Switzerland  A11012
Goat normal serum Dako, Glostrup, Danmark X0907
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 320331 0.20%
In situ Cell Death Detection Kit Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland 11684795910 TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution Merck, Darmstadt, Germany 109249
Methylnitrosourea (MNU) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland N4766 Toxic
OptoMotry CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada n.a.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5368
Proteinase K Dako, Glostrup, Danmark S3004
Rabbit anti-PCNA  Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA sc-33756
Superfrost Plus glass slides Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany 10149870
Tris buffered saline (TBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5912
Trizma base Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland T1503
Tween 20 Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P1379
Xylene Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain University of Fribourg, Dept. of Biology n.a. Own fish facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner, C., Sallin, P., Jazwinska, A., Enzmann, V. Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics. J. Vis. Exp. (92), e51909, doi:10.3791/51909 (2014).More

Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner, C., Sallin, P., Jazwinska, A., Enzmann, V. Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics. J. Vis. Exp. (92), e51909, doi:10.3791/51909 (2014).

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