Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generation af Published: October 31, 2014 doi: 10.3791/51934
Automatic Translation
1
1Department of Biological Sciences, Center for Applied Chemical Biology, Youngstown State University

Summary

Enterobacter sp. YSU vokser i glucose minimale salte medium. Auxotrofer genereres ved at omdanne den med en transposome som tilfældigt indsætter sig selv i værtens genom. Mutanter findes ved replikaudpladning fra komplekst medium til minimalmedium. Afbrudte gener identificeres ved gen-redning og sekventering.

Abstract

Prototrofe bakterier vokse på M-9 minimale salte medium suppleret med glucose (M-9 medium), der anvendes som en carbon- og energikilde. Auxotrofer kan genereres ved hjælp af en transposome. De kommercielt tilgængelige, Tn 5 -afledt transposome anvendes i denne protokol består af et lineært segment af DNA indeholdende en R6K γ replikationsorigin, et gen for kanamycinresistens og to mosaik sekvens ender, der tjener som transposasesekvenser bindingssteder. Den transposome, tilvejebragt som en DNA / transposase protein-kompleks, der blev indført ved elektroporering i prototrof stamme, Enterobacter sp. YSU, og tilfældigt indarbejder sig ind i denne værtens genom. Transformanter replika udpladet på Luria-Bertani agarplader indeholdende kanamycin (LB-kan) og på M-9 medium agarplader indeholdende kanamycin (M-9-can). Transformanterne, der vokser på LB-plader can men ikke på M-9-can plader anses for at være auxotrofer. Renset genomiskDNA fra en auxotrof fordøjes delvist, ligeret og transformeret ind i en pir + Escherichia coli (E. coli) stamme. Den R6Kγ replikationsoriginet tillader plasmidet at replikere i pir + E. coli-stammer, og Kanamycinmodstandsmarkør tillader plasmid valg. Hver transformant besidder en ny plasmid indeholdende transposonet flankeret af den afbrudte kromosomale region. Sanger sekventering og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) antyder en formodet identitet afbrudte gen. Der er tre fordele ved at anvende denne transposome mutagenese strategi. For det første er det ikke stole på ekspressionen af ​​en transposase gen af ​​værten. Sekund, transposome indføres i målet vært ved elektroporering, snarere end ved konjugation eller ved transduktion og er derfor mere effektiv. Det tredje R6Kγ replikationsorigin gør det let at identificere muterede gENE som er delvist nyttiggøres i et rekombinant plasmid. Denne teknik kan anvendes til at undersøge involveret i andre egenskaber ved Enterobacter sp gener. YSU eller af en bredere vifte af bakteriestammer.

Introduction

Prototrofe bakterier vokser i M-9 minimale salte medium indeholdende glucose (M-9 medium), omdannelse af glucose gennem centrale carbon metabolisme veje til at generere prækursorer, såsom aminosyrer, nukleinsyrer og vitaminer, til biosyntese 1. M-9 medium indeholder ammoniumchlorid som en nitrogenkilde, natrium og kalium phosphat som en puffer og fosfor kilde, magnesiumsulfat som svovl-kilde og glucose som en carbon- og energikilde. Luria-Bertani (LB) medium er rig på aminosyrer fra trypton og på vitaminer og vækstfaktorer fra gærekstrakt. Det støtter væksten af ​​auxotrofer, der ikke kan syntetisere aminosyrer, vitaminer og andre vækstfaktorer, der er nødvendige for vækst på M-9 medium. Således vil prototrofer vokse i LB og M-9 medium, mens auxotrofer vil vokse i LB-medium, men ikke i M-9 medium. Ved at indføre mutationer i en prototrof population af bakterier og identificere muterede gener, der forårsager auxotrofe fænotyper, er possible at opnå en bedre forståelse af metabolismen i en bakteriestamme.

Transposon mutagenese kan anvendes til at identificere mange af de gener, der er nødvendige for vækst på glucose i M-9 medium. Transposoner indsætte sig tilfældigt i værtsgenomet 2. Ved spotting transposon transformanterne på LB-agarplader og replikaudpladning dem på M-9 medium agarplader, er det muligt at screene for auxotrofer. Afbrudte gener er identificeret gennem gen redning. Denne undersøgelse anvender et kommercielt tilgængeligt Tn5 afledt transposome som leveres som en opløsning af en lineær transposon DNA-segment blandet med transposase protein. DNA-segmentet mangler en transposase gen, men indeholder et gen for kanamycinresistens, et R6K γ replikationsorigin og to mosaik motiver, som er DNA-sekvenser til transposase binding ved hver ende af segmentet 3,4. Da tilsættes transposasen proteinet direkte til DNA, DNA-segmentet aleneer defineret som transposonet, og DNA / transposase protein-kompleks er defineret som transposome. Den transposome transformeres ved elektroporation 5 i en kanamycin følsom vært (figur 1A). Kolonier, der vokser på LB-agarplader indeholdende kanamycin (LB-kan) har transposon inserts (figur 1B), og replika udpladet transformanter, som ikke vokser på M-9 medium agarplader indeholdende kanamycin (M-9-kan) er auxotrofe (Figire 1C). Genomisk DNA fra en mutant er renset og partielt fordøjet med skærende restriktionsendonuclease 4-base, BFU CI (figur 1D). Det ligerede DNA transformeres ind i en stamme af Escherichia coli (E. coli), der indeholder pir-genet (figur 1E). Dette gen giver det nye plasmid, der indeholder transposonet og flankerende værtskromosomale region til at replikere i E. coli 6. Kanamycinresistensgenet tjener som somelectable markør for nye plasmid. Endelig sekventering ved anvendelse af primere komplementære til hver ende af transposonet og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse 7,8 af den resulterende sekvens anvendes til at bestemme identiteten af de afbrudte gener.

Denne transposome mutagenesestrategi giver tre fordele 3. Først, da transposasen protein er bundet direkte til transposon insertion afhænger ikke ekspression af transposasen genet i værten. Når transposonet inkorporerer sig i værtsgenomet, er transposasen nedbrydes, hvilket forhindrer yderligere bevægelse af transposonet. Dog kan yderligere bevægelse ikke forhindres, hvis værten har en endogen Tn 5 transpositional element. Andet indførelse af transposome ved elektroporering gør det muligt at anvende det i en lang række værter. Det fjerner også behovet for at indføre transposonet ved Konjugation eller viral infektion. Begge processer kræver vært modtagelighed. Tredje optagelse af kanamycinresistensgenet og R6K γ replikationsstartområdet i transposome gør det lettere at identificere den afbrudte gen. Transposon-afbrudt regioner kan lagres og sekventeret som plasmider, hvilket eliminerer behovet for at bruge den omvendte polymerasekædereaktion (PCR) teknik til genidentifikation.

Protokollen præsenteres i denne video beskriver hvert trin for transposon mutagenese af Enterobacter sp. YSU 9 ved hjælp af en transposome fra dens indførelse i de bakterielle celler til identifikationen af den formodede gen det afbrudt. I tillæg til de tidligere publicerede protokoller 3,4,10, er detaljerede fremgangsmåder til anvendelse replikaudpladning at screene for auxotrofer fremlagt. Denne mutagenese teknik kan anvendes til at undersøge andre fænotyper, såsom antibiotika og metal modstande i forskellige typer af bakterier, for identgivelse det minimale antal gener, der er nødvendige for vækst under definerede dyrkningsbetingelser i syntetisk biologi undersøgelser, eller for at undervise et laboratorium komponent i en genetik eller mikrobiel fysiologi kursus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Elektroporation af Competent Cells 5,11

  1. Fortyndes en O / N LB kultur af Enterobacter sp. YSU 1/20 i 50 ml frisk LB-medium og vokse med omrystning ved 120 rpm og 30 ° C til en OD (600 nm) mellem 0,4 og 0,6. Eventuelt dyrke andre bakteriestammer deres optimale væksttemperatur.
  2. Chill cellerne på is i 5 minutter og centrifugeres ved 4 ° C og 7.000 x g i 5 min.
  3. Supernatanten, cellerne resuspenderes i 50 ml sterilt iskoldt vand og centrifugeres ved 4 ° C og 7.000 x g i 5 min. Gentag dette trin.
  4. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i et volumen iskold vand svarende til cellepellet volumen. Til langtidsopbevaring, vask af cellerne med 10 ml iskold 10% (v / v) glycerol, resuspender i et lige pellet volumen iskold 10% (v / v) glycerol, opbevares ved -80 ° C, og tø på is før elektroporering.
  5. Tilsæt 0,5 pi af transposome til 40 piceller. Den kommercielt tilgængelige transposome opløsning tilføres ved en DNA-koncentration på 0,33 pg / pl. Selvom 0,33 ug anbefales 0,165 ug DNA er tilstrækkelig.
  6. Anbring cellen / transposome blandingen i en iskold, 0,2 mm, elektroporation cuvette og tryk blandingen til bunden af ​​kuvetten. Shock cellerne ved 25 uF, 200 Ω og 2,5 kV. At sikre, at cellerne forbliver afkølet, opbevares elektroporation kuvetter i en -20 ° C fryser inden brug.
  7. Straks tilsættes 960 pi filter steriliseret super optimal bouillon med katabolitrepression (SOC) medium. Blandes ved pipettering op og ned og overføre cellerne til en steril 1,5 ml mikrofugerør.
    BEMÆRK: De celler begynder at dø efter chok, men salt i SOC-medium tillader dem at komme sig. At spare, er det ikke nødvendigt at tilsætte transposome eller at chokere de negative kontrol celler. Blot tilføje 960 ul sterilt SOC medium til det.
  8. Inkubere cellerne ved 30 ° C feller 45-60 minutter under omrystning ved 120 rpm. Dette giver tid til transposome at rekombinere med værtsgenomet og for cellerne at udtrykke kanamycinresistens.
  9. Spred 100 pi celler på en LB-can agarplade og inkuber pladen O / N ved 30 ° C. Opbevar resterende transformation mix i køleskab ved 4 ° C. Spredes yderligere beløb på et senere tidspunkt op til 2 uger efter den første elektroporering, hvis det kræves.

2. klods af transformanter

  1. Tape et gitter i låget af en tom 100 x 15 mm petriskål. Kopier et gitter fra "et kort kursus i Bakteriel Genetik" 12.
  2. Tegne en linie i bunden af ​​et LB-kan-agarplade. Brug et lille stykke tape for at forankre det til gitret låget, så at gitteret er synlig gennem agaren. Sikre, at linjen på bunden af ​​pladen flugter med toppen, midten af ​​gitteret. Forankring pladen med tape holder den glider, der giver mulighed for selv gridding. Linjen letter koloni identifikation efter replikaudpladning.
  3. Vælge en enkelt transformant med en steril tandstikker og spot den i midten af ​​et kvadrat i gitteret. Bare tryk kolonien og stedet. Må ikke grave tandstikker i agaren. For at undgå forurening pladen håndtere tandstikker kun den ene ende.
  4. Spot anden transformant i et tilstødende firkant som i trin 2.3. Når pladen er fyldt, inkuberes det O / N ved 30 ° C. Dette er den store plade.

3. replikaudpladning at Bestem auxotrofen Fænotype 12

  1. For hver plade blev gitterinddelt, at en stabel af tre friske agarplader nummereret en gennem tre: en for LB-can, to for M-9-kan og tre for LB-can. Tør pladerne med bunden i vejret, O / N, ved 37 ° C før brug.
  2. Tegn en linje på toppen af ​​hver plade som i trin 2.2.
  3. Tør replikaudpladning værktøj med 70% ethanol, placere en steril velveteen firkant på toppen af ​​replikaudpladning tilol og klemme bomuldsfljl firkant ned. Hænder vrimler med mikrober, selv efter vask dem. Forhindre indførelse af kontaminerende mikroorganismer ved håndtering af bomuldsfljl torv ved kanten.
  4. Ret linie på master pladen med en linje trukket på klemmen og placere pladen på toppen af ​​bomuldsfljl pladsen. Påfør let tryk for at overføre bakterier fra pladen til bomuldsfljl pladsen. Vær omhyggelig med ikke at smøre bakterier. Fjern master pladen fra bomuldsfljl torv.
  5. Juster linje trukket på plade nummer et med linjen på klemmen og placere den på toppen af ​​bomuldsfljl pladsen. Forsigtigt tryk til at overføre bakterierne fra velveteen vinkelret på pladen. Fjern plade nummer et.
  6. Kassér bomuldsfljl torv i et bæger med vand og placere en ren, steril velveteen firkant på replikaudpladning værktøj som i trin 3.3. Dette trin forhindrer over-podning som forårsager gennembrud vækst og falske positive resultater.
  7. Justerlinje på plade nummer et med linjen på klemmen og placere den på toppen af ​​det nye velveteen pladsen. Påfør let tryk for at overføre bakterier fra plade nummer ét til bomuldsfljl pladsen. Fjern plade nummer et.
  8. Juster linje trukket på plade nummer to med linjen på klemmen og placere den på toppen af ​​bomuldsfljl pladsen. Påfør let tryk for at overføre bakterier fra bomuldsfljl firkant til plade nummer to. Fjern plade nummer to.
  9. Gentag trin 3.8 til plade nummer tre. Den tredje plade er en kontrol for fuldstændig overførsel fra master pladen til de to andre plader. Kassér bomuldsfljl torv i et bæger med vand. At genbruge velourfløjl pladser, autoklaveres bæger indeholdende de forurenede velourfløjl pladser, vaske dem, tørre dem, pak dem ind i alufolie og re-autoklaveres dem.
  10. Pladerne inkuberes ved 30 ° CO / N. Kolonier, der vokser på begge LB-can agarplader men ikke vokser på M-9-can plader anses for at være auxotrofer (
  11. Streak ud auxotrofer fra plade nummer et over på en frisk LB-can agarplade, og inkubér pladen ved 30 ° CO / N.
  12. Streak ud til isolering 3 kolonier fra stribe plade i trin 3.11 ned på en frisk LB-can plade. Inkubér pladen ved 30 ° CO / N. Dette sikrer, at mutanten er godt isoleret. Opdele pladen i tredjedele og streak ud hver koloni i et afsnit.
  13. Spot kolonier fra de stribede ud kolonier afledt fra trin 3.12 på en frisk LB-can plade til dannelse af et gitter som i trin 2.1-2.4. Hver mutant bliver igen testet tredobbelt.
  14. Repliker plade igen som i trin 3,1-3,10 at bekræfte auxotrofen fænotype.

4. Gene Rescue

  1. Dyrk en 3 ml O / N-kulturen af ​​en isoleret mutant koloni fra trin 3.13 i flydende LB-can medium ved 30 ° C. Oprense genomisk DNA fra 1 ml kultur ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt genomisk DNA oprensningskit.
  2. Opsæt en blanding af 0,025 UBFU CI restriktionsendonuklease og 14 pi 1 pg / pl genomisk DNA i en 20 pi reaktion på is. Da BFU CI skærer transposonet på tolv forskellige steder, kan det være mere effektivt at anvende restriktionsendonuklease, BFA I eller Hae III, som skærer transposonet på to og tre forskellige steder hhv.
  3. Inkubere reaktionen ved 37 ° C i 25 minutter og derefter ved 80 ° C i 20 minutter for at inaktivere enzymet. Analysere 3 pi af det delvist fordøjede DNA på en 0,8% agarosegel (figur 3). En vellykket partiel fordøjelse resulterer i et smear fra over 10 kb ned til bunden af ​​gelen.
  4. Ligere 15 pi delvist spaltet genomisk DNA under anvendelse af 800 enheder T4 DNA ligase i en 500 pi reaktion. Inkubere reaktionen O / N ved 4 ° C. Den store reaktionsvolumen maksimerer ligering af enkelte fragmenter til sig selv og minimerer vekselvirkninger mellem to eller flere DNA-fragmenter.
  5. Nedbørte det ligerede DNA ved tilsætning af 50 pi 3 M natriumacetat, pH 5,5, og 1 ml 95% ethanol og inkubere det ved -20 ° C i 20 minutter.
  6. Mikrofuge DNA ved 4 ° C og 13.500 x g i 10 minutter, vaskes pelleten med 70% ethanol, tørres i en centrifugal vakuumkoncentrator og resuspenderes det i 10 pi nuclease frit vand. Alternativt kan DNA'et lufttørret ved stuetemperatur i 15 minutter.
  7. Anvende 4 pi resuspenderede DNA til at transformere E. coli-stamme ECD100D pir eller ECD100D pir116 ved elektroporation som i afsnit 1. R6K γ replikationsorigin kræver en bakteriestamme med en pir gen til at replikere 6. Pir stamme resulterer i lave kopi plasmider og den pir116 stamme indeholder en pir-mutantgen, der resulterer i høje kopi plasmider. Hver transformant indeholder et nyt plasmid med transposonet og et område af den afbrudte kromosom (figur 1E).
  8. Inoculspiste 5 ml LB-can medium med en enkelt koloni, vokser det O / N med omrystning ved 120 rpm og 37 ° C, og oprense plasmid DNA fra hele O / N-kulturen under anvendelse af et kommercielt kit.
  9. Fordøje 14 pi af plasmidet ved hjælp af restriktionsendonukleasen Xhol Sørg slutvolumenet af reaktionen er 20 pi. Dette enzym genkender et sted i midten af ​​transposon ved 5 'enden af ​​kanamycinresistensgenet. Analysere 10 pi af den nedbrudte og fordøjet plasmid på en 0,8% agarosegel (figur 3). Plasmidet består af 2 kb transposon plus flankerende værts-DNA.

5. DNA-sekventering

  1. Sekventere plasmid under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt sekventeringskit, primere, der er homologe til hver ende af transposonet, og en kapillær sekventering analysesystem. Alternativt kan plasmidet blive sendt til en ekstern institution til sekventering.
  2. Brug molekylvægt standard (1 kb stige) igelen at anslå størrelsen af ​​plasmidet. Derefter estimere antallet af nanogram (ng) af plasmid, der er nødvendig for 50 fmol.
  3. Måle koncentrationen af plasmid-DNA under anvendelse af et spektrofotometer ved bølgelængder på 260 nm (A 260) og 280 nm (A 280). Sørg for at lysets vejlængde gennem kuvetten er 1 cm. Bestemme koncentrationen ved at multiplicere absorbansen ved 260 nm med 50 ng / pl. Høj kvalitet plasmid-DNA vil have en A260 / A280-forhold på mellem 1,8 og 2,0.
  4. Mængden af ​​DNA, der kræves for hver sekventeringsreaktion er antallet af ng kræves til 50 fmol divideret med koncentrationen af ​​plasmidet. Bland mængden af ​​krævede plasmid med vand for at bringe det samlede volumen op til 10 pi.
  5. Varm plasmid DNA / vand-blanding ved 96 ° C i 1 min og derefter afkøles til stuetemperatur.
  6. Tilføje 8 pi masterblanding fra sekventering kit og 2 pi af 1,6 uM af en af ​​sekventeringsprimerne.
  7. Follav protokollen fra sekventering kit til termisk cycler program og reaktion oprydning.
  8. Analysere hver prøve ved hjælp af en kapillær DNA-analyse system.
  9. Anvende en kommercielt tilgængelig softwarepakke at se DNA-sekvensen. Søge efter sekvensen, "5'-GAGACAG-3 '", som er de sidste 7 bp af transposon (figur 4). Sekvensen før 5'-enden af ​​denne 7 bp segment tilhører transposonet. Sekvensen efter 3'-enden af ​​denne 7 bp segment hører til den afbrudte gen.
  10. Bestem den mulige funktion af den afbrudte gen ved hjælp af Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Brug følgende link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Indsæt sekvensen af ​​interrupted gen i søgefelt, vælg "andre" under databasen og klik på "BLAST" nederst på siden. Når resultatet vises, skal du rulle ned på siden for at se resultaterne alignment (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transformation af Enterobacter sp. YSU ved elektroporering med transposome indledt tilfældig genom insertion i værtsgenomet (figur 1A, B). En vellykket elektroporation gav adskillige tusinde transformanter, der voksede på LB-can plader. Til opnåelse af 300-400, godt fordelte kolonier per plade, blev mængden af ​​transformation blanding spredes på hver LB-can agarplade optimeres. Hver transformant indeholdt mindst én transposon insert, men det var ikke klart, om et vigtigt gen for vækst på M-9 medium blev afbrudt uden screening ved replikaudpladning. Transformanter blev overført til frisk LB-can plader i gitre af 88 og replika udpladet på M-9 medium. Bemærk at sikre, at transposonet opretholdes i transformanterne, anbefaler protokoller sektion tilsætning kanamycin til M-9 medium plader. M-9 medium blev suppleret med kanamycin i dette tilfælde, men det var stadig muligt at opnå auxotrofer uden. I (figur 1C). De øvrige 86 kolonier havde ikke en afbrydelse i et gen, der kræves for vækst på M-9 minimal medium.

Nogle kolonier kan være blevet forurenet med tilstødende kolonier under replikaudpladning. At isolere en mutant som en ren kultur, blev det stribede fra LB-can plade nummer et i trin 3.1 på en frisk LB-can agarplade og dyrket O / N ved 30 ° C. Tre kolonier, der voksede blev udstrøget på en anden frisk LB-can plade og dyrket O / N ved 30 ° C. Derefter blev en koloni, der opstod fra hver af de tre kolonier spottet på en tredje frisk LB-can plade. Replikaudpladning tilbage på en M-9 minimal medium plade bekræftet i tre eksemplarer den auxotrofe fænotype, som blev observeret i figur 2. Af de 1.760 transposon transformanter screenes i en 2013 Microbial Physiology naturligvis var 23 auxotrofer.

Den afbrudte gen fra en auxotrof blev derefter identificeret ved anvendelse af genet redning. En auxotrof koloni fra den anden Udstrygningspladeteknikken ovenfor (trin 3.13) blev dyrket O / N i LB-medium can, og genomisk DNA blev oprenset fra kulturen ved anvendelse af et genomisk DNA oprensningskit. Agarosegelelektroforese viste, at det oprensede DNA var større end 10 kb i størrelse (figur 3, bane 2). At bryde det genomiske DNA til mindre fragmenter, der indeholdt transposonet og flankerende afbrudt værtsregionernes (figur 1D) blev det delvist fordøjet med 0,025 enheder af BFU CI i 25 minutter ved 37 ° C. Denne restriktionsendonuklease nedskæringer på 5'-GATC-3 'websteder, der opstår cirka hver 200 til 500 basepar. Selv om derer tolv 5'-GATC-3 'sites inden for transposonet, vil et stort antal af fragmenter, der indeholder det intakte transposon og flankerende værtsgenomet stadig være til stede i det delvist fordøjede DNA. Bane 3 i figur 3 viser delvist spaltet genomisk DNA med en udstrygning af DNA begynder over 10 kb, hele vejen til bunden af gelen til under 0,5 kb. Hvis DNA smear begynder under 2 kb, størrelsen af ​​transposonet, så DNA'et er blevet fordøjet for meget. Det vil være nødvendigt at reducere mængden af ​​tilsat enzym, 37 ° C inkubationstid, eller begge dele. Hvis der ikke er smear og lane med det fordøjede DNA er den samme størrelse som DNA med den nedbrudte DNA, så ingen spaltning forekom. Det vil være nødvendigt at øge mængden af ​​tilsat enzym, 37 ° C inkubationstid eller begge dele. Stedet for at bruge BFU CI, kan det være muligt at anvende restriktionsendonukleaserne BFA I eller Hae III, som sender en transposon på to og tre forskellige stederhhv. Anvendelse af et af disse enzymer kan øge E. coli pir + transformation udbytte under gen redning.

Det delvist fordøjede DNA blev ligeret i en 500 pi reaktion. Denne øgede mængde minimeres interaktioner mellem andre DNA-fragmenter og maksimeret sandsynligheden for, at hvert fragment ligeret med sig selv til dannelse af et cirkulært molekyle. Det ligerede DNA blev udfældet og transformeret ved elektroporering ind i E. coli stamme ECD100D pir116. Transformationen blanding blev spredt på LB-can plader. Kolonier, der voksede indeholdt et nyt plasmid, der består af transposonet og et område af den afbrudte vært genet (figur 1E). Antallet af kolonidannende enheder varierede fra 0 til 2.000 pr ml transformation mix. Hvis den flankerende kromosomale region kodede for et protein, der var toksisk for E. coli vært, transformationseffektivitet var lav eller kun en lille del af chromoformennogle var knyttet til det nye plasmid. Plasmid-DNA blev oprenset fra en kultur, der blev inokuleret med en enkelt transformant og fordøjet med restriktionsendonucleasen Xhol, som har anerkendt et enkelt sted i centrum af transposonet nær 5'-enden af kanamycinresistensgenet. Bane 4 i figur 3 indeholdt den nedbrudte plasmid og bane 5 indeholdt den fordøjede plasmid. Fordi oprenset plasmid-DNA har tendens til at blive supersnoet det migrerede ved en hurtigere hastighed end den samme streng af lineær fordøjet DNA. Den korrekte størrelse af dette plasmid var 3 kb. Det indeholdt 2 kb af transposonet, plus ca. 1 kb af den afbrudte værtsgenet. Hvis den flankerende værts-DNA indeholder en eller flere Xhol genkendelsessteder, to eller flere plasmid bands vil blive observeret i banen med XhoI fordøjede DNA.

Figur 4 viser en sekventering resultat for et plasmid, som blev isoleret fra en auxotrof. Efter fjernelse af short transposon sekvens i fed, blev værten DNA-sekvensen fremlagt for Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse 7,8. En af BLAST resultater foreslog, at den afbrudte sekvens svarer til en Enterobacter cloacae subsp. cloacae NCTC 9394 (emb | FP929040.1 |) genet for chorismatmutase, som er involveret i biosyntesen af L-tyrosin og L-phenylalanin (figur 5) 13. Undertiden under ligering af delvist fordøjet genomisk DNA, lineær transposon ligerer til en eller flere andre BFU CI fragmenter. Dette kan gøre BLAST resulterer forvirrende, fordi identiteten af ​​et gen ændrer brat. For eksempel de første 41 basepar af et andet auxotrof matches til et gen for glutamat-5-semialdehyd-dehydrogenase, som er involveret i biosyntesen prolin 1. Så, de næste 219 basepar matches til et gen for et ribonukleosid-diphosphat reduktase subunit, efterfulgt af et par segment 62 base for lipid-A-disacc haride kinase. De sidste 295 basepar segment matches til glutamat-5-semialdehyd-dehydrogenase igen. Tilstedeværelsen af 5'-GATC-3 'sites for BFU CI foreslået, at to mindre DNA-fragmenter ligeret ind i reddet plasmid. Således ikke fortynding af delvist spaltet DNA til ligeringsreaktioner ikke helt eliminere baggrund forårsaget af ligering af mindre fragmenter. Fra disse resultater blev det konkluderet, at transposome indsat sig i genet for glutamat-5-semialdehyd-dehydrogenase, fordi sekvensen for dette gen var umiddelbart støder op til transposonet. Andre auxotrofer indeholdt afbrydelser i genet for cystathion beta lyase involveret i biosyntesen methionin; for histidinol dehydrogenase involveret i histidin-biosyntese; for phosphoserin phosphatase involveret i serin, glycin og cystein biosyntese; og for ketol-syre reduktoisomerasegenet involveret i leucin, isoleucin og valin biosyntese 1.

nt "FO: keep-together.within-page =" altid "> Figur 1
Figur 1. Transposon mutagenese. (A) Bakterielle celler indeholdende et gen, der kræves for vækst på M-9 minimale salte medium indeholdende glucose. Boxed M-9 repræsenterer en auxotrof gen. (B) Den transposome indføres i den bakterielle stamme ved elektroporering og transposasen protein bundet til hver mosaik ende (pile) tilfældigt indsætter transposon i værtskromosomet 3,4. Kun transposon indeholdende transformanter vil vokse på LB-can mediumplader. (C) Transformanterne er replika udpladet på M-9 medium indeholdende glucose og på LB-can medium. Transformanterne, der undlader at vokse (overstreget) på M-9 medium indeholdende glucose er auxotrofer. (D) Genomisk DNA oprenses fra auxotrofer og er delvist fordøjet med 4-basen cuttis, BFU CI, der genkender DNA-site, 5'-GATC-3 '. (E) Det delvist fordøjede DNA behandles med T4 DNA-ligase og transformeret ved elektroporering ind i E. coli-stamme ECD100D pir at danne en ny plasmid, der indeholder transposonet og den afbrudte kromosomale gen, der kræves for vækst på M-9 medium. Pir-genet tillader cirkulære DNA-fragmenter, som indeholder R6K γ replikationsstartområdet i transposon til at tjene som et replikationsstartsted i nye plasmid 6. Kanamycinresistensgenet tjener som en selekterbar markør for den nye plasmid. Plasmidet oprenses, og et ~ 500 bp sekvens af det afbrudte gen bestemmes ved anvendelse af primere (pile), som er homologe til hver ende af transposonet. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.


Figur 2. replikaudpladning. (A) Grid af transformanter der blev overført til en LB-agarplade can. (B) Grid af de samme transformanter, som blev overført til en M-9 medium plade. Auxotrofer voksede på LB-can plader, men ikke på M-9 mediumplader. Disse er identificeret ved de sorte firkanter. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. 0,8% agarosegel Bane 1:. 1 kb stige. Bane 2: ufordøjet genomisk DNA. Bane 3: BFU C I delvist spaltet genomisk DNA. Bane 4: Ufordøjet reddet plasmid. Bane 5: XhoI fordøjede reddet plasmid.

Figur 4
Figur 4. Delvis DNA-sekvens af et plasmid. Sekvensen med fed er en del af transposonet og var ikke indgives for BLAST analyse. Resten af ​​sekvensen er et segment af de reddede gener fra værten.

Figur 5
Figur 5. Analyse BLAST 7,8. Fra den første base (Query), vises det afbrudte gen til at kode en Enterobacter cloacae chorismatmutase, som er involveret i phenylalanin og tyrosin-biosyntese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Transposon mutagenese ved hjælp af en transposome er et effektivt værktøj til at generere auxotrofer i Enterobacter sp. YSU og andre former for Gram-negative og Gram-positive bakterier 3,4. Processen blev indledt ved at indføre Tn5-afledte transposome i værten ved elektroporering. At identificere kolonier med inserts den utransformerede stamme mål skulle være følsomme over for kanamycin for at selektere for resistens-markør, der bæres af transposonet. Nogle værter producere restriktionsendonukleaser, som nedbryder transposonet DNA før den kan rekombinere med værtsgenomet. Tilsætning af en restriktionsendonuklease inhibitor til elektroporation mix kan minimere nedbrydning og forøge omdannelsen udbytte 3. Under forberedelsen af ​​elektroporation kompetente bakterier, var det vigtigt at fjerne så meget salt som muligt for at forhindre en elektrisk lysbue eller gnister, der dræber bakterier forårsaget af tilstedeværelsen af ​​salt. Selv i fravær afen lysbue, begyndte cellerne at dø hurtigt efter at chokere dem. Tilføjelse salt indeholder SOC vækstmedium straks restaureret den osmotiske balance, minimeret celledød og forøget transformationseffektivitet 5. Kanamycinresistente transformanter blev derefter spottet på en frisk LB-can plade og replika udpladet på M-9 minimalmedium agar. For at forhindre over-podning som kan forårsage falske positive resultater, der savner mulige auxotrofer blev velourfløjl firkanter tændt ved trin 3.6 før resten af ​​pladerne blev inokuleret. Så i løbet replikaudpladning, var lige nok pres anvendes til at overføre kolonierne uden at forårsage udtværing eller forurening mellem tilstødende kolonier.

De muterede gener i auxotrofer blev identificeret gennem gen redning. Genomisk DNA fra hver auxotrofen blev klippet ved hjælp af en partiel fordøjelse med hyppige base cutter BFU C I. Delvise digestions hjælp BFA I eller Hae III, som skære transposon mindre hyppigt, kan forbedre transposon transformation effektivitet. Det er også muligt at anvende en fuldstændig fordøjelse med andre restriktionsendonukleaser, 6-base og 8-base cutters, der mangler sites inden for transposonet. Det fordøjede DNA blev derefter ligeret og transformeret ind i E. coli-stamme ECD100D pir eller ECD100D pir116 6. Selvom E. coli pir116 stamme blev transformeret ved elektroporering i trin 4.8, er det også muligt at anvende kemisk kompetente celler. I dette tilfælde skal hele transformation spredes til opnåelse af et stort udvalg af reddede plasmider. Pir-genet giver mulighed for cirkulariserede transposon til at replikere som et lavt kopital, og pir116 mutant gen gør det muligt at replikere som et høj kopi plasmid. Lave udbytter transformation ved hjælp af pir116 stamme kan skyldes ekspression af toksiske genprodukter fra den oprindelige vært. Toksicitet kan reduceres ved hjælp af lavkopi pir stamme, kan dog gøre sekventering mere udfordrende.

Genomisk sekventering 10 og PCR-sekventering 14 er alternative metoder til gen-redning. Det genomiske sekvensering metode sekvenser flankerende kromosomområder direkte fra oprenset genomisk DNA. Denne strategi er nyttig, når genomet af målorganismen er allerede blevet sekventeret. Når den muterede region er blevet identificeret af genomisk sekventering og BLAST, kan hele regionen forstærkes ved PCR og klonet til yderligere analyse. PCR-fremgangsmåden anvender to PCR-reaktioner og fire forskellige primere. Den første reaktion par et transposon homolog primer (primer 1) med en degenereret primer, der indeholder en kort DNA, linkersekvens (primer 2). Den anden PCR-reaktion er en nested PCR reaktion, parring anden transposon homolog primer (primer 3) med en homolog linkersekvens primer (primer 4). Primingsitet for primer 3placeret på 3'-siden af ​​priming site for primer 1. Derefter amplicand fra anden PCR-reaktion renset og sekventeret. Denne automatiseret sekventering metode forstærker DNA direkte fra de mutante celler, hvilket eliminerer behovet for både genomisk DNA oprensning og plasmidredning.

Stedet for at identificere gener involveret i auxotrofi kan transposon mutagenese også anvendes til at undersøge andre let analyseres fænotyper. Enterobacter sp. YSU er en multi-metal resistent bakteriestamme, som også er resistente 100 ug / ml ampicillin (upublicerede data). Den minimale hæmmende koncentration (MIC) for HgCl2 er 70 uM ZnCl2 er 800 uM, AgNO3 er 80 uM og NaAsO 2 er 14 mM 9. Efter indføring af transposome i denne stamme og gridding transformanter på LB-plader can kan grid kolonier replika udpladet på medium indeholdende metaller ved koncentrationer under MIC for denne bacterial stamme. Redning og sekventering af et afbrudt gen fra en mutant med en sænket MIC kan afsløre et gen, der giver resistens over for et af disse metaller.

Ud over at generere mutanter kan transposome anvendes som en vektor in vitro eller in vivo til at identificere gevinst funktions gener, såsom antibiotika eller metal resistens. Til in vitro-strategi, genomisk DNA fra Enterobacter sp. YSU fordøjes med en restriktionsendonuklease der genkender steder udenfor transposonen. DNA ligeres og blandes med transposome i en buffer, der indeholder Mg2 +. Efter rekombination mellem transposonet og tilfældige genomiske fragmenter, E. coli-stamme ECD100D pir transformeres med DNA og sprede på plader indeholdende ampicillin eller et metalsalt. Kolonier, der vokser vil have et nyt plasmid, der indeholder transposonet placeret ved siden af ​​værtens resistens gen. Til in vivo strategy, Enterobacter sp. YSU transformeres med transposome. Derefter er hele transformation reaktion dyrket i LB-kan flydende medium for at selektere for en stor population med tilfældige transposon inserts. Genomisk DNA spaltet med en restriktionsendonuklease, som genkender steder uden for transposome, ligeret og transformeret ind i E. coli-stamme ECD100D pir. Som i in vitro-metode, transformanter spredes på ampicillin eller metalplader. Igen vil det resulterende plasmid består af transposonet indsat ved siden af ​​et resistensgen. Disse to strategier vil lykkes kun, hvis målet resistensgenet kan udtrykkes, og er aktiv i E. coli-stamme.

Transposon mutagenese kan anvendes til at identificere det minimale antal af gener en bakteriestamme kræver for vækst 15,16. To transposomes indeholdende loxP-steder og forskellige antibiotikaresistensmarkører er nødvendige for denne strategi ina bakteriestamme med en kendt genomsekvens. Efter to transposoner integrere udtrykt cre-rekombinase katalyserer en rekombinationsreaktion mellem to loxP-sites, fjerne kromosomale regioner mellem transposoninsertioner. Kendskab til genomsekvensen gør det muligt at identificere, hvilke gener er elimineret. Evnen til at vokse viser, at de eliminerede gener ikke er nødvendige for vækst. Denne teknik er arbejdskrævende, og en minimal genom for vækst ved hjælp af denne strategi er endnu ikke afsluttet. En automatiseret transposon mutagenese undersøgelse af Pseudomonas aeruginosa under anvendelse af PCR-sekventering skønnes dog, at 300-400 gener var nødvendige for væksten af denne bakterie i rigt medium 14. Denne undersøgelse ikke bruge loxP- / cre rekombinasesystem.

Mikrober med minimale genomer er nyttige for syntetisk biologi 17. En bakteriestamme med minimal et genom er especially anvendelige til at eliminere produktionen af ​​uønskede biprodukter. For eksempel er Clostridium acetobutylicum (C. acetobutylicum) anvendes til fremstilling af biobrændstoffer, butanol 18. Under sin vækst, denne stamme producerer butanol ved enden af ​​dens eksponentielle vækstfase lige før den går ind i stationær fase. På dette punkt, bliver følsom over for butanol og andre gæringsprodukter og danner hvilende endosporer, der ikke længere syntetisere produkt. Da transposomes er blevet anvendt til at studere Clostridium perfringens 3, kan det være muligt at anvende en lignende transposome / loxP / Cre-rekombinase systemet til at konstruere en stamme af C. acetobutylicum, der mangler generne for uønskede gæringsprodukter og sporedannelse, men indeholder gener for større butanol tolerance. Denne stamme vil øge produktudbyttet med minimale urenheder.

Sammenfattende denne video tidsskriftsartikel, giver en komplet step trin beskrivelse af de procedurer, der anvendes til at skabe auxotrofer ved transposon mutagenese. Det dækker indføre transposome ved elektroporation screening for mutationer ved replikaudpladning, redning muterede gener ved kloning teknikker og identifikation af afbrudte gener ved DNA-sekventering. Denne teknik kan anvendes til at identificere funktionen af ​​ukendte gener eller for eventuelt at konstruere en bakteriestamme, der kan anvendes i en industriel proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatteren vil gerne takke alle mine bachelor Frie Forskningsråd Studerende og alle mine Mikrobiel Fysiologi studerende, der blev testet mine transposon mutagenesefremgangsmåder ideer i løbet af 2010-2014 forårssemestrene. Dette arbejde blev finansieret af Biologisk Institut på Youngstown State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit Epicentre (Illumina) TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) ECP09500 Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) EC6P095H Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts Thermo Fisher DF048517
Lennox LB Broth Thermo Fisher BP1427-2
Agar Amresco, Inc. J637-1KG Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate  Amresco, Inc. 0408-25G When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate Amresco, Inc. 0643-1KG
Yeast Extract Amresco, Inc. J850-500G
Tryptone Amresco, Inc. J859-500G
KCl Sigma-Aldrich P4504-500G
NaCl Amresco, Inc. X190-1KG
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
MgSO2 Fisher Scientific BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I NEB R0636S Partial digestion of genomic DNA
Xho I NEB R0146S Plasmid digestion
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Nuclease Free Water Amresco, Inc. E476-1L For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1460 Plasmid purification
Replica Plating Block Thermo Fisher 09-718-1
Velveteen Squares Thermo Fisher 09-718-2 Replica plating
PetriStickers Diversified Biotech PSTK-1100 Grid for replica plating
Petri Dishes Thermo Fisher FB0875712
Gene Pulser II BioRad Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm BioExpress E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator Labconco 7970010 Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System Beckman Coulter DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0 Life Technologies 12605099 DNA sequence analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
  2. Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
  3. Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
  4. Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
  5. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  6. Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
  7. Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
  8. Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
  9. Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
  10. Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
  11. Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
  12. Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
  13. Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
  14. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
  15. Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
  16. Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
  17. Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
  18. Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).

Tags

Mikrobiologi auxotrofen transposome transposon mutagenese replikaudpladning glucose minimal medium kompleks medium,
Generation af<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofer Brug Transposon Mutagenesis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Caguiat, J. J. Generation of… More

Caguiat, J. J. Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis. J. Vis. Exp. (92), e51934, doi:10.3791/51934 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter