Summary
肠杆菌属。 YSU生长在最小的葡萄糖盐培养基。通过用转座子其中随机插入本身入宿主基因组转化它产生营养缺陷型。突变体是通过影印从复合培养基到基本培养基中。打断了基因鉴定的基因救援和测序。
Abstract
原养细菌生长上的M-9基本盐培养基中添加葡萄糖（M-9培养基），它被用作碳源和能源。营养缺陷型可以使用转座体来生成。在这个协议中使用的可商购的，Tn的5衍生的转座体由含有R6Kγ型复制起点，卡那霉素抗性和两个镶嵌序列结尾的基因，该基因作为转位结合位点的DNA的线性段。的转座子，提供作为DNA /转座蛋白复合物，通过电穿孔导入到原养型菌株， 肠杆菌属。 YSU，并随机整合到自己这台主机的基因组。转化体复制铺板到的Luria-BERTANI琼脂含有卡那霉素，（LB根）平板上并在含卡那霉素（M-9根）M-9培养基琼脂平板上。生长在LB-kan平板上，但尚未上的M-9-kan平板上的转化体被认为是营养缺陷型。纯化的基因组从营养缺陷型的DNA进行部分消化，连接并转化到一个皮尔+大肠埃希氏菌 （ 大肠杆菌 ）菌株。该R6Kγ复制起点允许质粒在PIR + E.复制大肠杆菌菌株，和卡那霉素抗性标记允许质粒的选择。每个转化具有包含由中断染色体区域侧翼的转座子的新质粒。桑格测序和基本局部比对搜索工具（BLAST）建议被中断的基因的推定的身份。有三个优势，使用这种转座突变的策略。首先，它不依赖于转座酶基因的由宿主中的表达。其次，转座子被导入到目标主机通过电穿孔，而不是通过接合或转导，因此是更有效的。三，R6Kγ复制起点可以很容易地识别突变克烯是将一部分回收的重组质粒。该技术可用于研究参与其他特征肠杆菌属的基因。 YSU或更多种类的细菌菌株。
Introduction
原养细菌生长的培养基含有葡萄糖（M-9培养基）的M-9基本盐，通过中心碳代谢途径的葡萄糖转化为产生前体，如氨基酸，核酸和维生素，可以使用合成1。 M-9培养基中含有氯化铵作为氮源，钠和磷酸钾作为缓冲液和磷源，硫酸镁作为硫源和葡萄糖作为碳源和能源。卢里亚BERTANI（LB）培养基中含有丰富的蛋白胨，从和多种维生素和生长因子从酵母中提取的氨基酸。它支持营养缺陷型是不能合成的氨基酸，维生素和其它生长因子，生长所需的M-9培养基中的生长。因此，prototrophs将生长在LB和M-9培养基，而营养缺陷型将在LB培养基中，但不能生长在M-9培养基。通过将突变引入细菌的原养型群体和识别突变基因导致的营养缺陷型表型，它是口服ssible以获得细菌菌株更好地理解代谢的。
转座子诱变也可用于识别许多需要在M-9培养基生长于葡萄糖的基因。转座子随机插入 自己到宿主基因组中2。通过发现在LB琼脂平板和副本电镀它们座子转化到M-9培养基琼脂平板上，有可能筛选营养缺陷型。中断的基因是通过基因救援标识。本研究中使用了市售的Tn的5衍生的转座子它随与转座酶蛋白混合的直链转座子的DNA片段的溶液中。该DNA片段缺少一个转座酶基因，但含有卡那霉素抗性的基因，一个R6Kγ型复制起点和两个镶嵌图案这对于转座在段3,4的各端结合的DNA序列。由于转座蛋白直接加入到该DNA，单独的DNA片段被定义为转座子，并且该DNA /转座蛋白复合物被定义为转座。所述转座子是通过电穿孔5转化为卡那霉素敏感的宿主（ 图1A）。在含卡那霉素（LB根）的LB琼脂平板上生长的菌落具有转座子插入（ 图1B），并复制铺板转化体对不生长在含有卡那霉素（M-9根）是营养缺陷型的M-9培养基琼脂平板（Figire 1C）。从突变体基因组DNA的纯化和部分消化的4-碱基切割型限制性内切核酸酶，BFU CI（ 图1D）。连接后的DNA转化到大肠杆菌 （ 大肠杆菌 ）的菌株，其中包含皮尔基因（ 图1E）。这个基因可以含有转座子和侧翼宿主染色体区域在大肠杆菌中复制的新的质粒大肠杆菌 6。卡那霉素抗性基因作为如候选资格的标记为新的质粒。最后，测序用引物互补于转座子和所得序列的基本局部比对搜索工具（BLAST）分析7,8的每一端用于确定的中断基因的身份。
这种转座突变策略提供了三大优势3。首先，由于转座蛋白直接结合到转座子，插入不依赖于宿主内的转座酶基因的表达。一旦转座子整合本身到宿主基因组中，转座酶被降解，从而防止转座子的额外运动。然而，额外的运动不能，如果主机具有一个内Tn的5易位元件防止。第二，引入转座子通过电穿孔的，能够用它在各种各样的宿主。它也消除了由细菌缀合或者通过vi来引入转座子RAL感染。这两个过程都需要宿主易感性。第三，夹杂物的卡那霉素抗性基因和R6Kγ型复制起点的转座体的可以更容易地识别被中断的基因。转座子中断区可以存储并测序质粒，省去了使用逆聚合酶链反应（PCR）技术进行基因鉴定。
在这段视频中介绍的协议描述了肠杆菌属的转座子突变的每一步。 YSU 9使用转座子从它引入到细菌细胞的推定的基因它被中断的识别。除了 先前公布的协议3,4,10，详细的使用方法复制平板筛选营养缺陷型呈现。此诱变技术可以用于调查其他的表型，如抗生素和金属电阻，在不同类型的细菌，对的identifying需要确定培养条件下合成生物学研究下生长的基因的最小数量，或者教学的遗传学和微生物生理学课程实验室的组成部分。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.电穿孔感受态细胞的5,11
- 稀肠杆菌属的O / N LB培养。 YSU 1/20到50ml新鲜LB培养基中，并与以120rpm振荡及30℃至0.4和0.6之间的OD（600 nm）的生长。或者，种植其他细菌菌株在其最佳生长温度。
- 寒意在冰上将细胞5分钟，并离心在4℃和7000×g离心5分钟。
- 弃上清，重悬细胞于50ml无菌冰冷的水和离心机在4℃和7000×g离心5分钟。重复此步骤。
- 弃去上清并将细胞重新悬浮在冰冷的水等于将细胞沉淀体积的体积。对于长期储存，在-80℃下，并解冻洗涤细胞，用10ml冰冷的10％（体积/体积）甘油，重悬在冰冷的10％（体积/体积）甘油，保存一个等于粒料体积上电前的冰。
- 加入0.5微升的转座体的40微升细胞。市售的转座体溶液以0.33微克/微升的DNA浓度提供。尽管0.33微克建议，0.165微克的DNA是足够的。
- 在冰冷，0.2毫米，电穿孔杯中放置细胞/转座体的混合物，然后点击该混合物以反应杯的底部。惊世骇俗的细胞在25μF，200Ω和2.5千伏。以确保细胞保持冷冻，在使用前保存在-20℃下冷冻的电试管。
- 随即，加入960微升过滤灭菌代谢物阻遏（SOC）中的超最佳肉汤。通过上下吹打混匀，将细胞转移到一个无菌的1.5mL微管中。
注：该细胞开始震荡后死亡，但在SOC中的盐可以让他们恢复。节约，这是没有必要添加转座子或震荡阴性对照细胞。只需添加960微升无菌的SOC培养基它。 - 孵育的细胞在30℃C 2 F或45-60分钟，以120rpm振荡。这提供了时间的转座到重组与宿主基因组，并为细胞表达卡那霉素抗性。
- 传播100微升细胞在LB根琼脂平板上，孵育板O / N在30℃。保存剩余的转化混合物在冰箱中在4℃下。在稍后的日期长达2周的初始电穿孔后，如果需要扩展的附加量。
2.网格化转化
- 带的网格为空100×15mm的皮氏培养皿的盖子。从“A短期课程中的细菌遗传学”12复制一个网格。
- 划在LB根琼脂板的底部的线。用一小片胶带将其固定到网格盖子，以便网格是通过琼脂可见。确保在板的底部的线，与所述网格的顶部，中心对齐。锚定板带滑动保持它，允许甚至是网格。副本电镀后的线路有利于菌落鉴定。
- 挑取单个转化体用灭菌牙签并发现它在网格中的一个正方形的中心。刚刚接触的殖民地和地点。不掏牙签插入琼脂。为了避免污染板，只在一端处理牙签。
- 现货在相邻的广场另一转化为步骤2.3。当板是满的，它孵化O / N在30℃。这是主盘。
3.副本电镀以确定营养缺陷型表型的12
- 因为这是每个网格板，使一叠三间新鲜琼脂平板上编号1至三种：一为LB-根，两个用于M-9根和三为LB-根。使用前擦干板倒挂，O / N，在37℃。
- 绘制在各板的顶部的线，如步骤2.2。
- 擦拭副本电镀工具用70％乙醇，将一个无菌的平绒正方形上的副本电镀的顶部到OL和夹紧平绒广场下来。双手甚至洗完后充满了微生物。防止引进由它的边缘处理平绒广场污染微生物。
- 排列在主盘的线以描绘在夹具的线，然后将板在平绒正方形的顶部。轻轻推压，从板块转移细菌平绒广场。小心不要涂抹细菌。取下平绒广场的主盘。
- 对齐画在板上的头号线与夹子的线，并将其放置在平绒广场之上。施加轻微的压力以从平绒方传送菌到板上。卸下车牌号码之一。
- 丢弃平绒平方成水的烧杯中，并放置在复制品上电镀工具清洁，无菌的平绒方如在步骤3.3。此步骤防止过度接种导致突破生长和假阳性结果。
- 对齐在车牌号码之一，在夹具上的一行行，并将其放置在新的平绒广场之上。轻轻推压，从板的头号转让细菌平绒广场。卸下车牌号码之一。
- 对齐画在板上二号线与夹子的线，并将其放置在平绒广场之上。轻轻推压，从平绒广场转移到细菌车牌号码2。卸下车牌号码2。
- 对于车牌号码3重复步骤3.8。第三板是用于从所述主板完全转移到另两个板的控制。放弃平绒广场到水的烧杯中。重用平绒广场，高压灭菌含有污染平绒广场烧杯，把它们洗干净，晾干，包装在铝箔和再高压灭菌。
- 孵育所述板在30℃CO / N。生长在两个LB根琼脂平板上，但无法生长上的M-9-kan平板上的菌落被认为是营养缺陷型（
- 从板块的头号连胜了营养缺陷型到新鲜的LB根琼脂平板上，孵育板在30°CO / N。
- 连胜走出隔离从平板划线步骤3.11 3个菌落到新鲜的LB-Kan平板。孵育板在30℃CO / N。这确保了该突变体是良好隔离。分板块分为三连胜，并从每个群体中一个部分。
- 从步骤3.12导出到新鲜LB根板的划线出菌落斑菌落形成格栅与步骤2.1-2.4。每个突变体被一式三份重新测试。
- 再次复制盘与步骤3.1-3.10以确认营养缺陷型表型。
4.基因救援
- 从步骤3.13中的液体LB根培养基中在30℃下生长的分离的突变体菌落的3ml的O / N培养。来自1毫升培养物中使用市售的基因组DNA纯化试剂盒纯化基因组DNA。
- 成立了0.025 U A的混合物BFU CI限制性内切酶和14微升的1微克/微升基因组DNA在冰上20μl的反应。因为BFU CI切转座子在12不同的地点，它可以是更有效地使用限制性内切酶，BFA I或海第三，该切转座子在两个和三个不同的位点分别。
- 孵育在37℃下反应25分钟，然后在80℃下进行20分钟，使酶失活。在0.8％琼脂糖凝胶上（ 图3）分析3微升的部分消化的DNA。一个成功的部分消化的结果在涂片来自上述10 kb的倒在凝胶的底部。
- 结扎15微升用800单位的T4 DNA连接酶在500微升反应部分消化基因组DNA。孵育反应O / N在4℃。大反应体积最大化单个片段的连接反应，以自己和最小化两个或多个DNA片段之间的相互作用。
- Precipita德通过加入50μl的3M乙酸钠，pH 5.5，和1ml 95％的乙醇和孵育它在-20℃下20分钟后，连接的DNA。
- 微量的DNA在4℃和13500×g离心10分钟，用70％乙醇洗涤沉淀，干燥它在离心真空浓缩，重悬它于10μl不含核酸酶的水。或者，可将DNA在空气中干燥，在室温15分钟。
- 使用4微升悬浮的DNA转化大肠杆菌大肠杆菌菌株ECD100D PIR或ECD100D pir116通过电在第1 R6Kγ复制起点要求菌株与PIR基因复制6。 被动红外应变导致低拷贝质粒，并pir116菌株含有一个PIR突变基因导致的高拷贝质粒。每个转化体包含一个新的质粒，转座子，被中断的染色体（ 图1E）的一个区域。
- Inocul吃5ml的LB根培养基与单个菌落，它成长O / N振荡以120rpm和37℃，使用商业试剂盒从整个O / N培养纯化的质粒DNA。
- 消化14微升质粒用限制性内切酶XhoI位一。确保反应的最终体积为20微升。这种酶能够识别在转座子在所述卡那霉素抗性基因的5'端的中间部位。分析10微升的未消化的和消化的质粒在0.8％琼脂糖凝胶上（ 图3）。该质粒由2千转加侧翼宿主DNA中。
5. DNA测序
- 测序使用市售的测序试剂盒，引物同源的转座子的每一端，并且一毛细管测序分析系统的质粒。或者，该质粒可以被运到外部机构进行测序。
- 使用分子量标准（1kb梯）的凝胶来估计该质粒的大小。然后，估计的质粒的所需50 fmol的纳克（毫微克）的数量。
- 测定质粒DNA，用分光光度计在260纳米（A 260）和280nm（A 280）的波长的浓度。确保通过试管的光程长度为1cm。通过用50纳克/微升乘以260nm处的吸光度确定浓度。高品质的质粒DNA将有一个A 260 / A 280比值在1.8和2.0之间。
- 要求每个测序反应的DNA的量是NG要求50 fmol的由质粒的浓度除以数。混合所需的质粒的量与水以使总体积达到10微升。
- 在96℃下进行1分钟加热该质粒DNA /水混合物中，然后将其冷却至室温。
- 加入8μl反应混合液的测序试剂盒和2微升1.6微米的测序引物之一。
- FOL较低的协议的测序试剂盒的热循环程序和反应清除。
- 使用毛细管DNA分析系统中的每个样品进行分析。
- 使用市售的软件程序包，以查看该DNA序列。搜索的顺序，“5'-GAGACAG-3'”，这是在过去的7碱基的转座子（ 图4）。这7 bp的片段的5'末端之前的序列所属的转座子。这7 bp的片段的3'末端之后的序列属于被中断的基因。
- 确定使用基本局部比对搜索工具（BLAST）7,8-中断的基因的可能功能。使用以下link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch .粘贴中断的顺序ED基因到查询框中，选择数据库下的“其他”，并在页面底部点击“BLAST”。当结果出现后，向下滚动页面，查看比对结果（ 图5）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
转型肠杆菌属的。 YSU通过电穿孔用的转座子启动的随机基因组插入到宿主基因组（ 图1A，B）。一个成功的电产生几千它转化生长在LB-kan平板。为了获得300-400，良好的间距每个平板菌落，对每个LB-根琼脂平板上转化混合物传播量进行了优化。每个转化体中包含至少一种转座子插入，但它是不清晰的，如果为增长的重要基因上的M-9培养基，通过影印打断未经筛选。转化体转移至新鲜LB-kan平板上于88网格和复制铺板于M-9培养基。注意，为了确保该转座子保持在转化体中，所述协议部分建议添加卡那霉素的M-9培养基平板上。的M-9培养基中不添加有卡那霉素在这种情况下，但是它仍然能够获得营养缺陷型没有它。在
有些群体可能已被污染的副本电镀过程中相邻的殖民地。以分离的突变体作为一种纯培养物，它是从LB根塔板数1步骤3.1划线到新鲜的LB根琼脂平板上并生长O / N在30℃。三个殖民地长大了挑染出到第二个新鲜的LB-Kan平板上生长和O / N在30℃。然后，一个菌落，从上述三个殖民地的出现被点到第三个新鲜LB-Kan平板。复制品电镀背面上的M-9最小的中介嗯一式三份板验证，观察图2中的营养缺陷型表型。筛选在2013微生物生理学过程中1760转座子转化体中，有23人营养缺陷型。
然后确定采用基因救援从营养缺陷型中断的基因。从第二条痕板上面（步骤3.13），营养缺陷型菌落生长的O / N在LB根培养基中，基因组DNA，从培养物中使用的基因组DNA纯化试剂盒纯化。琼脂糖凝胶电泳显示纯化的DNA用大于10kb的大小（ 图3，泳道2）。打破的基因组DNA分成更小的片段，含有转座子和侧翼中断主机区域（ 图1D），它被部分地在37℃下消化，用0.025单位的BFU的CI 25分钟。这种限制性内切酶切割，在5'-GATC-3'位点发生大约每200到500个碱基对。即使有是12 5'-GATC-3'转座子内的位点，含有大量的完整的转座子和侧翼宿主基因组的片段仍然会存在于所述部分消化的DNA。 图3示出了3个车道部分消化的基因组DNA与DNA的涂抹开始超过10 kb的，一直到该凝胶的底部，以低于0.5 kb的。如果DNA涂抹开始下面的2kb，转座子的大小，则该DNA已被消化太多。这将是必要的，以减少酶的添加量，在37℃的温育时间，或两者兼而有之。如果没有污迹和与被消化的DNA的泳道是大小相同的未消化DNA中的DNA，那么没有发生消化。这将是必要的，以增加酶的添加量，在37℃下温育的时间或两者。代替使用BFU CI的，有可能使用限制性内切酶BFA I或海 III，其切转座子在两个和三个不同的位点分别。利用这些酶中的一个的可能增加的大肠杆菌基因救援过程中大肠杆菌PIR +转化率。
将部分消化的DNA连接在500μl的反应。这个增加的体积最小化的其他DNA片段之间的相互作用，并最大化该片段与自身各片段，以形成一个环状分子的概率。连接后的DNA沉淀，并通过电穿孔转化大肠杆菌大肠杆菌菌株ECD100D pir116。将转化混合物涂布在LB-kan平板上。菌落生长出包含一个新的质粒，包括转座子，被中断的主基因（ 图1E）的区域的。的菌落形成单位的数量范围从0到2000每ml转化混合物中。如果侧翼的染色体区域编码，这是有毒的大肠杆菌的蛋白质大肠杆菌宿主中，转换效率是低的，或只有一小部分染色体的一些用新的质粒相关联。质粒DNA，从接种单个转化体，并用限制性内切核酸酶，Xho I 位 ，这在邻近的卡那霉素抗性基因的5'末端的转座子的中心认可的单个位点的培养物中纯化。在图3中4泳道含有未消化的质粒和泳道5载消化的质粒。因为纯化的质粒DNA趋于超螺旋，其迁移以更快的速度比线性的同一条链消化的DNA。该质粒的正确大小为3 KB。它包含2 KB的转座子，再加上中断的宿主基因中约1 KB。如果侧翼宿主DNA中含有一个或多个Xho I 位的识别位点，两个或更多的质粒条带将在车道用 Xho I消化的DNA中观察到。
图4显示了一个从一个营养缺陷型中分离的质粒测序结果。取出后笑以粗体室温座子序列，所述宿主DNA序列提交给基本局部比对搜索工具（BLAST）分析7,8。一项所述的BLAST结果表明，被中断的序列是类似的阴沟肠杆菌亚种。肠杆菌菌株NCTC 9394（EMB | FP929040.1 |）基因为分支酸变位酶，它参与了L-酪氨酸和L-苯丙氨酸（ 图5）13的生物合成。有时该部分消化基因组DNA的连接反应中，所述线性座子ligates到一个或多个其他BFU CI片段。这可以使BLAST导致混乱，因为一个基因的身份突然改变。例如，第一个41个碱基对的另一种营养缺陷相匹配的量是参与脯氨酸生物合成的1谷氨酸-5-半醛脱氢酶的基因。然后，接下来的219个碱基对匹配的核糖核苷二磷酸还原酶亚基的基因，之后是62个碱基对的片段为脂质A-disacc haride激酶。最后的295个碱基对的片段相匹配的谷氨酸-5-半醛脱氢酶一次。的5'-GATC-3'位点的BFU CI的存在表明，两个较小的DNA片段连接入质粒救出。因此，稀释的部分消化的DNA进行连接反应并不能完全消除引起的更小的片段的连接反应的背景。从这些结果可以得出结论认为，转座子插入自身置于基因谷氨酸-5-半醛脱氢酶，因为该序列对于该基因是紧邻的转座子。其它营养缺陷型中所含的基因参与甲硫氨酸合成胱硫醚裂解酶的β中断;对参与组氨酸的生物合成组氨醇脱氢酶;为参与丝氨酸，甘氨酸和半胱氨酸的生物合成磷酸丝氨酸磷酸酶;并为参与亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸的生物合成1酮醇酸还原异构酶。
NT“FO：保together.within页=”总是“>
图1.转座子突变。 （A）含有所需生长于培养基含有葡萄糖的M-9基本盐的基因的细菌细胞。盒装的M-9表示的营养缺陷型基因。（B）中的转座子导入到细菌菌株通过电穿孔和转座酶蛋白结合到各镶嵌末端（箭头），随机插入 转座子插入宿主染色体3,4。只有转座子含有转化体将增长在LB根培养基平板上。（℃）的转化体平板复制到含有葡萄糖的M-9培养基在LB根培养基中。失败的转化体上的M-9培养基中生长（打叉的）含有葡萄糖的营养缺陷型。（D）的基因组DNA是从营养缺陷型纯化和部分消化的4个碱基CUTT呃BFU Cl，其中确认了DNA的位点，5'-GATC-3'。（E） -将部分消化的DNA进行处理，用T4 DNA连接酶并通过电穿孔转化大肠杆菌大肠杆菌菌株ECD100D 皮尔以形成一个新的质粒，包含转座子和其生长所需的M-9培养基被中断的染色体基因。在皮尔基因允许含有R6Kγ型复制起点的转座子作为复制起点的新的质粒6的环状DNA片段。卡那霉素抗性基因作为选择标记的新的质粒。该质粒纯化，中断基因的〜500bp的序列，用引物（箭头）是同源的转座子的两端是确定的。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2.影印。被转移到的LB根琼脂板，其转化体（A）的网格。（B）中被转移到的M-9培养基平板的同一转化体的网格。营养缺陷型生长在LB-kan平板上，但是不能在M-9培养基平板上。这些都是由黑色方块标识。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图3. 0.8％琼脂糖凝胶泳道1：1kb梯。泳道2：未消化的基因组DNA。泳道3：BFU C I部分消化基因组DNA。泳道4：未消化的血浆救出ID。 5巷：XhoⅠ位消化的质粒救出。
图质粒4.部分DNA序列，以粗体显示的顺序是转座子的一部分，并没有提交BLAST分析。该序列的其余部分是从主机获救基因的片段。
图5. BLAST分析7,8。从第一基站（Query）的开始，中断的基因似乎是一个阴沟肠杆菌分支酸变位酶，其涉及苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成进行编码。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
用转座的转座子诱变是在肠杆菌属产生营养缺陷型的有效工具。 YSU和其他类型的革兰氏阴性和革兰氏阳性菌3,4。该过程是通过将Tn的5衍生的转座到宿主通过电启动。以确定菌落的插入，未转化的靶菌株必须是敏感的，以卡那霉素以选择用于通过转座子携带的抗性标记。有些主机产生限制性核酸内切酶降解转座子的DNA，才可以与宿主基因组重组。另外一个限制性内切酶抑制剂，电穿孔混合物的可能最小化降解和提高转化收率3。而制备电感受态细菌，重要的是要除去尽可能多的盐作为能够防止电弧或火花，杀死引起盐的存在下的细菌。甚至在没有电弧，细胞开始他们震惊后迅速死亡。加入含有的SOC培养基的盐立即恢复渗透平衡，最小化细胞死亡和增加转化效率5。卡那霉素抗性转化体，然后点样到一个新鲜LB根板和副本镀上至M-9基本培养基琼脂。为了防止过度接种可引起该错过可能的营养缺陷型假阳性结果，平绒方块被在步骤3.6之前将板的其余部分进行接种切换。然后，副本电镀过程中，仅仅足够的压力被施加到转移菌落，而不会导致相邻的菌落之间涂抹或污染。
在营养缺陷型突变基因是通过基因抢救鉴定。使用与频繁的碱基切割BFUÇ一，部分消化了部分消化利用博鳌亚洲论坛我和海 III，它切断了TR从每个营养缺陷型基因组DNA剪切ansposon较少，可提高转座子转化效率。另外，也可以使用一个完整的消化与其他限制性内切酶，6-基和8-碱基切割机，其缺乏转座子内的位点。被消化的DNA，然后连接并转化到大肠杆菌大肠杆菌菌株ECD100D PIR或ECD100D pir116 6。虽然E.大肠杆菌pir116菌株在步骤4.8转化通过电穿孔，也可以使用化学感受态细胞。在这种情况下，整个转化应当被传播，以获得一个大的选择救出质粒的构建。在皮尔基因允许对环化的转座子复制作为低拷贝数质粒，并且pir116突变基因允许其复制的高拷贝质粒。使用pir116应变低转化率的原因可能是有毒基因产物从原始宿主中的表达。毒性可以通过使用低拷贝被减少
基因组测序10和PCR测序14顷替代方法来救援的基因。基因组测序法直接从纯化的基因组DNA序列侧翼的染色体区域。当靶生物的基因组已经被测序，这种策略是有用的。一旦突变的区域已被确定的基因组测序和BLAST时，整个区域可通过PCR扩增并克隆用于进一步分析。 PCR方法使用了两个PCR反应和四个不同的引物。第一反应对转座子同源引物（引物1）与含有短DNA，接头序列（引物2）简并引物。第二次PCR反应是嵌套式PCR反应，配对另一个座子同源引物（引物3）与同源接头序列的引物（引物4）。引发位点引物3是位于涂刷网站底漆1。接着的3'侧，从第二个PCR反应的amplicand被清除并测序。这种自动测序方法直接从突变的细胞的DNA扩增，省去了两个基因组DNA的纯化和质粒拯救。
代替识别参与营养缺陷型的基因，转座子诱变也可用于研究其他容易测定的表型。 肠杆菌属。 YSU是多金属抗性细菌菌株，其还具有耐100微克/ ml氨苄青霉素（未发表数据）。其最小抑菌浓度（MIC）为升汞是70微米， 氯化锌是800微米， 硝酸银是80μM和NaAsO 2是14毫9。引入转座到这个应变和网格转化到LB-kan平板后，网格化的菌落可以复制镀上含有中金属在低于此bacte的MIC浓度里亚尔的压力。抢救和从突变体测序中断的基因具有较小的MIC可能表明，赋予对这些金属中的一种的基因。
除了 产生的突变体，所述转座子可以用作体外的载体或体内识别功能的基因，如抗生素或金属电阻的增益。用于体外策略，从肠杆菌属的基因组DNA。 YSU是用限制性内切核酸酶识别转座子的外位点。的DNA连接，并与在含Mg 2+的缓冲液的转座体混合。转座子和随机的基因组片段，E之间重组后大肠杆菌菌株ECD100D 皮尔转化用DNA并涂布在含有氨苄青霉素或金属盐的板。生长的菌落将拥有一个新的载体，其中包含位于主机旁边的抗性基因的转座子。用于体内圣rategy， 肠杆菌属。 YSU被转化的转座体。然后，整个转化反应是在LB根液体介质，以选择一个大的人口与随机转座子插入。基因组DNA用限制性内切核酸酶识别的座子外位点，连接并转化到大肠杆菌大肠杆菌菌株ECD100D 皮尔。正如在体外方法中，转化子涂布在氨苄青霉素或金属板。再次，将所得的质粒将包括插入的旁边有一个抗性基因的转座子。这两种策略会成功只有当目标抗性基因能够表达和活跃于E.大肠杆菌菌株。
转座子诱变可以被用来确定基因的最小数目的细菌菌株需要用于生长15,16。需要进行这种策略的两个transposomes含有loxP位点和不同的抗生素抗性标记我呐细菌菌株与已知的基因组序列。后两个座子整合，表达Cre重组酶催化的两个loxP序列间的重组反应，从而消除了转座子插入的染色体区域。知识的基因组序列，能够识别哪些基因被消除。中生长的能力表明，所消除的基因不是必需的生长。这种技术是劳动密集的，并且对于使用这种策略生长的最小基因组尚未完成。但是，使用PCR测序铜绿假单胞菌的自动转座子突变的研究估计，是需要这种细菌在营养丰富的培养基14增长300-400基因。这项研究没有使用的loxP / Cre重组酶系统。
微生物以最小的基因组是合成生物学17很有用。的细菌菌株以最小的基因组是especially表示消除了生产不希望的副产物是有用的。例如， 丙酮丁醇梭菌 （ 丙酮丁醇梭菌 ）是用于生产生物燃料，丁醇18。在它的生长，该菌株生产丁醇在其指数生长期的末尾它进入稳定期之前。在这一点上，就变成为丁醇和其他发酵产物的敏感，并形成休眠孢子其中停止合成产物。因为transposomes已被用于研究产气荚膜梭菌 3，有可能使用类似的转座子/ loxP序列 / Cre重组酶系统构建丙酮丁醇梭菌缺乏的基因不期望的发酵产物和产孢属的菌株，但包含的基因更大丁醇的耐受性。该菌株也增加了产品的产量以最小的污染物。
总之，这个视频期刊文章提供了一个完整的STEP被用于创建营养缺陷型由转座子诱变的程序步骤说明。它涵盖引入转座子通过电穿孔，通过复制平板筛选突变，通过DNA测序克隆技术和识别中断的基因的拯救突变基因。这种技术可用于鉴定未知基因的功能，或对可能的构造的细菌菌株，可在工业过程中使用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
笔者有没有透露。
Acknowledgments
笔者要感谢我所有的本科独立研究学生的我谁在2010-2014年春季学期测试了我的转座子突变的想法微生物生理学研究生和一切。这项工作是由美国生物科学系的扬斯敦州立大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS - Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
- Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
