Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü, Published: November 30, 2014 doi: 10.3791/51961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

Protocol

İki A. 1. Larva Yetiştirme albopictus Grupları Erişkinliğe

  1. İki optimum diapause ifadesi 16 21 ° C'de programlanabilir aydınlatma ile fotoperiyot dolapları ve yaklaşık% 80 bağıl nem ayarlayın.
    1. Bir 16L Program bir kabine: 8K ışık: karanlık döngüsü (non-diapause LD fotoperiod uyaran). Bir 8L ikinci kabine ayarlayın: 16D ışığı: karanlık döngüsü (uyarıcı diapause) 13.
    2. Her iki dolapları aynı zamanda Programın 'ışıklar' fotoperiyodların arasındaki sirkadiyen zaman senkronize etmek.
  2. Deney gerçekleştirmek için gerekli yumurta miktarını hesaplayın. Kafes başına 300-500 yumurta hedefleyin. En azından üç diapause kafesleri çoğaltmak ve olmayan üç-diapause kafesler RNA üretimi için gerekli olan çoğaltmak. Bu deney başına 1,800-3,000 yumurta Takriben için toplamları.
    1. Yaklaşık içine deiyonize H 2 O 500 ml yumurta kağıtları daldırarak tarafından Hatch yumurta
    2. Ekle <em> ca. Zemin köpek maması ve tuzlu su karidesi oluşan 1 ml gıda bulamaç olarak daha önce 24 nitelendirdi. Kafes ile konteyner örtün ve bir lastik bant ile yerine örgü tutmak.
    3. Yaklaşık 24 saat LD fotoperiyodun kabine yerleştirin.
  3. Aktarım yumurtadan larva için 10 x 10 x 2 cm'lik Petri yaklaşık 90 ml ile doldurulmuş kaplar deiyonize H2O
    1. Tabak başına yaklaşık 30 larva koruyun. Örneğin, her Pazartesi, Çarşamba, Cuma ve (MWF) 24 yemeklere her 48-72 saat temizlemek için larva aktarın.
    2. Daha önce olduğu gibi, iyonu giderilmiş su içinde ezilmesi köpek maması ve tuzlu su karidesi her MWF oluşan besleme yaklaşık 1 mi gıda bulamaç 24 tanımladı.
  4. Her kafes biyolojik çoğaltmak içermektedir her fotoperiyod tedavisi için 3-4 yetişkin kafesleri ayarlayın.
    1. 9.5 L kovalar ters taraftan, bir 10-by-14 cm delik kesip, ve 15 cm çapında bir delik. Comesh ile ilk Sür. Ortopedik çorap yaklaşık bir ayak uzunluğu kesin, ve diğer deliğin içine etrafında bir ucunu tutkal.
    2. Çorap kapalı ve düğüm kapatma ayak ucunu kesin - kafesin iç erişim gerektiğinde yalnızca açık. Kafes kapak için, sadece jant bırakarak, tüm iç kesip, ve örgü 24 ile iç plastik değiştirin.
    3. Kafesin tarafında kalıcı bir kalem ile deney ile ilgili numarayı, kafes başlangıç ​​tarihini ve diğer bilgileri çoğaltmak, fotoperiod unutmayın.
  5. Islak filtre kağıdı ile yetişkin kafesleri alt Hat. Filtre kağıdı 24 ovipozisyon teşvik, hangi kafeste yerel nem oranı yükselir, ancak suya durmaktan kaçınmak için yeterli deiyonize H 2 O ile filtre kağıdı nemlendirin. Gerektiğinde kurutulması için günlük olarak tekrar nemli filtre kağıdı edin.
  6. En az 100 kadın dahil, bir RNA kütüphanesi için yeterli yumurta üretmek için / 9.5 L cage, kafes başına en fazla 500 sivrisinek ile.
  7. En fazla 50 pupa başına 25 mi H2O yoğunluğunda, temiz H2O küçük bir kap içinde pupa MWF yeri ve toplamak Bir yetişkin kafesine pupa fincan aktarın. İlgili fotoperiyodun kabine yerleştirin kafesleri - A. albopictus pupa 15 fotosensitiftir.
  8. Ölü pupa oluşumu kitle mortaliteye neden olabilir, çünkü, bardak H 2 O temiz ve berrak olduğunu günlük olun ve ölü pupa çıkarın. Tüm pupa ortaya Ey bardak sonra H 2 çıkarın.
  9. Ortaya yetişkinler için şeker sağlamak için kafesin üst örgü organik üzüm yerleştirin. Üzüm Monitör ve küf birikmesini önlemek için her 3-5 gün onları değiştirmek.

Yetişkin 2. Bakım Çiftleşme ve Yumurta Üretim izin ver

  1. (SECTI nemli bir filtre kağıdı ile kafes alt astar yüksek nemde (yakl.% 80) en kafesleri bakımı, ve yukarıda tarif edildiği gibi, küflü üzüm erişim sağlamakons 1.5 ve 1.9).

3. Kan-besleme

  1. Yumurtlama yaklaşık 100% diapause yumurta 14 başlamadan önce kadın en az sekiz net kısa gün maruz emin olmak için eclosion sonra 2-6 gün arasında kan besleme kadınlarda hazırlanın.
  2. Hemotek Membran Besleme sistemi hazırlayın. Güç kaynağı besleyen birimleri takın. Ayar vidası kullanarak 37 ° C her biriminin sıcaklığını ayarlayın. Kalibrasyon sırasında besleme ünitesinin sıcaklığını ölçmek için bir elektronik termometre ve probu kullanın.
  3. Yemek haznesini hazırlayın. Yemek rezervuar diyafram üzerinde kollajen besleme membranın bir kare gerin ve bir O-ring ile sabitleyin. Dikkatle kırışıklıkları kaldırmak için köşeleri çekin; makas ile aşırı membran düzeltin.
    NOT: Kollajen membran tüm sivrisinek türleri için de işe yaramayabilir ve bir çalışma varsa optimum membran bulmak için çeşitli denemek için gerekli olabilirA dışında başka türler albopictus. Parafilm pipiens'in ile iyi çalışır.
    1. Kan kullanmadan önce en az 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, dondurulmuş çözülme saklanır.
    2. Membran aşağıya bakacak şekilde tutun rezervuar, desteksiz ve dolum portları yukarı bakacak. Bir anti-pıhtılaştırıcı olarak sodyum sitrat olan tavuk tam kan, yaklaşık 3 ml ile doldurulması için bir transfer pipeti veya şırınga kullanın. Plastik fişler ile dolum noktalarını Seal.
  4. Besleyici altındaki ısı transfer plaka üzerinde damızlık üzerine vidalanarak besleyici hazırlanan rezervuar takın. Sivrisinekler kafesin örgü ile besler, böylece besleyici ters çevirin ve kafesin üst, aşağı membran tarafına yerleştirin. Besleme en üst düzeye çıkarmak için yaklaşık 45 dakika boyunca kafes üzerine besleyici tutun.

4. yumurtlama teşvik

  1. Dört beş gün renkli bir karanlık her kafes donatmak, kan yemek sonrası 50 ml cağartılmamış tohum çimlenme kağıdı (yumurta kağıt) veya dokulu olmayan ağartılmış kağıt havlu ile kaplı ve deiyonize su ile 9 yarıya doldurun kadar. 250'den fazla sivrisinek bir kafes içinde iseniz, iki bardak kullanın.
    NOT: Küçük kafeslerde veya tek dişi şişeleri için, yumurtlama kaplarda "hay infüzyon" nedeniyle mikrobiyal floranın 25 koku ovipozisyon artabilir.

5. toplayın ve Mağaza Yumurta

  1. Yumurta üretimi genellikle önümüzdeki hafta boyunca azalır, sonra beş gün kan beslenme sonra yaklaşık zirveleri, çünkü kan besleme 4-5 gün içinde yumurta toplama başlar.
  2. Deneyin ihtiyaçları yumurta toplama sıklığını Vary. Genel amaçlar için, bir MWF programa yumurta kağıtları toplamak. Her kafes yumurta kağıtları çıkarın ve taze kağıt ile değiştirin. Yumurta depolama karıştırıcı etkilerini önlemek için SD fotoperiyodun kabinesinde Petri kapları ve mağaza son zamanlarda kaldırıldı kağıtları yerleştirin.
  3. Yumurta kağıtları yeniden izin Yumurta kuruma direncini artırır 26 serozal manikür oluşumuna, izin sonrası yumurtlama 2 gün boyunca ıslak ana.
  4. Yaklaşık 48 saat sonra toplama, açık havada kuru yumurta. Kağıt H 2 O koyu veya yumurta yumurtadan uyaran o kadar ıslak gevşek ve hafifçe nemli, ama öyle ki kağıt kurutun.
    NOT: Bir 6,5 "x 4" Kağıt kuruması yaklaşık 3.5 saat sürebilir. Bu yumurta kuruma 27 neden olacak gibi değil, aşırı kuru yumurta kağıtları dikkatli olun.
  5. LD ve SD hem fotoperiyodların rezerv ek yumurta diapause insidansını değerlendirmek ve (Diapause Ölçme Bölüm 6) photoperiodic etkisini yorumlamak.
  6. Uzun süreli depolama için, 21 ° C'de yumurta kağıtları tutmak ve Petri kutularına yaklaşık% 80 nem. Embriyo gelişimi, 21 ° C'de 4-5 gün sürer, yerel nem korumak için bir su şişesi ile bir Saklama kabı depolama kabı içinde Petri kapları tutun.
ove_title "> 6. Diapause İnsidans Tedbir

  1. Ek saklıdır embriyolar diapause yanıtı ölçmek için 7-20 gün eski (yumurtlama, Bölüm 4 Canlandıracak bakınız) kullanın.
  2. Her yumurta kağıt üzerinde bulunan yumurta sayısını kaydedin.
  3. Tamamen yaklaşık 80 ml ​​deiyonize H 2 O ile 90 ml'lik Petri kabındaki bireysel yumurta kağıtları daldırarak yumurtadan yumurta teşvik Yaklaşık 0.25 mi gıda bulamaç ekleyin.
  4. 24 saat sonra ince çizgiler birinci değişim safhasındaki larva sayısı kalın. Larvaları görselleştirmek ve çanağın bir tarafında bir ışık kaynağı yerleştirmek için siyah bir yüzey Petri tabağına yerleştirin. Larva bireysel larva net bir taksitli için izin ışık kaynağından uzak hareket edecek. Bireysel larva anlatırken önlemek için sayım sırasında bir pipet ile bireysel larva çıkarın.
  5. Yeni bir Petri kabı ve yeniden-kuru yerleştirin yumurta kağıtları. Yeniden yumurtadan yumurta yine ~ 1 hafta ve sonra yukarıdaki yöntemi kullanarak yumurtadan yumurta taksitli.
  6. Kalan u Yeri yumurta kağıtları Yaklaşık 80 ml ​​beyazlatma solüsyonu 28 ml 90 yeni Petri kapları yumurta n-yumurtadan. Yumurta kağıtları tamamen ağartma çözeltisine batırılmış emin olun ve çamaşır suyu kokusunu önlemek için bir davlumbaz gecede altında bırakın.
    NOT: Bu maddeler, 4 ° C'de yaklaşık 1 hafta boyunca muhafaza edilebilir, ancak aksi takdirde taze yapılmalıdır.
  7. Koryon temizlemek ve embriyo, un-yumurtadan yumurta görselleştirme sağlayacak beyazlatma gibi bir ışık mikroskobu kullanılarak yumurta kontrol edin. Yumurta embriyolu ise yumurta sırt tarafında birbirine zıt iki küçük siyah noktalar şeklinde görünen gözlü grimsi beyaz bir renge sahip olur. Un-taranmış, embriyonlu yumurta 13 sayısını taksitli.
  8. Hayır =% diapause: Aşağıdaki formül ile diapause sıklığını belirler. embriyone un-yumurtadan yumurta / (hayır. yumurtadan yumurta + hayır. embriyone un-yumurtadan yumurta) 100 13 x.

Yumurta / pharate Larvalarına 7. RNA Ekstraksiyon

"ontent> NOT: Bir laminer akış kaputu kullanın Trizol.

  1. Bir deve tüyü fırça kullanarak cam taşlama için yumurta kağıtları farklı gelişim zaman noktalarında gelişen embriyolar ya pharate larva içeren Fırça sivrisinek yumurtaları. Tamamen toz haline gelene kadar Trizol yumurta (doku 50-100 mg başına 1 mi) öğütün. Yeterli RNA elde kütüphanede başına en az 400 yumurta kullanın.
    1. Seçenek olarak ise, sıvı azot içinde dondurularak yumurta bileşenini ve Trizol taşlama önce bir ay kadar için mikrosantrifüj tüpleri içinde -80 ° C'de saklandı.
  2. Trizol RNA ekstraksiyonu yapın, üreticinin talimatlarına uygun olarak, izopropanol çökeltme eklenmiştir.
  3. RNA, bağlı bozulmayı önlemek için herhangi bir kalıntı nükleazlar kaldırmak için RNaz dekontaminasyon çözelti ya da diğer maddeler ile birlikte tezgah tedavi edin.
    1. DNase ile ekstre RNA tedavi edin. Üreticinin talimatlarına göre, 37 ° C'de 30 dakika boyunca DNaz ile RNA örnekleri inkübe edin. 1 & # kullanın181; 50 ml'lik bir reaksiyon içinde RNA kadar 10 ug l DNaz. Bir reaksiyonda RNA fazla 10 ug varsa DNase miktarını artırır.
    2. 5 ul askıya DNaz inaktivasyon reaktif ekleyerek DNase inaktive. Kuluçka döneminin (hafif girdaplama) sırasında üç kez karıştırma, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    3. 1.5 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin. Sonraki adımlar için yeni tüplere tedavi RNA örnekleri ihtiva eden üst sıvıyı aktarın.
  4. Fluorometri toplam RNA örneklerinin kalitesini değerlendirmek. Bu görev için uygun alet ile bir özel tesisine örnekleri gönderin. Tesis çip aşılanan floresan boya ile görüntülendi numune RNA türlerinin, boyutlarını belirlemek için çip jel elektroforezi gerçekleştirecektir. Sonuçlar bir electropherogram olarak iade edilecektir.
    1. Varlığı o tarafından kanıtlandığı gibi, varlığında veya bozunma ürünlerinin yokluğunda toplam RNA numunelerinin bütünlüğünü belirlemekElde electropherogram (Şekil 1B) üzerinde 18S ve 5S ribozomal RNA zirveleri arasında f zirveleri.

8. RNA Sıralama

  1. Standart protokolleri takip zenginleştirilmiş eşleştirilmiş-uç mRNA kütüphaneleri ve mRNA sıralama, yapımı için ticari bir sıralama merkezi yeterince yüksek kalitede (Şekil 1A) ve miktarı (kütüphane başına genellikle> 3 mg) ile toplam RNA örnekleri gönderin.
  2. Birden fazla şeritli bir tek deney sıralanması için kullanılan ediliyorsa, sıralama sırasında şerit arasında teknik varyasyon için hesap sıralama için iki şerit halinde bireysel kütüphaneler bölünmüş.

9. lllumina Oku Temizlik

NOT: Şekil 2, bu protokolün biyoinformatik bölümünü özetlemektedir. Bu protokolün biyoinformatik bölümünde kullanılan tüm programlar ve kaynakların tam listesi için, Tablo 1 bakınız. InAyrıca, Ek Dosya 1 Aşağıdaki biyoinformatik protokol adımların her biri için komut satırı örneklerini içerir.

  1. NCBI UniVec Çekirdek veritabanına% 95 kimlik ya da daha yüksek bir eşleşme için ssaha2 29 (Tablo 1) kullanarak (Tablo 1), C. albopictus rRNA dizi (Gen Bankası # L22060.1), ve sıralama adaptörleri (Ek Dosya 1'de verilmiştir Ayrıntılı komut satırı örnekleri). Sağlanan Perl script (Ek Dosya 2) adapte örneğin Perl kullanarak maçlarda veya benzeri bir komut dosyası aracı ile okuma çiftleri çıkarın.
  2. Kalan Temiz SolexaQA paketiyle 30 okur (Tablo 1; Ek Dosya 1): DynamicTrim.pl varsayılan ayarları kullanarak 20'den daha az bir phred puan eşdeğeri olan bölgeleri kırpın.
    1. Kaldır ileri hem LengthSort.pl ile daha kısa 25 bp okur ve ters aynı anda okur. FastQC (Tablo 1 ile fastq temizlenen dosyaların kalitesini değerlendirmek

10. Dijital Normalleştirme

  1. K-mer boyutu 20, 20 bir kapsama kesme, ve x kullanarak (özellikle normalize-by-median.py; (Ek Dosya 1 Tablo 1) khmer aracını kullanarak 31 okur temizlenmiş dijital normalleşme bir tur yapın = 1E10).
  2. Yüksek RAM ile bir makine mevcut (GBS yüzlerce) ise Alternatif, Trinity normalize_by_kmer_coverage.pl komut (Tablo 1) kullanın.

11. De Novo Transkriptom Meclisi

  1. Montaj büyüklüğüne bağlı olarak, RAM kadar 256 Gb ve 24 işlemcilerde olan bir bilgisayar veya bilgisayar kümeye erişimi edinin.
  2. Komşularla içine yerleştirilen dijital normalize okuma monte etmek, Trinity 32 (Ek Dosya 1 Tablo 1) kullanın. Azaltmak için,bellek kullanımı, --min_kmer_cov 2 kullanın.

12. Meclis Değerlendirme

  1. Trinity kontig çıkış Assemblathon2 projesi 33 assemblathon_stats.pl çalıştırın. (; Ek Dosya 1 Tablo 1) Bu script gibi iskelelerinin sayısı, N50, montaj kompozisyon, ve daha fazlası gibi değerlendirilmesi montaj kalitesi ile ilgili temel hesaplamaları gerçekleştirir.

Montajlı transcriptome 13. Ek Açıklama

  1. Bir referans protein kümesi karşı toplanma BLASTX (Tablo 1) gerçekleştirin; sivrisinekler için, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens ve Aedes aegypti uygun referanslar vardır. Özellikle, BLASTX (Ek Dosya 1) takip patlamanın referans protein Fasta dosyasını, biçimlendirmek.

14. Harita RSEM 34 Kullanma Meclise okur (Tablo 1)

  1. Bir 'transkript-to-gen haritasının' dosyası oluşturun hangiİlk sütun referans gen kimlikleri ve ikinci sütun kontigi kimlikleri içeriyor. Bir elektronik tablo editörü olarak, BLASTX çıkışından birinci ve ikinci sütun takas ve bir .txt dosyasına bu sütunları yazın. Unix formatına sonuçlanan .txt dosyasında satır sonlarını dönüştürmek için lineBreak programını kullanın.
  2. RSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan rsem-hazırlamak-referans komut kullanarak transcriptome Fasta dosyasından bir başvuru dataset oluşturun.
  3. RSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan rsem-hesaplamak ifade komutunu kullanarak her kütüphane için ayrı ayrı ifade değerlerini hesaplayın. Okur gibi, okuma-temizleme adım (adım 9.2) kaynaklanan fastq eşleştirilmiş dosyaları kullanın.
    1. Biyolojik tekrarında RNA dizileme için iki şerit bölünmüş ise, tek bir dosya oluşturmak için ifade hesabında hem fastq dosyaları içerir.
  4. Kolayca diğer p tarafından işlenen bir matris her kütüphaneden ifade sonuçlarını dönüştürmeRSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan sağlanan komut rsem-oluşturmak-veri-matris kullanarak rograms.

15. Diferansiyel İfade Analizi

  1. R ve Edger (Tablo 1) takın.
  2. Adım 14.3 (Ek Dosya 1) den RSEM sonuçlarını yüklemek için read.delim kullanın. Gerekirse, en yakın tam sayıya sayıları yuvarlak.
    NOT: Kenar düzeninin kılavuzu önemini algılamak için yeterince yüksek bir ifade ile genlere veri kümesi sınırlayan önerir.
  3. Edger için verileri biçimlendirmek için, yüklenen veri dosyası (Ek Dosya 1) bir DGEList nesnesi oluşturur. Ardından, TMM normalleştirme (Ek Dosya 1) kullanarak veri normalleştirmek. Veri (Ek Dosya 1) ortak ve tagwise dağılımlarını tahmin.
  4. Bir Benjamini-Hochberg ile farklı ifade genleri tanımlamak p-değeri <0.05 (Ek Dosya 1) düzeltildi. Bereket vs log-kat-değişim (Ek Dosya 1) dağılımını çiziniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İki temsili RNA örneklerinin Florimetri (Şekil 1A, B) nt yaklaşık 2.000 iki bant gösterdi. böcek 28S ribozomal RNA, kolayca kısa ısıtma veya hidrojen bağları 35 bozan maddeler ile parçalanmıştır hidrojen bağları ile bir arada tutulan iki polinükleotid zincirlerinden meydana gelmektedir. Elde edilen iki bileşen yaklaşık 18S ribozomal RNA gibi aynı boyutta. ikinci RNA numunesi bozulması yüksek seviyelerde (Şekil 1B) göstermiştir.

A'nın temsil grubunun Photoperiodic tedavisi çoğaltır arasında bazı farklılıklar (Tablo 2) orada olmasına rağmen albopictus sivrisinekler, uzun gün yetiştirilen sivrisinekler kısa gün yetiştirilen sivrisinekler yüksek diapause insidansı ve düşük diapause insidansı sonuçlandı. Örneğin, SD2 kalan çoğaltır daha düşük (% 80) diapause insidansını (- 97.67% 87.18%) gösteren bir kopyasını içerir. Bu suret de küçük sampl vardı e büyüklüğü, bu doğru bir sonuç elde etmek için bir kenara diapause ölçümü için yumurta (> 150) yeterli sayısını ayarlamak için tavsiye edilir, böylece.

Post-sıralama yetişkin A. bir temsilci kütüphane temizlik okumak albopictus kadın (83.853.322 52.736.065 toplam bir temsilci kütüphane için okur itibaren) önemli sayıda okur kaldırıldı. Dijital normalleştirme ayrıca toplam sayısı 41435934 okur azalttı. Bunların Üçlü bir düzeneği 1879 bir N50, 1,023.1 ortalama yakınlık boyu, ve 20892 (Şekil 3) maksimum kontigi uzunluğu ile 76.377 kontig oluşturulan okunur. Diferansiyel ifade sonrası ovipozisyon (Şekil 4), her iki zaman dilimi arasında 3.128 farklı şekilde eksprese edilen genlerin ortaya 11 ve 21 gün diapause indükleyici koşullar altında yetiştirilen embriyo benzer bir iş akışı analiz eder.

/ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg "width =" 600px "/>

Şekil 1: A. Florimetri örneğin yüksek kaliteli (A) ve düşük kaliteli profilleri (B), RNA ekstraksiyonu albopictus. X-ekseni nükleotid parçalarının boyutlarını temsil eder ve y-ekseni floresan okumaları temsil eder. Paneller arasındaki y-ekseni skalasının fark, (A) ve (B) dikkat ediniz. Oklar, farklı ribozomal RNA'lar pozisyonlarını işaretleyin. Yeşil işaretleyici bandına yakın görünür bantlar bozulmayı gösterir.

Şekil 2,

Şekil 2: okunan hazırlık biyoinformatik iş akışı özeti ifadesini diferansiyel Her kutu, her protokol adımı karşılık gelen sayıda eşliğinde bu protokol biyoinformatik bölümünde bir adım temsil eder..


Şekil 3:. Histogram Trinity de novo transcriptome düzeneğinden contiglere uzunlukları ortalama contig uzunluğu 1,023.1 olduğunu. Kontig uzunlukları dağılımı kısa komşularla doğru ağır çarpık olduğunu unutmayın; Bu de novo transcriptome düzeneği tipik bir örneğidir.

Şekil 4,
Şekil 4: 11 gün vs 21 gün sonrası yumurtlama de diapause pharate larvalarının TMM-normalleştirilmiş gen ifadesinin bolluğu vs 2 kat-değişim Log Her nokta bir unigene belirtir;. farklı şekilde eksprese unigenes kırmızı renkle gösterilmiştir. Sonrası yumurtlama 11 gün daha yüksek ifadesi ile Unigenes, nerede pozitif kat-değişim değerlerine sahipyüksek ifadesi olan unigenes post-yumurtlama 21 gün negatif kat-değişim değerlerine sahip.

Program / ​​Kaynak Web sitesi URL (2014/01/13 erişilen)
Perl http://www.perl.org/get.html
piton http://www.python.org/download/
ssaha2 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
NCBI UniVec Çekirdek ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core
SolexaQA http://solexaqa.sourceforge.net/
FastQC http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
Khmer https://github.com/ged-lab/khmer
Üçlü http://trinityrnaseq.sourceforge.net/
Üçlünormalleştirme komut http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html
2 değerlendirme komut Assemblathon https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis
(Makeblastdb ve BLASTX içerir) ŞOK + ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
linebreak https://code.google.com/p/linebreak/
RSEM http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/
Edger Kullanım Kılavuzu http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf
R http://www.r-project.org/
Edger http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html

Tablo 1: Programlar ve kaynaklar t için kullanılanO, bu protokolde prosedürleri biyoinformatik. URL'leri kolayca bu protokolde gerekli kaynakların her erişmek için listelenmiştir.

Tedavi Tekrarlamak 1. yumurtadan yumurta sayısı 2 nci kapak yumurta sayısı Hayır embriyolu, çıkmamış yumurta % Diapause
SD 1 10 0 68 87.18
SD 2 3 0 12 80.00
SD 3 1 0 42 97,67
SD 4 5 0 46 90,20
SD 5 6 0 79 92,94
LD 1 79 4 9 9.78
LD 2 28 0 4 12.50
LD 3 92 1 6 6.06
LD 4 30 0 5 14.29
LD 5 43 0 3 6.52

Tablo 2:. Diapause insidans hesaplamaları diapause insidansı hesaplamaları fotoperiyodun başına beş kez tekrarlanmış olan sonuc. Diapause insidansını hesaplamak için gerekli bütün bunlar un-taranmış, embriyonlu yumurta sayısı, gibi iki ayrı taramalar gelen yumurtadan larva Sayılar dahildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol A indüklenen diapause photoperiodically nedeniyle farklı şekilde ifade edilen genleri bulmak için yöntemler sunulur albopictus. photoperiodic diapause yanıt odaklanan kişiler için özellikle - protokolü benzersiz acemi kullanıcılar için erişilebilir bir moleküler fizyoloji programın tüm deneysel yönlerini yapmak için sivrisinek yetiştirme ve biyoinformatik teknikleri birleştiren önemli olduğunu. Yetiştiricilik hataları tespit etmek genellikle gereklidir - - Mevcut yöntemler, bildiğimiz kadarıyla, yetiştirme protokolü olarak çok ayrıntı vermeyin ne de mansap başarılı biyoinformatik analizi sağlayacak yetiştirme aşamasında deneysel tasarım fikir sağlarlar. Burada sunulan yöntemler A. için optimize edilmiş albopictus, özellikle genel sonraki bir laboratuar kuşaktan altı hafta sürebilir yetiştirme yöntemleri. Ancak, gelecekteki uygulamalarda bu yöntem mütevazı adapte edilebilirphotoperiodic diapause 23 sergileyen diğer sivrisinek türlerinin ayarlamaları. Ayrıca, genel deney tasarımı ve biyoenformatik akışı için diğer polyphenisms çalışma için de geçerlidir.

A. yetiştirme sırasında protokolde ayrıntılı değil birkaç nokta dikkate alınmalıdır albopictus larvaları. İlk olarak, A 36, 37. Kullanılmış lastik çok laboratuvar koloniler kurmak için larva bir ortak kaynağıdır önceki gazetelerde anlatıldığı gibi albopictus doğal ve yapay konteyner habitatların geniş bir yelpazede bulunabilir. Kuzey Amerika'da 32N enlem üzerinde toplanır popülasyonları güçlü diapause yanıtı 13 sergilemek beklenebilir. A. Bu protokolde kullanılan albopictus suşu Manassas, VA toplandı ve deneysel manipülasyon önce fazla sekiz nesiller için bir laboratuar ortamında yetiştirilen edildi. İkincisi, fotoperiyot dolapları aydınlatma özenle seçilmelidir. Dolapları ampulleraydınlatma açılır veya kapanır zaman yerleşik aydınlatma fonksiyonları ile kabine içindeki sıcaklık ani neden olabilir. Resmi olmayan gözlem, bu sıcaklık yükselmeleri diapause yanıt bozabilir göstermektedir. Bunu önlemek için, yerleşik aydınlatma fonksiyonları devre dışı bırakılmalıdır ve dolaplar 4 watt serin-floresan ampul ile donatılmış olmalıdır. Üçüncü olarak, larva H2O ve gıda kalitesi bolluk duyarlıdır. Bu nedenle, aşırı besleme bakteriyel birikimi ve larva ölüm yol açabilir. Dördüncü, kan-besleme yetişkin dişi sivrisinekler için alternatif yöntemler vardır. HemoTek sistemi yazarların deneyimi daha iyi performans rağmen Cam membranlar, alternatif bir yapay membran sistemi 38, 39 bulunmaktadır. Canlı hayvanlar (genellikle tavuk veya kemirgen) da 38 kullanılabilir - bu durumda, bu ilk Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) uygun sertifika almak için esastır. Beşinci, net yayınlanan kanıt inci olmasına rağmenyumurta 15 ışığa olan en, anekdot gözlemler ovipozisyon 10 gün içinde bir LD fotoperiyodunda maruz kaldığında bir SD fotoperiyodun tedavi sergi yumurta hafifçe diapause insidansını azalttığını göstermektedir. Böylece, SD yumurta maksimal diapause yanıt üretmek ve yumurta depolama sırasında fotoperiyodun (SD LD vs) herhangi bir karıştırıcı etkisini önlemek için SD koşullarında hem SD ve LD yumurta saklayın.

Yüksek RNA kalitesi, yüksek kaliteli RNA Dizi verilerinin üretilmesi için esastır. Bol bakım herhangi bir nukleaz kirlenmesini önlemek için RNA ekstraksiyonu sırasında alınmalıdır. Örneğin Şekil 1 B 'de gösterildiği gibi düşük kalitede RNA numuneleri, sekanslama için uygun değildir. Sıralama için numune göndermeden önce RNA kalitesini değerlendirmek zorunludur. RNA molekülleri karakteristik şeritler, yüksek kaliteli bir RNA Elektroforegramda gösterilen 18S daha küçük bu tür dört bant gibi RNA ekstraksiyonu için kullanılan böcek doku farklı tipleri için, görülebileceğiŞekil 1A. Farklı biyolojik tedaviler altında örneklerin arasında 18S iki bant dışındaki RNA bantları Tutarlı desenler olabilir kuvvetle bu bantlar bozulması sonucu, ancak deneysel tasarım seçilen spesifik doku tiplerinin RNA moleküllerinin biyolojik kompozisyonunu temsil etmediğini göstermektedir.

Burada özetlenen biyoinformatik iş akışı deneysel koşullar zıt iki çoğaltılır RNA kütüphanelerinden oluşturulan Illumina sıralama verilerinden farklı olarak ifade edilen genlerin bir listesini elde etmek için bazı komut satırı ve komut dosyası becerileri ile bir kullanıcı sağlar. Bu örnek, farklı olarak bir foto-süresinde bağlı genleri ile ilgilidir, ancak bu akışı bir organizma içinde, iki ya da daha fazla tedavi ile birlikte bir deney tasarımına uygulanabilir. Farklı şekilde ifade edilen genlerin bir listesine ulaşmak için birçok yolu vardır; Bununla birlikte, bu protokol yeni kullanıcı için en doğrudan yaklaşım olması muhtemeldir. Daha eskitecrübe- bioinformaticians kendi montaj contiguity ve yedekli geliştirmek için ekstra önlemler almak isteyebilirsiniz. Hiçbir biyoinformatik deneyimi çok az olan Biyologlar olabilir ücretsiz bir grafik kullanıcı arayüzü odaklı analiz ortamı iPlant 40 Discovery ortamı içinde bu boru hattının, aynı zamanda tam en azından bir kısmını. Bu iPlant işlevselliği de novo transcriptome meclisleri tam RNA Sıra boru hatlarını karşılamak için gelecekte büyük büyümek olasıdır. Son olarak, mükemmel Kullanım Kılavuzu iyice diferansiyel ifade analizi için edger 41 (Tablo 1) kullanmak için birçok yol anlatılır unutmayın.

Bazı durumlarda, yanlış montajlar kimerik kontig üretebilir. Örneğin, Uchime 42 için bu yanlış derlemeleri belirlemek için yardımcı olabilir birkaç yöntem vardır. Ancak, geçmiş deneyimlerinden, tespit kimeralar sayısı son derece düşüktür (<% 0.1) 'dir; Bu nedenle, employinga chimera algılama programı ekstra çabaya değer olmayabilir.

Yüksek verim işlenmesi, gelecek nesil dizileme verileri tek bir proje,> 500 Gb) için veri 1) mağaza büyük miktarda yeteneği (gerektirir; 2) Geleneksel kelime işlemciler veya elektronik tablo programları açılamaz büyük veri dosyalarını işlemek; 3) de novo montaj için örneğin RAM büyük miktarlarda, ihtiyaç analizleri yapmak; ve 4), ya da grafik kullanıcı arabirimleri (analizi ile suit ile sık sık olmayan önemsiz bu programları yüklemek için yeteneği) gerektiren bir komut satırı arayüzü (tahrik programlar aracılığıyla, büyük veri setlerini analiz, örneğin Galaxy 43 veya iPlant 40 ). Işbirlikçisi yoluyla, ya Üniversite ait, veya kendi laboratuvar için satın - Unix komut satırında bazı yeterlilik ve betik dili ile araştırmacılar yerel bir bilgisayar kümeye erişimden en çok yarar kazanacaktır. Örneğin, above iş akışı, bir laboratuvar ait Macintosh (12 çekirdeği, 64 GB RAM, 1 Tb sabit sürücü), ve Trinity montajı için bir üniversite ait bilgisayar küme kullanılarak gerçekleştirildi. Benzer kaynaklar mevcut değilse, araştırmacılar hala nedeniyle grafik arayüzü ortamına eğitim nispeten düşük yatırım ile büyük ölçekli hiçbir ücret ödemeden analizleri gerçekleştirmek için iPlant açmak ve olabilir. Ancak, performans ve analiz yorumlama olanlar hala kullanılan her programın varsayımları anlamak gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Incubator - Model 818 Thermo-Scientific 3751 120 V
Controlled environment room Thermax Scientific N/A Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb Philips 392183 4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm Fisher 08-772-E
Filter Paper 20.5 cm Fisher 09-803-6J
9.5 L Bucket Plastican Bway Products http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White Joann 10173292 http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings Albahealth 23650-040 product no. 081420
Organic Raisins Newman's Own UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown) Fisher Scientific 03-007-52 The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels Seventh Generation 30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set Tupperware http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder Corning Incorporated 7727-2 These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent Sigma Aldrich T9424 Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free Ambion/Life Technologies AM1907 This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap Ambion/Life Technologies AM9782 Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939AA Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder Hemotek  5W1 This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe Hemotek  MT3KFU MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate Pel-Freez Biologicals 33130-1 The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634 (2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633 (2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107 (2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619 (2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52 (1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182 (2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485 (2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10 (2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).

Tags

Genetik Sayı 93, photoperiodic diapause RNA-Seq sivrisinek hayvancılık
Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,<em&gt; Aedes albopictus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff,… More

Poelchau, M. F., Huang, X., Goff, A., Reynolds, J., Armbruster, P. An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus. J. Vis. Exp. (93), e51961, doi:10.3791/51961 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter