We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.
Il campo elettrico fisiologico serve funzioni biologiche specifiche, come dirigere la migrazione delle cellule in fase di sviluppo embrionale, escrescenza neuronale e epiteliale guarigione della ferita. L'applicazione di un campo elettrico in corrente continua a cellule coltivate in vitro induce migrazione cellulare direzionale, o galvanotaxis. Il metodo galvanotaxis 2-dimensionale dimostriamo qui viene modificato con poli misura (cloruro di vinile) (PVC) camere, superficie di vetro, elettrodi di platino e l'uso di uno stadio motorizzato su cui vengono esposte le cellule. Le camere di PVC e elettrodi di platino presentano bassa citotossicità e sono accessibili e riutilizzabili. La superficie di vetro e la fase di microscopio motorizzato migliorare la qualità delle immagini e consentono possibili modifiche alla superficie di vetro e trattamenti alle cellule. Abbiamo girato la galvanotaxis di due linee di cellule tumorali non-SV40-immortalata prostata, PRN-1-1 e pnt2. Queste due linee cellulari mostrano velocità di migrazione simili ed entrambe migrano versoil catodo, ma lo fanno mostrano un diverso grado di direzionalità in galvanotaxis. I risultati ottenuti con questo protocollo suggerire che i PRN-1-1 e le linee cellulari pnt2 possono avere diverse caratteristiche intrinseche che regolano le loro risposte migratori direzionali.
Campi elettrici endogeni vengono rilevati in vari tessuti, come la pelle 1, 32, 33 e il cervello 2. Il campo elettrico fisiologica serve funzioni biologiche specifiche, tra dirigere sviluppo embrionale 3, 4, guidando la conseguenza di processi neuronali 5, 6 e promuovere cicatrizzazione corneale epiteliale e 1, 7. In vitro, l'applicazione di un campo elettrico in corrente continua a cellule coltivate imita il campo elettrico fisiologico e induce migrazione cellulare direzionale, o galvanotaxis. Galvanotaxis è stato studiato in fibroblasti, cheratinociti 8 9 pesci, epiteliale umano e cheratinociti corneali 10-12, linfociti 13, neuroblasti 2 e cellule progenitrici neuronali 14. Se esposto al campo applicato, la maggioranza delle cellule studiate migrare direzionalmente verso il catodica (-) poli. Tuttavia, diverse cellule tumorali, tra cui altamente metastaticole cellule del cancro al seno umano e della prostata umano linea di cellule di cancro PC-3M, passare al anodica (+) Polo 15, 16. Diversi meccanismi sono proposti a mediare galvanotaxis o per spiegare la capacità delle cellule di percepire il campo elettrico, tra cui l'attivazione recettori di EGF 12, il canale del sodio epiteliale 17, PI3K e PTEN 18, e il rilascio di ioni calcio 15, 19. Il meccanismo non è ancora completamente compresa ed è possibile che più vie di segnalazione sono coinvolti in galvanotaxis.
Il metodo galvanotaxis 2-dimensionale dimostriamo qui è utile per caratterizzare la migrazione direzionale aderenti, cellule mobili, sia per monitorare la migrazione singola cella 10, 12, 17 o migrazione di un foglio di cellule confluenti 18, 20. Questa tecnica è modificato dal Peng e Jaffe 21, e Nishimura et al. 10 con, camere di PVC trasparente su misura, con coversl rimovibileips consentendo il recupero delle cellule facile dopo galvanotaxis per l'analisi secondaria, come l'imaging immuno-fluorescenza. La superficie di vetro delle camere galvanotaxis è ottica compatibile, che consente le riprese ad alto ingrandimento e con cellule fluorescenza marcata. Inoltre permette il disegno sperimentale con modifica della superficie di vetro, ad esempio modificando il rivestimento o di superficie. Distanziatori realizzati No. 1 coprioggetti sono utilizzati nelle camere per minimizzare il flusso di corrente sulle celle; quindi il riscaldamento joule, che è proporzionale al quadrato del flusso di corrente, non surriscaldare le cellule durante l'esperimento. I ponti di collegamento agar impediscono il contatto diretto degli elettrodi con le cellule e prevenire cambiamenti del pH medio o concentrazione di ioni durante galvanotaxis.
Due linee cellulari di prostata umana non-cancerogeni sono stati esaminati per la loro risposta galvanotaxis in questo studio. I PRN-1-1 22 e 23 sono entrambi pnt2 SV40 immortalizzate, linee cellulari fattore dipendente dalla crescita esprimono marcatori epiteliali citocheratina 5, 8, 18 e 19 con bassa o nessuna espressione di antigene-specifica della prostata (PSA). Entrambe le linee cellulari mantengono la morfologia poligonale di cellule epiteliali normali, ma cromosoma anomalia è stata osservata in cariotipo 22, 24. Sebbene PRN-1-1 e pnt2 condividono comportamenti simili nella maggior parte degli esperimenti, fanno mostrano differenze nella formazione della struttura e in acinose galvanotaxis. Su una matrice 3-D, Matrigel, i PRN-1-1 cellule formano strutture acinose cave con lumen che assomiglia alla prostata normale della ghiandola tessuto 25. Tuttavia, le cellule pnt2 formano sferoidi solidi senza lumen o polarizzata dell'epitelio 26. Le cellule PRN-1-1 dimostrano anche una risposta galvanotactic superiore alla pnt2 in questo studio. La correlazione tra la formazione della struttura acinar e galvanotaxis in PRN-1-1 suggerisce che i segnali galvanotactic possono svolgere un ruolo nell'organizzazione della prmovimenti tessuto ghiandolare ostate in risposta a campi elettrici endogeni, e fornisce ulteriori caratteristiche di discriminare tra queste linee cellulari 2.
L'analisi della risposta galvanotaxis di una cellula è stato un indicatore funzionale importante per molti migratori o crescita cellulare elabora 27, 28. Qui usiamo una camera di misura con superficie di vetro per filmare due linee di cellule della prostata. Queste linee cellulari hanno dimostrato diversi gradi di galvanotaxis, e ipotizzano che la localizzazione intracellulare o l'attivazione delle proteine galvanotaxis mediare potrebbero creare interferenze durante il processo di generazione d…
The authors have nothing to disclose.
Le linee di cellule della prostata sono gentilmente forniti dal Dr. Ling-Yu Wang e Dr. Hsing-Jien Kung al Cancer Center, UC Davis. Questo progetto è sostenuto da NIH concedere galvanotaxis 4R33AI080604.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cells | |||
pRNS-1-1 prostate cells | Lee et. al., (1994) | ||
PNT2 prostate cells | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon et al., (1995) |
Medium and solutions | |||
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | warm up to 37°C before use |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% in PBS, warm up to 37°C before use |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240 | add 5mL to 500mL medium |
2-propanol | VWR | BDH1133-5GL | |
PBS | – | – | 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C |
Galvanotaxis device | |||
Galvanotaxis chambers | Precision Plastics Inc, CA | custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers | |
Galvanotaxis electrodes | UCD electric shop | platinum coiled electrodes with flexable cords | |
Galvanotaxis power box | Substrate Engineering, CA | custom-designed DC power output with voltmeter | |
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5 | Fisher | 12-544-F | |
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1 | ThermoScientific | 3307 | |
Diamond point marker | ThermoScientific | 750 | |
Marine grade silicon sealer, clear | 3M | 051135-08019 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
6mL syringe | Fisher Scientific | 05-561-64 | |
Nichiryo Syringe, 1.5mL | Nichiryo | SG-M | |
Cotton applicators | Purtian Medical Products | 806-WC | |
Qtips | Johnson & Johnson | 729389 | |
Nalgene 180 PVC tubing | Nalgene | 8000-9030 | 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall |
Bacto-Agar | Difco | 0140-01 | make 2% agar solution |
Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
Equipments and Software | |||
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | operated with an A-4-62 rotor |
Cellometer Auto T4 | Nexcelom | Auto T4 | |
Cellometer counting chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | load 20uL cell solutions to count |
Culture Temp Warming plate | Bel-Art Scienceware | 370150000 | to keep the galvanotaxis chambers at 37°C |
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber | Nikon | ||
Plan Fluor 10X/0.30 objective len | Nikon | ||
Retiga EX CCD camera | Qimaging | Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit | |
Compressed air with 5% CO2 | Airgas | special order | |
Volocity 6.3 | PerkinElmer | Image acquiring software | |
Improvision OpenLab 5.5.2 | PerkinElmer | Cell tracking software and customized to measure migration angles | |
FileMaker Pro Advanced, 8.0 | FileMaker | ||
Microsoft Excel 2008 for Mac | Microsoft |