We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.
De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, zoals het leiding celmigratie in embryonale ontwikkeling, neuronale uitgroei en epitheliale wondgenezing. Het toepassen van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen in vitro induceert directionele celmigratie of galvanotaxis. De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren gemodificeerd met op maat gemaakte poly (vinylchloride) (PVC) Chambers, glas, platina elektroden en het gebruik van een gemotoriseerde podium waarop de cellen worden afgebeeld. De PVC-kamers en platina elektroden vertonen een lage cytotoxiciteit en zijn betaalbaar en herbruikbaar. Het glasoppervlak en het gemotoriseerde microscooptafel verbeteren beeldkwaliteit en laat mogelijke wijzigingen op het glasoppervlak en behandelingen aan de cellen. We filmden de galvanotaxis van twee niet-tumorigene, SV40 vereeuwigd prostaat cellijnen, PRN-1-1 en PNT2. Deze twee cellijnen vertonen gelijkaardige migratie snelheden en beide migreren naarde kathode, maar ze vertonen een verschillende mate van gerichtheid in galvanotaxis. De verkregen via dit protocol resultaten suggereren dat de PRN-1-1 en de PNT2 cellijnen verschillende intrinsieke eigenschappen die hun directionele trekkende reacties regeren kan hebben.
Endogene elektrische velden worden gedetecteerd in verschillende weefsels, zoals huid 1, 32, 33 en hersenen 2. De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, waaronder aansturen embryo ontwikkeling 3, 4, geleiden de uitgroei van neuronale uitlopers 5, 6 en bevorderen epitheel en corneale wonden 1, 7. In vitro toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen bootst de fysiologische elektrisch veld en induceert celmigratie directionele of galvanotaxis. Galvanotaxis is onderzocht in fibroblasten 8, vissen keratinocyten 9, menselijk epitheel en hoornvlies keratinocyten 10-12, lymfocyten 13 neuroblasts 2 en neuronale progenitorcellen 14. Bij blootstelling aan het aangelegde veld, de meeste onderzochte cellen migreren directioneel naar de kathodische (-) pool. Maar verschillende kankercellen, waaronder zeer metastatischehumane borstkankercellen en de humane prostaatkanker cellijn PC-3M, naar de anodische (+) pool 15, 16. verschillende mechanismen voorgesteld galvanotaxis bemiddelen of het vermogen van de cellen om het elektrisch veld detecteren, inclusief activatie verklaren van EGF receptoren 12, de epitheliale natriumkanaal 17 PI3K en PTEN 18 en vrijgave van calciumionen 15, 19. Het mechanisme is nog niet volledig begrepen en het is mogelijk dat meerdere signaalroutes betrokken bij galvanotaxis.
De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren nuttig is de gerichte migratie van hechtende, beweeglijke cellen te karakteriseren, op individuele celmigratie 10, 12, 17 of migratie van een vel van confluente cellen 18, 20. Deze techniek is aangepast van toezicht Peng en Jaffe 21, en Nishimura et al. 10 met op maat gemaakte, heldere PVC kamers, met afneembare coverslips zorgen voor gemakkelijke cel ophalen na galvanotaxis voor secundaire analyse, zoals immuno-fluorescentie beeldvorming. Het glasoppervlak van de galvanotaxis kamers is optisch-compatibel, die het filmen bij een hoge vergrotingsfactor en met fluorescent-gelabelde cellen mogelijk maakt. Ook kan proefopzet met modificatie van het glasoppervlak, zoals het veranderen van de oppervlaktelaag of kosten. Afstandhouders van No. 1 dekglaasje worden in de kamers om de stroom over de cellen te minimaliseren; daarom jouleverwarming, dat evenredig is met het kwadraat van de stroom, zou de cellen oververhitten tijdens het experiment. De verbindende agar bruggen voorkomen direct contact van de elektroden met de cellen en verandering van het medium pH of de ionenconcentratie in galvanotaxis voorkomen.
Twee niet-tumorigene humane prostaat cellijnen onderzocht op hun galvanotaxis reactie in deze studie. De PRN-1-1 22 en PNT2 23 zijn beide SV40-geïmmortaliseerde, growth factor-afhankelijke cellijnen die de epitheliale merkers cytokeratine 5, 8, 18 en 19 met weinig of geen expressie van het prostaat-specifiek antigeen (PSA). Beide cellijnen houden de veelhoekige morfologie van normale epitheelcellen, maar chromosomale abnormaliteit werd waargenomen bij karyotypering 22, 24. Hoewel PRN-1-1 en PNT2 hebben dezelfde gedrag bij de meeste experimenten, ze vertonen verschillen in de vorming van acinaire structuur en galvanotaxis. Bij een 3-D matrix Matrigel, de PRN-1-1 cellen vormen holle acinaire structuren lumen lijken de normale prostaat weefsel 25. De PNT2 cellen vormen vaste bolletjes zonder lumen of gepolariseerde epitheel 26. De PRN-1-1 cellen ook een hogere galvanotactic respons dan de PNT2 in de huidige studie tonen. De correlatie tussen de vorming van acinar structuur en galvanotaxis in PRNS-1-1 suggereert dat de galvanotactic signalen een rol kunnen spelen bij het organiseren van de prostate klier bewegingen weefsel in reactie op endogene elektrische velden, en verschaft verder kenmerken onderscheid tussen deze 2 cellijnen.
De analyse van galvanotaxis reactie van een cel is een belangrijke functionele indicator voor vele cellulaire trekkende of groeiprocessen 27, 28. Hier gebruiken we een op maat gemaakte kamer met glazen oppervlak tot twee prostaat cellijnen te filmen. Deze cellijnen toonden verschillende graden van galvanotaxis en we speculeren dat de intracellulaire lokalisatie of de activering van de galvanotaxis bemiddelende eiwitten gedurende het proces van het genereren van de onsterfelijke cellijnen, waardoor het waargen…
The authors have nothing to disclose.
De prostaat cellijnen worden vriendelijk door Dr. Ling-Yu Wang en Dr. Hsing-Jien Kung op Cancer Center, UC Davis. Dit project wordt ondersteund door NIH galvanotaxis subsidie 4R33AI080604.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cells | |||
pRNS-1-1 prostate cells | Lee et. al., (1994) | ||
PNT2 prostate cells | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon et al., (1995) |
Medium and solutions | |||
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | warm up to 37°C before use |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% in PBS, warm up to 37°C before use |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240 | add 5mL to 500mL medium |
2-propanol | VWR | BDH1133-5GL | |
PBS | – | – | 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C |
Galvanotaxis device | |||
Galvanotaxis chambers | Precision Plastics Inc, CA | custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers | |
Galvanotaxis electrodes | UCD electric shop | platinum coiled electrodes with flexable cords | |
Galvanotaxis power box | Substrate Engineering, CA | custom-designed DC power output with voltmeter | |
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5 | Fisher | 12-544-F | |
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1 | ThermoScientific | 3307 | |
Diamond point marker | ThermoScientific | 750 | |
Marine grade silicon sealer, clear | 3M | 051135-08019 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
6mL syringe | Fisher Scientific | 05-561-64 | |
Nichiryo Syringe, 1.5mL | Nichiryo | SG-M | |
Cotton applicators | Purtian Medical Products | 806-WC | |
Qtips | Johnson & Johnson | 729389 | |
Nalgene 180 PVC tubing | Nalgene | 8000-9030 | 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall |
Bacto-Agar | Difco | 0140-01 | make 2% agar solution |
Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
Equipments and Software | |||
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | operated with an A-4-62 rotor |
Cellometer Auto T4 | Nexcelom | Auto T4 | |
Cellometer counting chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | load 20uL cell solutions to count |
Culture Temp Warming plate | Bel-Art Scienceware | 370150000 | to keep the galvanotaxis chambers at 37°C |
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber | Nikon | ||
Plan Fluor 10X/0.30 objective len | Nikon | ||
Retiga EX CCD camera | Qimaging | Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit | |
Compressed air with 5% CO2 | Airgas | special order | |
Volocity 6.3 | PerkinElmer | Image acquiring software | |
Improvision OpenLab 5.5.2 | PerkinElmer | Cell tracking software and customized to measure migration angles | |
FileMaker Pro Advanced, 8.0 | FileMaker | ||
Microsoft Excel 2008 for Mac | Microsoft |