We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.
O campo eléctrico fisiológico serve funções biológicas específicas, tais como dirigir a migração de células no desenvolvimento embrionário, crescimento neuronal e reparação epitelial. A aplicação de um campo eléctrico de corrente directa para células cultivadas in vitro, induz a migração de células direccional, ou galvanotaxis. O método galvanotaxis 2-dimensional demonstramos aqui é modificado com feito por encomenda poli (cloreto de vinilo) (PVC) câmaras, superfície de vidro, eléctrodos de platina e a utilização de uma fase motorizada no qual as células são criadas imagens. As câmaras de PVC e eletrodos de platina apresentam baixa toxicidade e são acessíveis e re-utilizável. A superfície de vidro e a platina motorizada microscópio melhorar a qualidade das imagens e permitir a possibilidade de alterar a superfície do vidro e tratamentos para as células. Filmamos o galvanotaxis de dois, linhas de células não-tumorais imortalizada com SV40 próstata, PRN-1-1 e PNT2. Estas duas linhas de células mostram velocidades de migração semelhantes e ambos migrar em direcçãocátodo, mas mostram um grau diferente de direcionalidade em galvanotaxis. Os resultados obtidos através deste protocolo sugerem que os PRN-1-1 e as linhas de células PNT2 podem ter diferentes características intrínsecas que governam as suas respostas migratórias direcionais.
Campos eléctricos endógenos são detectados em vários tecidos, tais como pele, 1, 32, 33 e 2 cérebro. O campo eléctrico fisiológico serve funções biológicas particulares, incluindo a orientação desenvolvimento embrionário 3, 4, guiando o crescimento de processos neuronais 5, 6 e promoção do epitélio da córnea e o fechamento da ferida 1, 7. In vitro, a aplicação de um campo eléctrico de corrente directa para células cultivadas imita o campo elétrico fisiológico e induz a migração de células direcional, ou galvanotaxis. Galvanotaxis foi estudado em fibroblastos 8, queratinócitos de peixe 9, epitelial da córnea humana e queratinócitos 10-12, 13 linfócitos, 2, neuroblastos e as células progenitoras neuronais 14. Quando exposta ao campo aplicado, a maioria das células estudadas migrar direccionalmente para a catódica (-) pólo. No entanto, várias células cancerosas, incluindo altamente metastáticocélulas de cancro da mama humano e a linha de células de cancro da próstata humano PC-3M, mover-se para a anódica (+) pólo 15, 16. Vários mecanismos são propostos para mediar galvanotaxis ou para explicar a capacidade das células para detectar o campo eléctrico, incluindo a activação de receptores EGF 12, o canal de sódio epitelial 17, PI3K e PTEN 18, e liberação de íons cálcio 15, 19. O mecanismo ainda não é totalmente compreendido, e é possível que múltiplas vias de sinalização estão envolvidos em galvanotaxis.
O método galvanotaxis 2-dimensional demonstramos aqui é útil para caracterizar a migração direccional de aderente, células móveis, quer para controlar a migração de células individuais 10, 12, 17 ou migração de uma folha de células confluentes 18, 20. Esta técnica é uma modificação Peng e Jaffe 21, e Nishimura et al. 10 com câmaras de PVC feito por encomenda, claras, com coversl removívelips permitindo a recuperação de células fácil depois galvanotaxis para análise secundária, como a imagem de imuno-fluorescência. A superfície de vidro dos câmaras galvanotaxis óptico é compatível, o que permite que a película de alta ampliação e com células fluorescentemente marcado. Ele também permite que o desenho experimental com a modificação da superfície de vidro, como a alteração do revestimento de superfície ou encargos. Espaçadores feitos de uma lamela No. são usados nas câmaras para minimizar o fluxo de corrente sobre as células; Por conseguinte, o aquecimento por efeito de Joule, o que é proporcional ao quadrado da intensidade da corrente, não sobreaquecer as células durante a experiência. As pontes que ligam agar evitar o contato direto dos eletrodos com as células e evitar a mudança do meio de pH ou concentração de íons durante galvanotaxis.
Duas linhas de células de próstata humana não tumorigénicas foram examinadas quanto à sua resposta galvanotaxis neste estudo. Os PRN-1-1 22 e PNT2 23 são ambos SV40-imortalizada, de crescimento de linhas celulares dependentes de factores expressando os marcadores epiteliais citoqueratina 5, 8, 18 e 19 com pouca ou nenhuma expressão do antigénio específico da próstata (PSA). Ambas as linhas celulares manter a morfologia poligonal de células epiteliais normais, mas cromossoma anormalidade foi observada no cariótipo 22, 24. Embora PRN-1-1 e PNT2 partes comportamentos semelhantes na maior parte das experiências, eles mostram diferenças na formação de estrutura e nos ácinos galvanotaxis. Em uma matriz 3-D, Matrigel, os PRN-1-1 células formam estruturas acinares ocas com lumens que assemelham-se a próstata normal de tecido glandular 25. No entanto, as células PNT2 formar esferóides sólidos sem um lúmen ou epitélio polarizado 26. As células PRN-1-1 também demonstram uma resposta mais elevada do que a galvanotactic PNT2 no estudo corrente. A correlação entre a formação de estrutura e acinar galvanotaxis em PRN-1-1 sugere que os sinais galvanotactic pode desempenhar um papel na organização do prmovimentos dos tecidos glandulares ostate em resposta a campos elétricos endógenos, e fornece mais características de discriminar entre estes 2 linhas celulares.
A análise da resposta galvanotaxis de uma célula tem sido um importante indicador funcional para muitos migratório celular ou crescimento processa 27, 28. Aqui usamos uma câmara feito por encomenda com superfície de vidro para filmar duas linhas de células da próstata. Estas linhas de células demonstraram diferentes graus de galvanotaxis, e especula-se que a localização intracelular ou da activação das proteínas de mediar galvanotaxis pode ser interferido durante o processo de geração de linhas…
The authors have nothing to disclose.
As linhas de células de próstata são gentilmente cedido pelo Dr. Ling-Yu Wang e Dr. Hsing-Jien Kung no Centro de Câncer, UC Davis. Este projecto é financiado pelo NIH galvanotaxis concessão 4R33AI080604.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cells | |||
pRNS-1-1 prostate cells | Lee et. al., (1994) | ||
PNT2 prostate cells | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon et al., (1995) |
Medium and solutions | |||
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | warm up to 37°C before use |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% in PBS, warm up to 37°C before use |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240 | add 5mL to 500mL medium |
2-propanol | VWR | BDH1133-5GL | |
PBS | – | – | 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C |
Galvanotaxis device | |||
Galvanotaxis chambers | Precision Plastics Inc, CA | custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers | |
Galvanotaxis electrodes | UCD electric shop | platinum coiled electrodes with flexable cords | |
Galvanotaxis power box | Substrate Engineering, CA | custom-designed DC power output with voltmeter | |
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5 | Fisher | 12-544-F | |
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1 | ThermoScientific | 3307 | |
Diamond point marker | ThermoScientific | 750 | |
Marine grade silicon sealer, clear | 3M | 051135-08019 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
6mL syringe | Fisher Scientific | 05-561-64 | |
Nichiryo Syringe, 1.5mL | Nichiryo | SG-M | |
Cotton applicators | Purtian Medical Products | 806-WC | |
Qtips | Johnson & Johnson | 729389 | |
Nalgene 180 PVC tubing | Nalgene | 8000-9030 | 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall |
Bacto-Agar | Difco | 0140-01 | make 2% agar solution |
Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
Equipments and Software | |||
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | operated with an A-4-62 rotor |
Cellometer Auto T4 | Nexcelom | Auto T4 | |
Cellometer counting chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | load 20uL cell solutions to count |
Culture Temp Warming plate | Bel-Art Scienceware | 370150000 | to keep the galvanotaxis chambers at 37°C |
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber | Nikon | ||
Plan Fluor 10X/0.30 objective len | Nikon | ||
Retiga EX CCD camera | Qimaging | Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit | |
Compressed air with 5% CO2 | Airgas | special order | |
Volocity 6.3 | PerkinElmer | Image acquiring software | |
Improvision OpenLab 5.5.2 | PerkinElmer | Cell tracking software and customized to measure migration angles | |
FileMaker Pro Advanced, 8.0 | FileMaker | ||
Microsoft Excel 2008 for Mac | Microsoft |