We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.
Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, такие как направление миграции клеток в развитие эмбриона, нейронов и эпителиальных нарост заживления ран. Применение постоянного тока электрическое поле культивируемых клеток в пробирке индуцирует направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. 2-мерный метод гальванотаксис демонстрируется здесь модифицированный заказ поли (винилхлорида) (PVC) камер, поверхность стекла, платиновыми электродами и использования моторизованной стадии, на которой клетки изображаемого. Камеры ПВХ и платиновые электроды обладают низкой цитотоксичности и являются доступными и повторного использования. Поверхность стекла и моторизованный столик микроскопа улучшить качество изображения и позволяют возможные изменения в поверхности стекла и лечения к клеткам. Мы снимали гальванотаксис из двух не онкогенных, SV40-увековечена клеточных линий простаты, PRNS-1-1 и PNT2. Эти два клеточных линий показывает, подобные скорости миграции и, как мигрировать в направлениикатод, но они показывают различную степень направленности в гальванотаксис. Полученные результаты с помощью этого протокола предполагают, что PRNS-1-1 и клеточные линии PNT2 могут иметь различные присущие особенности, которые регулируют их направляющие мигрирующих ответов.
Эндогенные электрические поля обнаружены в различных тканях, таких как кожа 1, 32, 33 и головного мозга 2. Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, в том числе направляющего развития эмбриона 3, 4, направляя разрастание нервных процессов 5, 6 и продвижение эпителиальных и закрытие раны роговицы 1, 7. В пробирке, применение постоянного тока электрического поля в культивируемых клетках имитирует физиологическую электрического поля и вызывает направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. Гальванотаксис была изучена в фибробластах 8, рыбные кератиноцитов 9, человеческого эпителия и роговицы кератиноцитов 10-12, лимфоциты 13, нейробласты 2, и нервных клеток-предшественников 14. При воздействии приложенного поля, большинство исследованных клеток мигрировать направленно к катодной (-) полюса. Тем не менее, несколько раковых клеток, в том числе высокой метастатическойчеловека клетки рака молочной железы и простаты человека линии раковых клеток РС-3М, перейти к анодной (+) полюса 15, 16. Некоторые механизмы, как предложено в качестве посредника гальванотаксис или объяснить способность клеток ощущать электрическое поле, в том числе активации рецепторов эпидермального фактора роста 12, эпителиальных натриевых каналов 17, PI3K и PTEN 18, и выпуск ионов кальция 15, 19. Механизм еще не полностью изучены, и вполне возможно, что несколько сигнальных путей участвуют в гальванотаксис.
2-мерный метод гальванотаксис демонстрируется здесь полезно характеризовать направленную миграцию адгезивных, подвижных клеток, либо контролировать отдельные миграцию клеток 10, 12, 17 или миграцию листе сливающихся клеток 18, 20. Этот метод модифицированной из Пэн и Джаффе 21, а Нисимура и др. 10 с на заказ, четких камер ПВХ, со съемным coverslIPS позволяет легко поиска клеток после гальванотаксис для вторичного анализа, такие как томография иммуно-флуоресценции. Стекло поверхность гальванотаксис камер оптико-совместимый, которая позволяет съемку на высоких увеличениях и с флуоресцентно-меченых клеток. Это также позволяет экспериментальную конструкцию с модификацией поверхности стекла, например, изменение поверхностного покрытия или сборы. Распорки из № 1 покровного стекла используются в камерах, чтобы минимизировать ток через клеток; Поэтому джоулева тепла, которое пропорционально квадрату тока, не перегреть клетки в ходе эксперимента. Соединительные агар мосты предотвратить непосредственный контакт электродов с клетками и предотвратить изменение рН среды или концентрации ионов при гальванотаксис.
Два не-онкогенные линии предстательной железы человека клеток были исследованы на их ответ гальванотаксис в данном исследовании. В PRNS-1-1 22 и PNT2 23 оба SV40-иммортализованные, фактор роста-зависимой линии клеток, экспрессирующих эпителиальные маркеры Цитокератин 5, 8, 18 и 19 с низким или вообще без экспрессии простатического специфического антигена (ПСА). Обе клеточные линии поддерживают многоугольную морфологию нормальных эпителиальных клеток, но хромосомных аномалий наблюдался в кариотипированием 22, 24. Несмотря на то, PRNS-1-1 и PNT2 схожие поведения в большинстве экспериментов, они показывают различия в формировании структуры ацинозной и в гальванотаксис. На 3-D матрицы, Matrigel, что PRNS-1-1 клетки образуют полые ацинарные структуры с просветами, напоминающих нормально предстательной железы ткани 25. Тем не менее, PNT2 клетки образуют твердые сфероидов без просвета или поляризованного эпителия 26. В PRNS-1-1 клетки также демонстрируют более высокую galvanotactic ответ, чем PNT2 в данном исследовании. Корреляция между образованием структуры ацинозной и гальванотаксис в PRNS-1-1 предположить, что galvanotactic сигналы могут играть определенную роль в организации PRostate железы движения ткани в ответ на эндогенные электрических полей, а также предоставляет дополнительные характеристики для различения этих 2 клеточных линий.
Анализ ответ гальванотаксис клетки был важным функциональным показателем для многих клеточных миграционных или ростовых процессов 27, 28. Здесь мы используем заказ камеру со стеклянной поверхностью, чтобы снять два сотовых простаты линий. Эти клеточные линии показали, различные ?…
The authors have nothing to disclose.
Клеточные простаты линии любезно предоставлены доктором Лин-Ю Ванг и д-р Син-Jien Кунг на онкологический центр Калифорнийского университета в Дэвисе. Этот проект поддерживается NIH гальванотаксис гранта 4R33AI080604.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cells | |||
pRNS-1-1 prostate cells | Lee et. al., (1994) | ||
PNT2 prostate cells | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon et al., (1995) |
Medium and solutions | |||
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | warm up to 37°C before use |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% in PBS, warm up to 37°C before use |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240 | add 5mL to 500mL medium |
2-propanol | VWR | BDH1133-5GL | |
PBS | – | – | 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C |
Galvanotaxis device | |||
Galvanotaxis chambers | Precision Plastics Inc, CA | custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers | |
Galvanotaxis electrodes | UCD electric shop | platinum coiled electrodes with flexable cords | |
Galvanotaxis power box | Substrate Engineering, CA | custom-designed DC power output with voltmeter | |
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5 | Fisher | 12-544-F | |
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1 | ThermoScientific | 3307 | |
Diamond point marker | ThermoScientific | 750 | |
Marine grade silicon sealer, clear | 3M | 051135-08019 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
6mL syringe | Fisher Scientific | 05-561-64 | |
Nichiryo Syringe, 1.5mL | Nichiryo | SG-M | |
Cotton applicators | Purtian Medical Products | 806-WC | |
Qtips | Johnson & Johnson | 729389 | |
Nalgene 180 PVC tubing | Nalgene | 8000-9030 | 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall |
Bacto-Agar | Difco | 0140-01 | make 2% agar solution |
Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
Equipments and Software | |||
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | operated with an A-4-62 rotor |
Cellometer Auto T4 | Nexcelom | Auto T4 | |
Cellometer counting chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | load 20uL cell solutions to count |
Culture Temp Warming plate | Bel-Art Scienceware | 370150000 | to keep the galvanotaxis chambers at 37°C |
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber | Nikon | ||
Plan Fluor 10X/0.30 objective len | Nikon | ||
Retiga EX CCD camera | Qimaging | Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit | |
Compressed air with 5% CO2 | Airgas | special order | |
Volocity 6.3 | PerkinElmer | Image acquiring software | |
Improvision OpenLab 5.5.2 | PerkinElmer | Cell tracking software and customized to measure migration angles | |
FileMaker Pro Advanced, 8.0 | FileMaker | ||
Microsoft Excel 2008 for Mac | Microsoft |