Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Используя специально разработанный гальванотаксис палаты по изучению направленной миграции из клеток простаты

doi: 10.3791/51973 Published: December 7, 2014

Abstract

Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, такие как направление миграции клеток в развитие эмбриона, нейронов и эпителиальных нарост заживления ран. Применение постоянного тока электрическое поле культивируемых клеток в пробирке индуцирует направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. 2-мерный метод гальванотаксис демонстрируется здесь модифицированный заказ поли (винилхлорида) (PVC) камер, поверхность стекла, платиновыми электродами и использования моторизованной стадии, на которой клетки изображаемого. Камеры ПВХ и платиновые электроды обладают низкой цитотоксичности и являются доступными и повторного использования. Поверхность стекла и моторизованный столик микроскопа улучшить качество изображения и позволяют возможные изменения в поверхности стекла и лечения к клеткам. Мы снимали гальванотаксис из двух не онкогенных, SV40-увековечена клеточных линий простаты, PRNS-1-1 и PNT2. Эти два клеточных линий показывает, подобные скорости миграции и, как мигрировать в направлениикатод, но они показывают различную степень направленности в гальванотаксис. Полученные результаты с помощью этого протокола предполагают, что PRNS-1-1 и клеточные линии PNT2 могут иметь различные присущие особенности, которые регулируют их направляющие мигрирующих ответов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Эндогенные электрические поля обнаружены в различных тканях, таких как кожа 1, 32, 33 и головного мозга 2. Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, в том числе направляющего развития эмбриона 3, 4, направляя разрастание нервных процессов 5, 6 и продвижение эпителиальных и закрытие раны роговицы 1, 7. В пробирке, применение постоянного тока электрического поля в культивируемых клетках имитирует физиологическую электрического поля и вызывает направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. Гальванотаксис была изучена в фибробластах 8, рыбные кератиноцитов 9, человеческого эпителия и роговицы кератиноцитов 10-12, лимфоциты 13, нейробласты 2, и нервных клеток-предшественников 14. При воздействии приложенного поля, большинство исследованных клеток мигрировать направленно к катодной (-) полюса. Тем не менее, несколько раковых клеток, в том числе высокой метастатическойчеловека клетки рака молочной железы и простаты человека линии раковых клеток РС-3М, перейти к анодной (+) полюса 15, 16. Некоторые механизмы, как предложено в качестве посредника гальванотаксис или объяснить способность клеток ощущать электрическое поле, в том числе активации рецепторов эпидермального фактора роста 12, эпителиальных натриевых каналов 17, PI3K и PTEN 18, и выпуск ионов кальция 15, 19. Механизм еще не полностью изучены, и вполне возможно, что несколько сигнальных путей участвуют в гальванотаксис.

2-мерный метод гальванотаксис демонстрируется здесь полезно характеризовать направленную миграцию адгезивных, подвижных клеток, либо контролировать отдельные миграцию клеток 10, 12, 17 или миграцию листе сливающихся клеток 18, 20. Этот метод модифицированной из Пэн и Джаффе 21, а Нисимура и др. 10 с на заказ, четких камер ПВХ, со съемным coverslIPS позволяет легко поиска клеток после гальванотаксис для вторичного анализа, такие как томография иммуно-флуоресценции. Стекло поверхность гальванотаксис камер оптико-совместимый, которая позволяет съемку на высоких увеличениях и с флуоресцентно-меченых клеток. Это также позволяет экспериментальную конструкцию с модификацией поверхности стекла, например, изменение поверхностного покрытия или сборы. Распорки из № 1 покровного стекла используются в камерах, чтобы минимизировать ток через клеток; Поэтому джоулева тепла, которое пропорционально квадрату тока, не перегреть клетки в ходе эксперимента. Соединительные агар мосты предотвратить непосредственный контакт электродов с клетками и предотвратить изменение рН среды или концентрации ионов при гальванотаксис.

Два не-онкогенные линии предстательной железы человека клеток были исследованы на их ответ гальванотаксис в данном исследовании. В PRNS-1-1 22 и PNT2 23 оба SV40-иммортализованные, фактор роста-зависимой линии клеток, экспрессирующих эпителиальные маркеры Цитокератин 5, 8, 18 и 19 с низким или вообще без экспрессии простатического специфического антигена (ПСА). Обе клеточные линии поддерживают многоугольную морфологию нормальных эпителиальных клеток, но хромосомных аномалий наблюдался в кариотипированием 22, 24. Несмотря на то, PRNS-1-1 и PNT2 схожие поведения в большинстве экспериментов, они показывают различия в формировании структуры ацинозной и в гальванотаксис. На 3-D матрицы, Matrigel, что PRNS-1-1 клетки образуют полые ацинарные структуры с просветами, напоминающих нормально предстательной железы ткани 25. Тем не менее, PNT2 клетки образуют твердые сфероидов без просвета или поляризованного эпителия 26. В PRNS-1-1 клетки также демонстрируют более высокую galvanotactic ответ, чем PNT2 в данном исследовании. Корреляция между образованием структуры ацинозной и гальванотаксис в PRNS-1-1 предположить, что galvanotactic сигналы могут играть определенную роль в организации PRostate железы движения ткани в ответ на эндогенные электрических полей, а также предоставляет дополнительные характеристики для различения этих 2 клеточных линий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Культивирование клеток простаты

  1. Культура PRNS-1-1 и PNT2 клеток простаты на 100 мм чашки для культивирования в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и антибиотиков противогрибкового средства при температуре 37 ° С с 5% СО 2. Обновить питательной среды каждый день до тех пор, пока клетки не достигают 80% слияния для гальванотаксис экспериментов.

2. Сборка гальванотаксис палаты

  1. Сборка нижней палаты
    1. Протрите пластиковую гальванотаксис камеру с 2-пропанола. Нанесите герметик Marine Grade кремния вокруг круглых отверстий на нижней стороне камеры с помощью шприца и прикрепите большой покровного стекла (рисунок 1). Используйте обратную сторону ватным аппликатором надавите покровного стекла и протрите излишки клея с ватным тампоном. Круглые отверстия позволяют среда и электрический ток протекать в течение клеток, расположенных между двумя внутренними средних резервуаров.
    2. Вырезать небольшой покровного стекла, чтобы сделать 6 мм х 25 мм проставки с алмазным маркером.
    3. Переверните камеру. Применение 2 полосы кремниевой клеем с помощью шприца и / или металлическим шпателем, чтобы создать 10 мм х 25 мм поверхности канала для прикрепления клеток между 2 круглых отверстий на нижней стекла. Клей 2 кусочков стекла прокладки между 2 круглыми отверстиями. Используйте обратную сторону хлопковых аппликаторов надавите распорки и протрите излишки клея с ватным тампоном и / или зубочисток.
    4. Высушите камеру в течение 24 часов, пока кремния клей не вылечить. Замачивание камеру в дистиллированной воды в течение ночи, чтобы удалить остаток уксусной кислоты из клея. Высушите камеру для немедленного использования, и не храните камеру для последующего использования в чистой емкости.
      Рисунок 1
      Рисунок 1: Монтаж нижней гальванотаксис камеры. ) Большое покровного стекла крепится к нижней части чистой камере. B) ТWO осколки стекла прокладок приклеены между 2 круглыми отверстиями, чтобы создать 10 мм х 25 мм канал для клетки для вложения.
  2. Сеялки клетки на гальванотаксис камер
    1. Подготовка требует количество гальванотаксис камер, необходимых для эксперимента. Каждая ячейка строки или лечение требует одного гальванотаксис камеру. Протрите гальванотаксис камеры с 2-пропанола. Вымойте камеры стерильными PBS 3 раза и проверьте поток жидкости между 2 круглыми отверстиями в камерах.
    2. Приложить камер в стерильной чашки для культивирования клеток и дать им возможность уравновешивания при 37 ° С в течение 15 мин. Открепления клеток простаты из их культуральной чашке с использованием 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА при 37 ° С в течение 5 мин. Нейтрализовать трипсина-ЭДТА с 5 мл 10% FBS в PBS.
    3. Передача клетки 15 мл пробирки и центрифугировать клетки в течение 5 мин при 200 х г, 37 ° С. Аспирата супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл культуральной среды.
    4. Возьмите 20 μл раствора для загрузки клеток в счетной камере, и подсчитать число клеток. Отрегулируйте концентрацию клеток до 8 х 10 4 клеток / мл культуральной среды.
    5. Возьмите гальванотаксис камеры из 37 ° C инкубатора. Семенной 350 мкл клеточной суспензии на каждой камере.
    6. Инкубируйте клетки в камерах в течение ночи в культуральной чашке с влажным Kimwipe или в камере влажности в инкубаторе при 37 ° С с 5% СО 2.

Фиг.2
Рисунок 2:. Посев клеток в камере нижнюю камеру сушат и очищают) клеток предстательной железы трипсином, подсчитаны и переданы в камеру и инкубировали в течение ночи B) сверху покровного стекла крепится к герметизации камеры до съемок...

  1. ssembling верхние камеры
    1. Соберите верхнюю камеру до съемок. Микроскоп может разместиться только с изображениями одного гальванотаксис камеру в одно время. Разминка 10 мл культуральной среды на 37 ° С для каждого гальванотаксис камеры. Передача гальванотаксис камеру от инкубаторов в 37 ° C потепления пластины.
    2. Промойте клетки с культуральной среде для удаления одиноких клеток. Оставьте 400 мкл среды в камере. Использование шприца для применения в высоком вакууме смазку поверх обеих стеклянных спейсеров.
    3. Добавьте небольшое покровного стекла, чтобы запечатать камеру. Осторожно надавите на покровного стекла с задней стороны хлопка аппликатора. Протрите излишки среду с ватными тампонами.
    4. Высушите поверхность стекла и применять высокий вакуум смазку, чтобы запечатать разрыв между покровного стекла и камеры. Используйте металлическую лопаточку, чтобы распространить смазку. Добавить 4 мл культуральной среды на внутренних водоемах и проверить поток жидкости между резервуарами.
  2. Сделать агармосты
    1. Вырезать пару 2 дюйма длиной ПВХ трубы (503/16 ID х 5/16 OD х 1/16 Wall), переверните и вставьте их в мл стакане 100.
    2. Мера 200 мг бактоагар и добавить его в колбу на 50 мл с 10 мл культуральной среды, чтобы сделать 2% гель агара. Микроволновая печь в течение 30 сек. Загрузите гель агара в пластиковой трубки с передачей пипетки. Оставьте агара мосты при комнатной температуре в течение 10 мин для отверждения агара.
    3. Добавить 2 мл культуральной среды к внешним водоемах гальванотаксис камеры. Вставка агара мосты к внутренней и внешней среды резервуаров проводить ток.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Съемка клеток на камеру-схема для демонстрации окончательную сборку гальванотаксис камеры. Камера полностью изолирована с высокой вакуумной смазки. Средний добавляют тО заполнить резервуары, и два агар мостов вставляются в камеру. Затем гальванотаксис камеры передается на столик микроскопа и электроды присоединены применять электрическое поле. Боковой вид собранного гальванотаксис камере показано, чтобы продемонстрировать, что электрический ток протекает по ячейкам через агар мостов и пространство между покровным стеклом.

3. Покадровый изображений

  1. Переключатель на окружающую камеру до 37 ° C с 5% CO 2 в циркулирующем воздухе 2 ч до обработки изображений.
  2. Включите микроскоп и начать программу обработки изображений, эквайринг. Калибровка столик микроскопа и выберите цели в 10 раз.
  3. Передача гальванотаксис камеры на столике микроскопа, закрепите камеру с лентой и сосредоточиться на клетки. Вставьте гальванотаксис электроды к внешним резервуаров с катода на правой стороне. Закрепите провод и электроды с лентой.
  4. Включите источник бох применять электрическое поле в камере. Измерить выходное напряжение с вольтметром через камеру, чтобы достичь 2,5 вольт для 25 мм длиной камеры (100 мВ / мм). Поддержание напряженности поля во время эксперимента путем регулировки выходного тока.
  5. Выберите 10 точек по всей камере снимать в программном обеспечении для создания десять покадровой фильмов. Настройка условий приобретения с интервалами 10-минутных в течение 2 ч.
  6. Начало съемок и регулировки выходного тока по мере необходимости.
  7. В конце эксперимента, удалить камеру от сцены и зафиксировать клетки с 95% -ным спиртом. Взламывай камеру с лезвием бритвы, чтобы очистить и повторно использовать ее.

4. Количественная оценка гальванотаксис

  1. Поворот покадровой фильмы и переориентировать катода к верхней части изображения. Экспорт фильмов в программное обеспечение для отслеживания клеток.
  2. Вручную отслеживать (х, у) положение 10-20 клеток в каждой временной точке из каждого фильма (Рисунок 4 A, B).Расстояния миграции и углы по отношению к северо-южном направлении, же ориентация электрического поля, будет рассчитываться в отслеживая клеток программного обеспечения (рис 4C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: средняя скорость миграции преобразуется из общего расстояния миграции и общее время съемок. Направленность преобразуется из углами к значению косинуса. Если клетки мигрируют со случайным направленности, средняя чистой косинус будет близка к нулю. Если клетки мигрируют непосредственно к катоду, значение косинуса будет 1. Если клетки мигрируют непосредственно к аноду, значение косинуса будет -1.

Рисунок 4
Рисунок 4: Отслеживать сотового измерить направленности) Наложение слежения линий с изображений клеток.. (Х, у) позиций клеток ManuaLLY отслеживаются в покадровой фильмов. . Если клетки мигрируют случайным образом, средний косинус близка к нулю В) Однако, если клетки мигрируют к катоду или аноду, величина среднего косинуса близко к + (катода) или -. (Анод) 1,0 С ) направленность представлена ​​значением косинуса, который превращается из углов миграции (θ). Косинус (θ) равен отношению расстояния (расстояния миграции) в расстоянии Ъ (расстояние проецируется на направление электрического поля).

  1. Сохранить измерения. Импорт данных в базе данных приложения для расчета объединенные результаты.
  2. Экспорт объединенные данные о средней скорости миграции и среднего значения косинуса в электронную таблицу для построения гистограммы (рисунок 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Две линии клеток предстательной железы (PRNS-1-1 и PNT2) были исследованы с помощью этого метода. Клетки обеих линий переноса при подобных скоростью 1,0 +/- 0,3 мкм / мин в течение 2 часов (фиг.5А). Тем не менее, направленность к электрическому полю составляет 0,7 +/- 0,3 для PRNS-1-1 линии, и 0,2 +/- 0,8 для PNT2 линии (фиг.5В). Результаты показывают значительное различие в гальванотаксис этих двух клеточных линий (P <0,01, 100 клетки отслеживать), предполагая, что они имеют различные механизмы клеточной сигнализации, которые приводят к различным направленных ответов на позиционных сигналов.

Рисунок 5
Рисунок 5: гальванотаксис клеток предстательной железы. A) Скорость миграции из PRNS-1-1 и PNT2 линий подобны, когда клетки подвергаются воздействию электрического поля.Б) Однако, PRNS-1-1 линии показали высокую направленность по отношению к катоду (косинуса) = 0,7, в то время как PNT2 линии показали низкую направленности (косинуса = 0,2) в электрическом поле.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Анализ ответ гальванотаксис клетки был важным функциональным показателем для многих клеточных миграционных или ростовых процессов 27, 28. Здесь мы используем заказ камеру со стеклянной поверхностью, чтобы снять два сотовых простаты линий. Эти клеточные линии показали, различные степени гальванотаксис, и мы полагаем, что внутриклеточная локализация или активация гальванотаксис-посредником белков может создавать помехи в процессе генерации бессмертные линии клеток, в результате чего наблюдается различие в ответ гальванотаксис.

По сравнению с другими конструкциями гальванотаксис камеры, сделанные в чашках для культивирования 27, 28, есть несколько преимуществ текущего проекта. Во-первых, поверхность стекла подходит для работы с изображениями и покровного стекла с клетками могут быть получены после гальванотаксис для иммунной окраски. В этом исследовании мы использовали низкой кратности 10Х целью контролировать группу клеток. Тем не менее, с Фесе улучшенный стеклянная оптика, можно снимать одну ячейку при большем увеличении с целью 60X нефти, для отслеживания быстро выдвижении и втягивании lamellipodial на переднем крае клеток 17 или отслеживания клетки, меченные флуоресцентными белками. Во-вторых, поверхность стекла может быть изменен с помощью белковой матрицы покрытий 10, 12 или рисунком с микро-каналов. Химические обработки также можно предварительно обработать клетки перед началом съемок 29. Матрица покрытие не требуется для линий клеток предстательной железы, используемых здесь, и матрица покрытие типа в зависимости от клетки. Например, коллаген I покрытия требуется для гальванотаксис кератиноцитов человека 30, но ламинин покрытие, необходимое для гальванотаксис человеческих нейрональных стволовых клеток 31. Мы протестировали кератиноцитов человека гальванотаксис на коллагене I, коллагена IV, фибронектина и ламинина. Различные матричные белки изменены скорость миграции клеток, но не изменить катодная migrati на в гальванотаксис 29. В-третьих, модифицированные платиновые электроды являются инертными в электрическом поле. По сравнению с серебряными электродами, которые использовались в других методах гальванотаксис 27, они не ломаются или выделяют ионы металла в среде, которая снижает цитотоксичность в гальванотаксис. В-четвертых, мы можем изменить интервалы кадра захвата, что позволяет нам контролировать либо быстро или медленно миграцию клеток. Моторизованный микроскоп также предоставляет возможность приобрести несколько фильмов из разных областей в одной камере. Контрольный эксперимент без приложенного электрического поля имеет важное значение для определения изменяет ли электрическое поле миграционную скорость клеток.

Тем не менее, в настоящее время камеры гальванотаксис ограничены миграции съемок камере до 4 часов из-за малого объема среды в резервуарах. С расширенной версии конструкции камеры, то можно было бы снимать клетки в течение более длительного периода времени.

ve_content "> Некоторые потенциальные проблемы в способе, включают: 1). клетки может умереть в течение узла камеры, если они становятся обезвоживанию Поскольку существует очень небольшой объем среды в камере (400 мкл), важно, чтобы избежать захвата воздуха пузырьки в камере и держать какую-то жидкость, охватывающий клетки во время стадии клеточного полоскания. 2) камера может произойти утечка во время съемки, что уменьшит ток, проходящий через камеру. жидкости в камере должны быть тщательно проверены, прежде чем он является переходит в стадию микроскопа и более высокой вакуумной смазки применяется, если необходимо. 3) Смазанное высокого вакуума смазка может помешать съемок. Стеклянная поверхность можно очищать с 95% -ным спиртом, чтобы удалить жир. 4) Стадия сноса или любое смещение из камер на моторизованный столик микроскопа может исказить измерения направленной миграции. Поэтому, важно обеспечить гальванотаксис камеры с адекватной держателя стадии и маркировочной лентой.

ntent "> В целом, метод гальванотаксис полезно выявить внутреннюю направленность подвижных клеток во внешнем электрическом поле, которая поможет нам в дальнейшем понять направленную миграцию в организмах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Клеточные простаты линии любезно предоставлены доктором Лин-Ю Ванг и д-р Син-Jien Кунг на онкологический центр Калифорнийского университета в Дэвисе. Этот проект поддерживается NIH гальванотаксис гранта 4R33AI080604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells Sigma-Aldrich 95012613-1VL Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  Invitrogen 11875-093 warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240 add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol VWR BDH1133-5GL
PBS - - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA  Invitrogen 25200-056 warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers Precision Plastics Inc, CA Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes UCD electric shop platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box Substrate Engineering, CA custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 Fisher 12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 ThermoScientific 3307
Diamond point marker ThermoScientific 750
Marine grade silicon sealer, clear 3M 051135-08019
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
6 ml syringe Fisher Scientific 05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml Nichiryo SG-M
Cotton applicators Purtian Medical Products 806-WC
Qtips Johnson & Johnson 729389
Nalgene 180 PVC tubing  Nalgene 8000-9030 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar Difco 0140-01 make 2% agar solution
Razor Blade Personna 74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810R operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4 Nexcelom Auto T4
Cellometer counting chambers Nexcelom CHT4-SD100-002 load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate Bel-Art Scienceware 370150000 to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C 
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len Nikon
Retiga EX CCD camera  Qimaging Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2 Airgas special order
Volocity 6.3 PerkinElmer Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2 PerkinElmer Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0 FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2, (3), 661-669 (2007).
  2. Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14, (2), 184-190 (2013).
  3. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption. Dev Biol. 166, (2), 789-800 (1994).
  4. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development. 114, (4), 985-996 (1992).
  5. Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited. Biochem Biophys Res Commun. 431, (2), 280-283 (2013).
  6. Wood, M. D., Willits, R. K. Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements. J Neural Eng. 6, (4), 046003 (2009).
  7. Kucerova, R., et al. The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization. J Cell Physiol. 226, (6), 1544-1553 (2011).
  8. Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength. Exp Dermatol. 12, (4), 396-402 (2003).
  9. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23, (7), 560-568 (2013).
  10. Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds. J Cell Sci. 109, (1), 199-207 (1996).
  11. Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 70, (5), 667-673 (2000).
  12. Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112, (12), 1967-1978 (1999).
  13. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, (7), 1298-1304 (2011).
  14. Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp Neurol. 227, (1), 210-217 (2011).
  15. Wu, D., Ma, X., Lin, F. DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. Cell Biochem Biophys. 67, (3), 1115-1125 (2013).
  16. Martin-Granados, C., et al. A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells. PLoS One. 7, (7), 40769 (2012).
  17. Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes. J Cell Sci. 126, (9), 1942-1951 (2013).
  18. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, (7101), 457-460 (2006).
  19. Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium. J Cell Sci. 119, (22), 4741-4748 (2006).
  20. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (13), 2548-2558 (1996).
  21. Peng, H. B., Jaffe, L. F. Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields. Dev Biol. 53, (2), 277-284 (1976).
  22. Lee, M., et al. Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome. Int J Oncol. 4, (4), 821-830 (1994).
  23. Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines. Int J Oncol. 6, (2), 333-343 (1995).
  24. Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines. Genes Chromosomes Cancer. 30, (2), 143-160 (2001).
  25. Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium. Prostate. 67, (15), 1601-1613 (2007).
  26. Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85, (4), 590-599 (2001).
  27. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field. J Vis Exp. (68), (2012).
  28. Meng, X., et al. Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments. J Vis Exp. (60), (2012).
  29. Pullar, C. E., Isseroff, R. R. Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field. J Cell Sci. 118, (9), 2023-2034 (2005).
  30. Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules. J Invest Dermatol. 106, (4), 642-646 (1996).
  31. Feng, J. F., et al. Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field. Stem Cells. 30, (2), 349-355 (2012).
  32. Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. Microneedle array for measuring wound generated electric fields. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).
  33. Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing. Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).More

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter