We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.
El campo eléctrico fisiológica sirve funciones biológicas específicas, tales como la dirección de la migración celular en el desarrollo del embrión, consecuencia neuronal y la curación de la herida epitelial. La aplicación de un campo eléctrico de corriente directa a las células cultivadas in vitro induce la migración celular direccional, o galvanotaxia. El método galvanotaxia 2-dimensional se demuestra aquí se modifica con cámaras de poli por encargo (cloruro de vinilo) (PVC), superficie de vidrio, electrodos de platino y el uso de una etapa motorizada en la que se crean imágenes de las células. Las cámaras de PVC y electrodos de platino presentan baja citotoxicidad y son asequibles y re-usable. La superficie de vidrio y la platina del microscopio motorizado mejorar la calidad de las imágenes y permiten posibles modificaciones a la superficie de vidrio y tratamientos para las células. Filmamos la galvanotaxia de dos líneas de células no tumorigénicas SV40 inmortalizado próstata, PRN-1-1 y PNT2. Estas dos líneas celulares muestran velocidades de migración similares y ambos migran haciael cátodo, pero muestran un grado diferente de direccionalidad en galvanotaxia. Los resultados obtenidos a través de este protocolo sugerir que los PRN-1.1 y las líneas celulares PNT2 pueden tener diferentes características intrínsecas que gobiernan sus respuestas migratorias direccionales.
Campos eléctricos endógenos se detectan en varios tejidos, como la piel 1, 32, 33 y el cerebro 2. El campo eléctrico fisiológica sirve funciones biológicas específicas, incluyendo la dirección de desarrollo del embrión 3, 4, guiando la consecuencia de los procesos neuronales 5, 6 y la promoción de cierre de la herida epitelial corneal y 1, 7. In vitro, la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa a las células cultivadas imita el campo eléctrico fisiológica e induce la migración celular direccional, o galvanotaxia. Galvanotaxis se ha estudiado en fibroblastos, queratinocitos 8 de pescado 9, epitelial humano y queratinocitos corneales 10-12, linfocitos 13, neuroblastos 2, y células progenitoras neuronales 14. Cuando se expone al campo aplicado, la mayoría de las células estudiadas migran direccionalmente hacia el catódica polo (-). Sin embargo, varias células cancerosas, incluyendo altamente metastásicocélulas de cáncer de mama humano y la próstata humana línea celular de cáncer PC-3M, se mueven a la anódica polo (+) 15, 16. Se proponen varios mecanismos para mediar galvanotaxia o para explicar la capacidad de las células para detectar el campo eléctrico, incluyendo la activación de los receptores de EGF 12, el canal de sodio epitelial 17, PI3K y PTEN 18, y la liberación de iones de calcio 15, 19. El mecanismo no es todavía plenamente comprendida y es posible que múltiples vías de señalización están implicadas en galvanotaxia.
El método galvanotaxia 2-dimensional se demuestra aquí es útil para caracterizar la migración direccional de adherente, células móviles, ya sea para controlar la migración de células individuales 10, 12, 17 o la migración de una hoja de células confluentes 18, 20. Esta técnica se modifica desde Peng y Jaffe 21 y Nishimura et al. 10 con, cámaras de PVC claras a medida, con coversl extraíbleips permitiendo la recuperación de células fácil después galvanotaxia para el análisis secundario, como las imágenes de inmunofluorescencia. La superficie de vidrio de las cámaras galvanotaxia es compatible con óptica, que permite la grabación a alta magnificación y con células marcadas con fluorescencia. También permite que el diseño experimental con la modificación de la superficie de vidrio, tales como cambiar el revestimiento de la superficie o cargos. Los espaciadores hechos de No. 1 cubreobjetos se utilizan en las cámaras para minimizar el flujo de corriente a través de las células; por lo tanto el calentamiento por efecto Joule, que es proporcional al cuadrado del flujo de corriente, no sobrecalentar las células durante el experimento. Los puentes de conexión de agar evitar el contacto directo de los electrodos con las células y prevenir el cambio del pH del medio o la concentración de iones durante galvanotaxia.
Dos no tumorigénicas líneas celulares de próstata humano se examinaron por su respuesta galvanotaxia en este estudio. Los PRN-1-1 22 y PNT2 23 son ambos SV40 inmortalizadas, dependientes de factor de crecimiento de líneas celulares que expresan los marcadores epiteliales citoqueratina 5, 8, 18 y 19 con baja o ninguna expresión de la específica de antígeno de la próstata (PSA). Ambas líneas celulares mantienen la morfología poligonal de las células epiteliales normales, pero anomalía cromosómica se observó en el cariotipo 22, 24. Aunque PRN-1-1 y PNT2 comparten comportamientos similares en la mayoría de los experimentos, muestran diferencias en la formación de la estructura acinar y en galvanotaxia. En una matriz de 3-D, Matrigel, los PRN-1-1 células acinares formar estructuras huecas con lúmenes se asemejan a la tejido de la glándula próstata normal 25. Sin embargo, las células PNT2 formar esferoides sólidos sin un lumen o epitelio polarizado 26. Las células PRN-1-1 también demuestran una respuesta galvanotactic más alta que la PNT2 en el estudio actual. La correlación entre la formación de la estructura acinar y galvanotaxia en PRN-1-1 sugiere que las señales galvanotactic pueden jugar un papel en la organización de la prmovimientos de tejido de la glándula ostate en respuesta a campos eléctricos endógenos, y ofrece características adicionales para discriminar entre estas 2 líneas celulares.
El análisis de la respuesta galvanotaxia de una célula ha sido un indicador funcional importante para muchos migratoria o crecimiento celular procesa 27, 28. Aquí se utiliza una cámara de medida con la superficie de vidrio a la película dos líneas celulares de próstata. Estas líneas celulares demostraron diferentes grados de galvanotaxia, y especulan que la localización intracelular o la activación de las proteínas galvanotaxia-mediación pueden ser interferidas durante el proceso de generación de…
The authors have nothing to disclose.
Las líneas celulares de próstata se amablemente proporcionados por el Dr. Ling-Yu Wang y Dr. Hsing-Jien Kung en el Centro de Cáncer, la Universidad de California Davis. Este proyecto es apoyado por el NIH subvención galvanotaxia 4R33AI080604.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cells | |||
pRNS-1-1 prostate cells | Lee et. al., (1994) | ||
PNT2 prostate cells | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon et al., (1995) |
Medium and solutions | |||
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | warm up to 37°C before use |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% in PBS, warm up to 37°C before use |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240 | add 5mL to 500mL medium |
2-propanol | VWR | BDH1133-5GL | |
PBS | – | – | 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C |
Galvanotaxis device | |||
Galvanotaxis chambers | Precision Plastics Inc, CA | custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers | |
Galvanotaxis electrodes | UCD electric shop | platinum coiled electrodes with flexable cords | |
Galvanotaxis power box | Substrate Engineering, CA | custom-designed DC power output with voltmeter | |
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5 | Fisher | 12-544-F | |
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1 | ThermoScientific | 3307 | |
Diamond point marker | ThermoScientific | 750 | |
Marine grade silicon sealer, clear | 3M | 051135-08019 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
6mL syringe | Fisher Scientific | 05-561-64 | |
Nichiryo Syringe, 1.5mL | Nichiryo | SG-M | |
Cotton applicators | Purtian Medical Products | 806-WC | |
Qtips | Johnson & Johnson | 729389 | |
Nalgene 180 PVC tubing | Nalgene | 8000-9030 | 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall |
Bacto-Agar | Difco | 0140-01 | make 2% agar solution |
Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
Equipments and Software | |||
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | operated with an A-4-62 rotor |
Cellometer Auto T4 | Nexcelom | Auto T4 | |
Cellometer counting chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | load 20uL cell solutions to count |
Culture Temp Warming plate | Bel-Art Scienceware | 370150000 | to keep the galvanotaxis chambers at 37°C |
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber | Nikon | ||
Plan Fluor 10X/0.30 objective len | Nikon | ||
Retiga EX CCD camera | Qimaging | Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit | |
Compressed air with 5% CO2 | Airgas | special order | |
Volocity 6.3 | PerkinElmer | Image acquiring software | |
Improvision OpenLab 5.5.2 | PerkinElmer | Cell tracking software and customized to measure migration angles | |
FileMaker Pro Advanced, 8.0 | FileMaker | ||
Microsoft Excel 2008 for Mac | Microsoft |