We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.
Den fysiologiska elektriska fältet tjänar specifika biologiska funktioner, såsom att rikta cellmigration i embryoutvecklingen, neuronal utväxt och epitelial sårläkning. Att ansluta en likström elektriskt fält till odlade celler in vitro inducerar riktad cellmigrering, eller galvanotaxis. Den två-dimensionella galvanotaxis metod vi demonstrera här är modifierad med skräddarsydd poly (vinylklorid) (PVC) kammare, glasytan, platinaelektroder och användning av en motoriserad scen på vilken cellerna avbildas. PVC kammare och platinaelektroder uppvisar låg cytotoxicitet och är prisvärda och återanvändbara. Den glasytan och det motoriserade mikroskop skede förbättra kvaliteten på bilder och tillåta eventuella ändringar av glasytan och behandlingar till cellerna. Vi filmade galvanotaxis av två icke-tumörframkallande, SV40-odödligprostata cellinjer, PRNS-1-1 och PNT2. Dessa två cellinjer visar liknande migrationshastigheter och båda vandrar motkatoden, men de visar olika grad av riktnings i galvanotaxis. De resultat som erhölls via detta protokoll tyder på att PRN-1-1 och cellinjer PNT2 kan ha olika inneboende egenskaper som styr deras riktningsflytt svar.
Endogena elektriska fält detekteras i olika vävnader, såsom hud 1, 32, 33 och hjärna 2. Den fysiologiska elektriska fältet tjänar specifika biologiska funktioner, inklusive styra embryoutveckling 3, 4, styra utväxt av neuronala processer 5, 6 och främja epitelial och hornhinnans sårtillslutning 1, 7. In vitro applicering av en likström elektriskt fält till odlade celler härmar fysiologiska elektriska fält och inducerar riktad cellmigration, eller galvanotaxis. Galvanotaxis har studerats hos fibroblaster 8, fisk keratinocyter 9, mänsklig epitelial och hornhinnan keratinocyter 10-12, lymfocyter 13, neuroblaster 2 och neuronala stamceller 14. När de utsätts för den pålagda fältet, de flesta studerade celler migrerar riktnings mot katod (-) pol. Ändå flera cancerceller, inklusive mycket metastatiskahumana bröstcancerceller och den humana prostatacancer-cellinje PC-3M, flytta till anodala (+) polen 15, 16. föreslås Flera mekanismer för att mediera galvanotaxis eller att förklara förmågan hos cellerna att avkänna det elektriska fältet, inklusive aktivering av EGF-receptorer 12, epitelial natriumkanalen 17, PI3K och PTEN 18, och frisättning av kalciumjoner 15, 19. Mekanismen är ännu inte helt klarlagt och det är möjligt att multipla signalvägar är involverade i galvanotaxis.
Den två-dimensionella galvanotaxis metod vi demonstrera här är användbar för att karakterisera den riktnings migration av vidhäftande, motila celler, antingen för att övervaka enskilda cellmigration 10, 12, 17 eller migrering av ett ark av konfluenta celler 18, 20. Denna teknik är modifierad från al. Peng och Jaffe 21, och Nishimura et 10 med skräddarsydda, klara PVC kammare, med avtagbar coverslips vilket möjliggör enkel cell hämtning efter galvanotaxis för sekundäranalys, såsom immun fluorescens avbildning. Den glasyta galvanotaxis kamrarna är optisk-kompatibel, vilket möjliggör inspelningen vid hög förstoring och med fluorescensmärkta celler. Det gör också den experimentella designen med modifiering av glasytan, till exempel att ändra ytbeläggningen eller avgifter. Distanser gjorda av nr 1 täckglas används i kamrarna för att minimera strömflödet över cellerna; därför den Joule-uppvärmning, som är proportionell mot kvadraten på strömflödet, inte skulle överhettas cellerna under experimentet. De anslut agar broar förhindra direkt kontakt av elektroderna med cellerna och förhindra förändring av mediets pH eller jonkoncentration under galvanotaxis.
Undersöktes Två icke-tumorigena humana prostatacellinjer för sin galvanotaxis svar i denna studie. De PRN-1-1 22 och PNT2 23 är både SV40-immortaliserade, tillväxtfaktorberoende cellinjer som uttrycker de epiteliala markörer cytokeratin 5, 8, 18 och 19 med låg eller ingen expression av prostataspecifikt antigen (PSA). Båda cellinjerna bibehålla den polygonala morfologi av normala epitelceller, men kromosom abnormitet observerades i karyotypning 22, 24. Fastän PRN-1-1 och PNT2 delar liknande beteenden i de flesta experiment, de visar skillnader i bildningen av acinar struktur och i galvanotaxis. På en 3-D-matris, Matrigel, de PRN-1-1 celler bildar ihåliga acinära strukturer med lumen liknar den normala prostatakörteln vävnad 25. Men de PNT2 cellerna bilda fasta sfäroider utan lumen eller polariserad epitel 26. De PRN-1-1 celler visar också en högre galvanotactic respons än den PNT2 i den aktuella studien. Korrelationen mellan bildandet av acinar struktur och galvanotaxis i PRN-1-1 antyder att de galvanotactic signalerna kan spela en roll i att organisera prostate körtel vävnad rörelser som svar på endogena elektriska fält, och ger ytterligare egenskaper för att skilja mellan dessa två cellinjer.
Analysen av en cells galvanotaxis svar har varit en viktig funktionell indikator för många cell vandrande eller tillväxt processer 27, 28. Här använder vi en skräddarsydd kammare med glasytan att filma två prostata cellinjer. Dessa cellinjer har visat olika grad av galvanotaxis, och vi spekulera i att den intracellulära lokaliseringen eller aktiveringen av galvanotaxis förmedlande proteiner kan störas under processen för att generera de odödliga cellinjer, vilket resulterar i den observerade skill…
The authors have nothing to disclose.
De prostata cellinjer vänligen tillhandahålls av Dr Ling-Yu Wang och Dr. Hsing-Jien Kung på Cancer Center, UC Davis. Projektet stöds av NIH galvanotaxis bidrag 4R33AI080604.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cells | |||
pRNS-1-1 prostate cells | Lee et. al., (1994) | ||
PNT2 prostate cells | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon et al., (1995) |
Medium and solutions | |||
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | warm up to 37°C before use |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% in PBS, warm up to 37°C before use |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240 | add 5mL to 500mL medium |
2-propanol | VWR | BDH1133-5GL | |
PBS | – | – | 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C |
Galvanotaxis device | |||
Galvanotaxis chambers | Precision Plastics Inc, CA | custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers | |
Galvanotaxis electrodes | UCD electric shop | platinum coiled electrodes with flexable cords | |
Galvanotaxis power box | Substrate Engineering, CA | custom-designed DC power output with voltmeter | |
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5 | Fisher | 12-544-F | |
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1 | ThermoScientific | 3307 | |
Diamond point marker | ThermoScientific | 750 | |
Marine grade silicon sealer, clear | 3M | 051135-08019 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
6mL syringe | Fisher Scientific | 05-561-64 | |
Nichiryo Syringe, 1.5mL | Nichiryo | SG-M | |
Cotton applicators | Purtian Medical Products | 806-WC | |
Qtips | Johnson & Johnson | 729389 | |
Nalgene 180 PVC tubing | Nalgene | 8000-9030 | 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall |
Bacto-Agar | Difco | 0140-01 | make 2% agar solution |
Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
Equipments and Software | |||
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | operated with an A-4-62 rotor |
Cellometer Auto T4 | Nexcelom | Auto T4 | |
Cellometer counting chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | load 20uL cell solutions to count |
Culture Temp Warming plate | Bel-Art Scienceware | 370150000 | to keep the galvanotaxis chambers at 37°C |
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber | Nikon | ||
Plan Fluor 10X/0.30 objective len | Nikon | ||
Retiga EX CCD camera | Qimaging | Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit | |
Compressed air with 5% CO2 | Airgas | special order | |
Volocity 6.3 | PerkinElmer | Image acquiring software | |
Improvision OpenLab 5.5.2 | PerkinElmer | Cell tracking software and customized to measure migration angles | |
FileMaker Pro Advanced, 8.0 | FileMaker | ||
Microsoft Excel 2008 for Mac | Microsoft |