Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Använda Skräddarsydda Galvanotaxis Chambers att studera Directional Migration av prostataceller

doi: 10.3791/51973 Published: December 7, 2014

Abstract

Den fysiologiska elektriska fältet tjänar specifika biologiska funktioner, såsom att rikta cellmigration i embryoutvecklingen, neuronal utväxt och epitelial sårläkning. Att ansluta en likström elektriskt fält till odlade celler in vitro inducerar riktad cellmigrering, eller galvanotaxis. Den två-dimensionella galvanotaxis metod vi demonstrera här är modifierad med skräddarsydd poly (vinylklorid) (PVC) kammare, glasytan, platinaelektroder och användning av en motoriserad scen på vilken cellerna avbildas. PVC kammare och platinaelektroder uppvisar låg cytotoxicitet och är prisvärda och återanvändbara. Den glasytan och det motoriserade mikroskop skede förbättra kvaliteten på bilder och tillåta eventuella ändringar av glasytan och behandlingar till cellerna. Vi filmade galvanotaxis av två icke-tumörframkallande, SV40-odödligprostata cellinjer, PRNS-1-1 och PNT2. Dessa två cellinjer visar liknande migrationshastigheter och båda vandrar motkatoden, men de visar olika grad av riktnings i galvanotaxis. De resultat som erhölls via detta protokoll tyder på att PRN-1-1 och cellinjer PNT2 kan ha olika inneboende egenskaper som styr deras riktningsflytt svar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endogena elektriska fält detekteras i olika vävnader, såsom hud 1, 32, 33 och hjärna 2. Den fysiologiska elektriska fältet tjänar specifika biologiska funktioner, inklusive styra embryoutveckling 3, 4, styra utväxt av neuronala processer 5, 6 och främja epitelial och hornhinnans sårtillslutning 1, 7. In vitro applicering av en likström elektriskt fält till odlade celler härmar fysiologiska elektriska fält och inducerar riktad cellmigration, eller galvanotaxis. Galvanotaxis har studerats hos fibroblaster 8, fisk keratinocyter 9, mänsklig epitelial och hornhinnan keratinocyter 10-12, lymfocyter 13, neuroblaster 2 och neuronala stamceller 14. När de utsätts för den pålagda fältet, de flesta studerade celler migrerar riktnings mot katod (-) pol. Ändå flera cancerceller, inklusive mycket metastatiskahumana bröstcancerceller och den humana prostatacancer-cellinje PC-3M, flytta till anodala (+) polen 15, 16. föreslås Flera mekanismer för att mediera galvanotaxis eller att förklara förmågan hos cellerna att avkänna det elektriska fältet, inklusive aktivering av EGF-receptorer 12, epitelial natriumkanalen 17, PI3K och PTEN 18, och frisättning av kalciumjoner 15, 19. Mekanismen är ännu inte helt klarlagt och det är möjligt att multipla signalvägar är involverade i galvanotaxis.

Den två-dimensionella galvanotaxis metod vi demonstrera här är användbar för att karakterisera den riktnings migration av vidhäftande, motila celler, antingen för att övervaka enskilda cellmigration 10, 12, 17 eller migrering av ett ark av konfluenta celler 18, 20. Denna teknik är modifierad från al. Peng och Jaffe 21, och Nishimura et 10 med skräddarsydda, klara PVC kammare, med avtagbar coverslips vilket möjliggör enkel cell hämtning efter galvanotaxis för sekundäranalys, såsom immun fluorescens avbildning. Den glasyta galvanotaxis kamrarna är optisk-kompatibel, vilket möjliggör inspelningen vid hög förstoring och med fluorescensmärkta celler. Det gör också den experimentella designen med modifiering av glasytan, till exempel att ändra ytbeläggningen eller avgifter. Distanser gjorda av nr 1 täckglas används i kamrarna för att minimera strömflödet över cellerna; därför den Joule-uppvärmning, som är proportionell mot kvadraten på strömflödet, inte skulle överhettas cellerna under experimentet. De anslut agar broar förhindra direkt kontakt av elektroderna med cellerna och förhindra förändring av mediets pH eller jonkoncentration under galvanotaxis.

Undersöktes Två icke-tumorigena humana prostatacellinjer för sin galvanotaxis svar i denna studie. De PRN-1-1 22 och PNT2 23 är både SV40-immortaliserade, tillväxtfaktorberoende cellinjer som uttrycker de epiteliala markörer cytokeratin 5, 8, 18 och 19 med låg eller ingen expression av prostataspecifikt antigen (PSA). Båda cellinjerna bibehålla den polygonala morfologi av normala epitelceller, men kromosom abnormitet observerades i karyotypning 22, 24. Fastän PRN-1-1 och PNT2 delar liknande beteenden i de flesta experiment, de visar skillnader i bildningen av acinar struktur och i galvanotaxis. På en 3-D-matris, Matrigel, de PRN-1-1 celler bildar ihåliga acinära strukturer med lumen liknar den normala prostatakörteln vävnad 25. Men de PNT2 cellerna bilda fasta sfäroider utan lumen eller polariserad epitel 26. De PRN-1-1 celler visar också en högre galvanotactic respons än den PNT2 i den aktuella studien. Korrelationen mellan bildandet av acinar struktur och galvanotaxis i PRN-1-1 antyder att de galvanotactic signalerna kan spela en roll i att organisera prostate körtel vävnad rörelser som svar på endogena elektriska fält, och ger ytterligare egenskaper för att skilja mellan dessa två cellinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Odling prostateceller

  1. Kultur de PRN-1-1 och PNT2 prostateceller på 100 mm odlingsskålar i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% FBS och Antibiotika Antimykotisk vid 37 ° C med 5% CO2. Uppdatera odlingsmediet varje dag tills cellerna når 80% konfluens för galvanotaxis experiment.

2. Montering Galvanotaxis Chambers

  1. Hopsättning bottenkamrarna
    1. Torka en plast galvanotaxis kammare med 2-propanol. Applicera marint kisel sealer runt de cirkulära öppningar på undersidan av en kammare med en spruta och bifoga en stor coverglass (Figur 1). Använd baksidan av en bomulls applikator för att trycka ner coverglass och torka bort överflödigt lim med bomullspinnar. De cirkulära öppningar tillåter mediet och elektrisk ström att strömma över de celler som är belägna mellan de båda inre medel reservoarer.
    2. Skär ett litet coverglass att göra 6 mm x 25 mm distanser med en diamant punkt markör.
    3. Vänd kammaren. Applicera två ränder av kisel lim med en spruta och / eller en metallspatel för att skapa en 10 mm x 25 mm kanalytan för cellbindning mellan de två cirkulära öppningarna på undersidan glaset. Limma två bitar av glas spacer mellan de två cirkulära öppningar. Använd baksidan av bomulls applikatorer för att trycka ner de distanserna och torka av överflödigt lim med bomullspinnar och / eller tandpetare.
    4. Torka kammaren under 24 h tills kisel limmet härdas. Blöt kammaren i destillerat vatten över natten för att avlägsna ättiksyran återstoden från limmet. Torka kammaren för omedelbar användning, eller förvara kammare för senare användning i en ren behållare.
      Figur 1
      Figur 1: Montering av botten galvanotaxis kammaren. A) En stor coverglass är fäst till botten av en ren kammare. B) Two bitar av glas distanser limmas mellan 2 cirkulära öppningar för att skapa en 10 mm x 25 mm kanal för celler att fästa.
  2. Sådd celler på galvanotaxis kamrarna
    1. Förbered kräva antalet galvanotaxis kammare behövs för experimentet. Varje cellinje eller behandling kräver en enda galvanotaxis kammare. Torka av galvanotaxis kammare med 2-propanol. Tvätta kamrarna med sterila PBS 3 gånger och kontrollera vätskeflödet mellan de två cirkulära öppningar i kamrarna.
    2. Inne kamrarna i sterila cellodlingsskålar och låta dem komma i jämvikt vid 37 ° C under 15 min. Drag av de prostataceller från deras odlingsskål med användning av 5 ml 0,25% trypsin-EDTA vid 37 ° C under 5 min. Neutralisera trypsin-EDTA med 5 ml 10% FBS i PBS.
    3. Överför cellerna till 15 ml rör och centrifugera cellerna under 5 min vid 200 xg, 37 ° C. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml odlingsmedium.
    4. Ta 20 μl cellösning att ladda till en räknekammare och beräkna antalet celler. Justera cellkoncentrationen till 8 x 10 4 celler / ml med odlingsmedium.
    5. Ta galvanotaxis kamrarna ur 37 ° C inkubator. Seed 350 | il av cellsuspensionen på varje kammare.
    6. Inkubera cellerna i kamrarna över natten i odlingsskålen med våt Kimwipe eller i en fuktkammare i inkubatorn vid 37 ° C med 5% CO2.

Figur 2
Figur 2:. Ympning av cellerna till kammaren bottenkammaren torkas och rengöras A) Prostata celler trypsinerades, räknades och överfördes till kammaren och inkuberades över natten B) En topp coverglass är fäst försegla kammaren före filmning...

  1. ENssembling de bästa kamrarna
    1. Montera den övre kammaren före filmning. Mikroskopet kan bara rymma avbildning en enda galvanotaxis kammare på en gång. Värm upp 10 ml odlingsmedium vid 37 ° C för varje galvanotaxis kammaren. Överför en galvanotaxis kammare från inkubatorer till en 37 ° C värmeplattan.
    2. Skölj cellerna med odlingsmedium för att avlägsna de obundna cellerna. Lämna 400 | il medium i kammaren. Använd en spruta för att tillämpa högt fett vakuum ovanpå båda glas distanser.
    3. Lägg en liten coverglass att täta kammaren. Tryck försiktigt ned coverglass med baksidan av en bomulls applikator. Torka av överflödigt medium med bomullspinnar.
    4. Torka glasytan och tillämpa högt vakuum fett för att täta mellanrummet mellan coverglass och kammaren. Använd en metallspatel att sprida fett. Tillsätt 4 ml av odlingsmediet till de inre behållarna och kontrollera vätskeflödet mellan reservoarer.
  2. Gör agarbroar
    1. Skär ett par 2 tum lång PVC-slang (503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall), vända och infoga dem i en 100 ml bägare.
    2. Mät 200 mg Bacto-Agar och lägg det i en 50 ml kolv med 10 ml odlingsmedium för att göra 2% agargel. Mikrovågsugn för 30 sek. Fyll på agargel till plaströr med en överföring pipett. Lämna de agar broar vid rumstemperatur under 10 min för att stelna agam.
    3. Lägg 2 ml odlingsmedium till de yttre reservoarer av galvanotaxis kammaren. Sätt i agar broar till de inre och yttre medel reservoarer för att leda strömmen.

Figur 3
Figur 3:. Filma cellerna på kammaren Ett diagram för att visa den slutliga monteringen av galvanotaxis kammaren. Kammaren är helt förseglad med hög vakuum fett. Medium tillsättes to fylla reservoarerna, och två agar broar är införda in i kammaren. Därefter galvanotaxis kammaren överföres till mikroskopställningen och elektroderna är fäst vid tillämpa det elektriska fältet. Sidovy av den monterade galvanotaxis kammaren visas för att visa att den elektriska strömmen flyter över cellerna genom de agar broar och utrymmet mellan täckglaset.

3. Time-lapse Imaging

  1. Slå på miljökammaren till 37 ° C med 5% CO2 i den cirkulerande luften 2 h före avbildning.
  2. Slå på mikroskopet och initiera bild skaffa programvara. Kalibrera mikroskop scenen och välj 10X objektiv.
  3. Överför galvanotaxis kamrarna till mikroskop scenen, säkra kammaren med tejp och fokusera på cellerna. Sätt i galvanotaxis elektroderna till de yttre reservoarer med katod på höger sida. Säkra kabeln och elektrod med tejp.
  4. Slå på strömmen box för att applicera ett elektriskt fält till kammaren. Mät utspänningen med voltmeter över kammaren för att nå 2,5 volt för den 25 mm långa kammare (100 mV / mm). Bibehåll fältstyrkan under experimentet genom att justera den utgående strömmen.
  5. Välj 10 punkter över kammaren för att filma i programvaran för att generera tio time-lapse filmer. Sätt upp förvärvs betingelser vid 10-minuters intervall under 2 timmar.
  6. Starta filmning och justera utgångs aktuell som behövs.
  7. Vid slutet av experimentet, avlägsna kammaren från scenen och fixera cellerna med 95% alkohol. Bryt öppna kammaren med ett rakblad för att rengöra och återanvända den.

4. Kvantifiering av Galvanotaxis

  1. Rotera tidsförlopp filmer och återskapa det katod till toppen av bilderna. Exportera filmer till spårningscell programvaran.
  2. Manuellt spåra (x, y) -position av 10-20 celler vid varje tidpunkt från varje film (Figur 4 A, B).Migrations avstånd och vinklar i förhållande till nord-sydlig riktning, samma orientering av det elektriska fältet, kommer att beräknas i spårningscell programvara (Figur 4C).
    OBS: Den genomsnittliga migrationshastigheten omvandlas från den totala migrationen avstånd och total filmning tiden. Riktningen omvandlas från de vinklar mot cosinus värdet. Om celler migrerar med slumpmässig rikt kommer den genomsnittliga netto cosinus vara nära noll. Om cellerna migrerar direkt mot katoden, kommer cosinus värdet vara en. Om cellerna migrerar direkt mot anoden, kommer cosinus värdet vara -1.

Figur 4
Figur 4: Cell spårning för att mäta rikt A) Overlay av spårningslinjer med cellbilder.. De (x, y) positionerna för cellerna är Manually spåras i time-lapse filmer. . Om cellerna migrerar slumpvis, är den genomsnittliga cosinus nära noll B) Om emellertid cellerna migrerar mot katoden eller anoden, är nära till + (katod) eller värdet på den genomsnittliga cosinus -. (Anod) 1,0 C ) Den rikt presenteras av cosinus värdet, som omvandlas från migrationsvinklar (θ). Cosinus (θ) är lika med förhållandet mellan avståndet a (migreringsavstånd) till avståndet b (avståndet projiceras mot riktningen för det elektriska fältet).

  1. Spara mätningarna. Importera data till en databas ansökan för att beräkna de kombinerade resultaten.
  2. Exportera de kombinerade data för genomsnittsmigrationshastighet och genomsnittliga cosinus värdet till ett kalkylblad för att plotta stapeldiagram (Figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Två rader av prostataceller (PRN-1-1 och PNT2) undersöktes med denna metod. Celler i båda linjerna migrera vid liknande hastigheter på 1.0 +/- 0,3 mikrometer / min under loppet av 2 timmar (Figur 5A). Emellertid, den riktverkan till det elektriska fältet är 0,7 +/- 0,3 för PRN-1-1 linje, och 0,2 +/- 0,8 för PNT2 linjen (figur 5B). Resultaten visar en signifikant skillnad i galvanotaxis av dessa två cellinjer (p <0,01, var 100 celler spåras), vilket tyder på att de har olika cellulära signalmekanismer som resulterar i olika riktnings svar på positions ledtrådar.

Figur 5
Figur 5: Galvanotaxis av prostataceller. A) Migrerings hastigheter PRN-1-1 och PNT2 linjer är likartad när cellerna exponeras för det elektriska fältet.B) Den PRN-1-1 linjen visade en hög riktverkan mot katod (cosinus = 0,7), medan PNT2 linjen visade en låg rikt (cosinus = 0,2) i det elektriska fältet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Analysen av en cells galvanotaxis svar har varit en viktig funktionell indikator för många cell vandrande eller tillväxt processer 27, 28. Här använder vi en skräddarsydd kammare med glasytan att filma två prostata cellinjer. Dessa cellinjer har visat olika grad av galvanotaxis, och vi spekulera i att den intracellulära lokaliseringen eller aktiveringen av galvanotaxis förmedlande proteiner kan störas under processen för att generera de odödliga cellinjer, vilket resulterar i den observerade skillnaden i galvanotaxis svaret.

Jämfört med andra galvanotaxis kammar mönster som i odlingsskålar 27, 28, finns det flera fördelar med att den nuvarande utformningen. Först, är glasytan lämplig för avbildning och coverglass med celler kan hämtas efter galvanotaxis för immunfärgning. I denna studie använde vi en låg förstoring av 10X objektiv för att övervaka en grupp av celler. Men med these förbättrad glasoptik, är det möjligt att filma en enda cell vid högre förstoring med en 60X olja mål, för att spåra snabb utskjutning och tillbakadragning av lamellipodial vid framkanten av cellerna 17 eller spåra celler märkta med fluorescerande proteiner. För det andra, kan glasytan modifieras med matrisproteinbeläggningar 10, 12 eller mönstrad med mikrokanaler. Kemiska behandlingar är också möjligt att för- behandla cellerna innan filma 29. Matrix beläggning krävs inte för prostata cellinjer som används här, och matrisen beläggningen är celltyp beroende. Till exempel, är kollagen I beläggning krävs för galvanotaxis av humana keratinocyter 30, men laminin beläggning krävs för galvanotaxis av humana neurala stamceller 31. Vi testade human keratinocyt galvanotaxis på kollagen I, kollagen IV, fibronektin, och laminin. Olika matrixproteiner förändrad cellmigration hastighet, men inte ändra katod migrati på i galvanotaxis 29. För det tredje, de modifierade platinaelektroder är inerta i det elektriska fältet. Jämfört med de silverelektroder som används i andra galvanotaxis metoder 27, de inte bryts ned eller frigöra metalljoner till mediet, vilket minskar cytotoxiciteten i galvanotaxis. För det fjärde kan vi ändra intervall ram fånga, vilket hjälper oss att övervaka antingen snabb eller långsam cellmigration. Den motoriserade mikroskop ger också möjlighet att förvärva flera filmer från olika områden i en kammare. Ett kontrollexperiment utan det pålagda elektriska fältet är viktig för att fastställa huruvida det elektriska fältet förändrar migrationshastigheten hos cellerna.

Men de nuvarande galvanotaxis kamrarna begränsade till filmning cell migration i upp till 4 timmar på grund av den lilla volymen medium i reservoarerna. Med en förstorad version av kammarkonstruktion, skulle det vara möjligt att filma celler under en längre tidsperiod.

ve_content "> Vissa potentiella problem i metoden är:. 1) cellerna avlider under kammarenheten om de blir uttorkad Eftersom det finns en mycket liten volym medium i kammaren (400 pl), är det viktigt att undvika att fånga luft bubblor i kammaren och att hålla en del vätska som täcker cellerna under cellsköljsteget. 2) Kammaren kan läcka under avbildning, vilket skulle minska den nuvarande passerar genom kammaren. Vätskeflödet i kammaren bör noggrant kontrolleras innan det är överföras till mikroskop scenen och mer high fett vakuum tillämpas om det behövs. 3) Fläckig högt fett vakuum kan störa inspelningen. Glasytan kan rengöras med 95% alkohol för att ta bort fett. 4) Stage avdrift eller någon förskjutning av kamrarna på en motoriserad mikroskop skede kunde partiskhet mätningarna av riktnings migration. Därför är det viktigt att säkra galvanotaxis kamrarna med tillräcklig skede hållare och märkband.

ntent "> Totalt sett är galvanotaxis metoden användbar för att avslöja den inneboende riktningen på rörliga celler i en tillämpad elektriskt fält, vilket kommer att hjälpa oss att ytterligare förstå riktnings migration i organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De prostata cellinjer vänligen tillhandahålls av Dr Ling-Yu Wang och Dr. Hsing-Jien Kung på Cancer Center, UC Davis. Projektet stöds av NIH galvanotaxis bidrag 4R33AI080604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells Sigma-Aldrich 95012613-1VL Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  Invitrogen 11875-093 warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240 add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol VWR BDH1133-5GL
PBS - - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA  Invitrogen 25200-056 warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers Precision Plastics Inc, CA Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes UCD electric shop platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box Substrate Engineering, CA custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 Fisher 12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 ThermoScientific 3307
Diamond point marker ThermoScientific 750
Marine grade silicon sealer, clear 3M 051135-08019
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
6 ml syringe Fisher Scientific 05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml Nichiryo SG-M
Cotton applicators Purtian Medical Products 806-WC
Qtips Johnson & Johnson 729389
Nalgene 180 PVC tubing  Nalgene 8000-9030 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar Difco 0140-01 make 2% agar solution
Razor Blade Personna 74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810R operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4 Nexcelom Auto T4
Cellometer counting chambers Nexcelom CHT4-SD100-002 load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate Bel-Art Scienceware 370150000 to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C 
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len Nikon
Retiga EX CCD camera  Qimaging Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2 Airgas special order
Volocity 6.3 PerkinElmer Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2 PerkinElmer Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0 FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2, (3), 661-669 (2007).
  2. Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14, (2), 184-190 (2013).
  3. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption. Dev Biol. 166, (2), 789-800 (1994).
  4. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development. 114, (4), 985-996 (1992).
  5. Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited. Biochem Biophys Res Commun. 431, (2), 280-283 (2013).
  6. Wood, M. D., Willits, R. K. Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements. J Neural Eng. 6, (4), 046003 (2009).
  7. Kucerova, R., et al. The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization. J Cell Physiol. 226, (6), 1544-1553 (2011).
  8. Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength. Exp Dermatol. 12, (4), 396-402 (2003).
  9. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23, (7), 560-568 (2013).
  10. Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds. J Cell Sci. 109, (1), 199-207 (1996).
  11. Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 70, (5), 667-673 (2000).
  12. Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112, (12), 1967-1978 (1999).
  13. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, (7), 1298-1304 (2011).
  14. Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp Neurol. 227, (1), 210-217 (2011).
  15. Wu, D., Ma, X., Lin, F. DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. Cell Biochem Biophys. 67, (3), 1115-1125 (2013).
  16. Martin-Granados, C., et al. A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells. PLoS One. 7, (7), 40769 (2012).
  17. Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes. J Cell Sci. 126, (9), 1942-1951 (2013).
  18. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, (7101), 457-460 (2006).
  19. Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium. J Cell Sci. 119, (22), 4741-4748 (2006).
  20. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (13), 2548-2558 (1996).
  21. Peng, H. B., Jaffe, L. F. Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields. Dev Biol. 53, (2), 277-284 (1976).
  22. Lee, M., et al. Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome. Int J Oncol. 4, (4), 821-830 (1994).
  23. Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines. Int J Oncol. 6, (2), 333-343 (1995).
  24. Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines. Genes Chromosomes Cancer. 30, (2), 143-160 (2001).
  25. Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium. Prostate. 67, (15), 1601-1613 (2007).
  26. Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85, (4), 590-599 (2001).
  27. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field. J Vis Exp. (68), (2012).
  28. Meng, X., et al. Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments. J Vis Exp. (60), (2012).
  29. Pullar, C. E., Isseroff, R. R. Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field. J Cell Sci. 118, (9), 2023-2034 (2005).
  30. Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules. J Invest Dermatol. 106, (4), 642-646 (1996).
  31. Feng, J. F., et al. Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field. Stem Cells. 30, (2), 349-355 (2012).
  32. Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. Microneedle array for measuring wound generated electric fields. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).
  33. Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing. Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).
Använda Skräddarsydda Galvanotaxis Chambers att studera Directional Migration av prostataceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).More

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter