Summary
Burada bir yanal bakış açısıyla Drosophila yetişkin ve larva mutant fenotip yüksek kaliteli dijital video elde etmek için basit ve yaygın olarak erişilebilir mikroskopi tekniği açıklar.
Abstract
Drosophila melanogaster sinir sistemi işlevini çalışmak için güçlü bir deneysel model sistem. Sinir sistemi işlev bozukluğuna yol açan gen mutasyonu genellikle Sadece varlığını sürdürebilmiş larvalara ve uygun bir metin ya da tamamen tarif tek bir fotoğrafik görüntü ile temsil zordur lokomosyon bozuk fenotiplere sahiptir yetişkin üretir. Bilimsel yayın mevcut modları, ancak, el yazması eşlik ek malzeme olarak dijital video medya sunulması destekler. Burada bir yanal açıdan hem Drosophila larva ve yetişkin fenotipleri yüksek kaliteli dijital video elde etmek için basit ve yaygın olarak erişilebilir mikroskopi tekniği açıklar. Sapkın lokomotif davranışları gözlem ve ince ayrımları ve varyasyonları analiz sağlar çünkü bir yan görünümden larva ve ergin lokomosyon Video avantajlıdır. Biz başarıyla görselleştirmek ve aberran ölçmek için tekniği kullandıkt tımar dahil yetişkin mutant fenotipleri ve davranışlar yanı sıra, üçüncü larva davranışları sürün.
Introduction
Yaygın meyve sineği Drosophila Melanogaster'in sinir sistemi 1-3 işlevi çalışmak için güçlü bir deneysel model sistem. Evrimsel yapısı ve insan ile sinir sistemi fonksiyonunun korunması, hem de genetik manipülasyon kolaylığı ve genetik araçlar geniş bir dizi Drosophila insan nörodejeneratif hastalıklar 4 modellemek için, ilk organizma sağlar. Sinir sistemi işlev bozukluğuna yol açan gen mutasyonu genellikle bozulmuş harekete karşı canlı mutant larva ve yetişkin Drosophila neden olur. Sinir sistemi bozuk mutantların hepsinde gözlenen fenotipleri lokomosyon, anormal koordinasyon ve erişkinlerde spastik hareketlerinin oranı yanı sıra, gövde duvarı arasında kas kasılması peristaltik eksikliği, ve larvaların kısmi felç azaltılmasıdır. Bu fenotipler yüksek verimli genetik ekranlar ve mutant larva 5 lokomosyon tahlillerinin geliştirilmesinde istismar edilmiş, Lokomosyon bozukluğu miktarının ve sinir sisteminin fonksiyonu için gerekli olan genleri tespit etmeyi amaçlayan 6 ve yetişkin 7-10 Drosophila. Bu yaklaşımlar larva ve ergin lokomotif davranışları ölçmek için son derece yararlı olmakla birlikte, her spesifik anormal davranışları hakkında nitel bilgi iletmek için başarısız. Mutant üçüncü instar larvası bir davranış tahlilinde, değiştirilmiş lokomosyon parametreleri sergileyebilir sırasında bu tarama döngüsü sırasında ritmik kasılmalar peristaltik değişimlerden koordinasyon genel eksikliği ya da arka gövde kısmi felç sonucudur, örneğin, belirsiz olabilir duvar kas. Burada bir yanal bakış açısıyla Drosophila yetişkin ve larva lokomotif fenotipleri yüksek kaliteli dijital video elde etmek için basit ve yaygın olarak erişilebilir mikroskopi tekniği açıklar. Lateral perspektiften alınan dijital video Locomotiv ince ayrımlar doğrudan gözlem ve analiz sağlarBir daha bilgilendirici yan görünüm oryantasyon e davranışlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stereo Mikroskop Sistemi
Not: Bu protokol kolayca video edinme yeteneği ile dijital kameraya bağlanmış neredeyse herhangi bir stereo mikroskop sistemi adapte olmasına rağmen, detayları (Malzeme / Ekipman Tablo) laboratuarımızda kullanılan sistemde sağlanmaktadır.
- Bir ticari dijital kameraya bağlanmış bir trinoküler stereo mikroskop kullanarak dijital video edinin.
- Çift stereo mikroskop trinoküler noktasına ticari dijital kamera için, stereo mikroskop phototube liman ½x C-montajı kaldırmak ve 1X C-montaj ile değiştirin.
- 1X C-mount dijital fotoğraf makinesi kuplörünü (43 mm diş) monte edin.
- Kamera kuplöre Dağı iki adım aşağı yüzük, 48 mm, 58 mm ve 43 mm 48 mm, dijital kamera için objektif adaptör kiti dijital kamera Kuplörün gelen bağlantıyı köprü.
- Objektif adaptör kiti dijital kamera monte edin.
- Yaklaşık 12X kombine büyütme (saniyede 30 kare, 640 x 480 piksel) için mikroskop büyütme ve dijital kamera setinin optik zoom ile video edinin. Not: Stereo mikroskop büyütme trinoküler limanın yeni yeniden 1X C-mount göre telafi edilmelidir.
2. Görüntüleme Drosophila Üçüncü Instar Larva
- Bant işaretleyici kapağın yan yaklaşık kaplayacak şekilde bir dijital kamera ile bağlanmış bir stereo mikroskop siyah aşaması plakasına kalıcı işaretleyici ⅓ kamera LCD gözlenen görüş alanının dikey ¼. Onlar renk kodu için kullanılan ve görüntülü larva genotipleri ayırt edilebilir renk bir ürün yelpazesine gelir çünkü larva görüntüleme gerçekleştirmek için aşama olarak işaretleyici üstleri kullanın.
- Ince bir nokta ile işaret üst yüzeyinde dijital kamera LCD gözlenen görüş alanını ayırır;işaretleyici.
- Görüntü bir Üçüncü dönem larva seçin. Üçüncü instar larvaları seçilmesi için kriter vücut uzunluğu, yaşam döngüsünün larva aşamasında, ön ve arka spiracles varlığı sırasında besin kaynağından ortaya çıkması ve ağız cihazının 11 çene kancalar yapı. Larva suda iyice yıkayarak temiz olduğundan emin olun.
- Bir fiber optik aydınlatma sistemi için ışık üstten kalıcı bir kalem üst sahnenin aydınlatılmasını. Optimal aydınlatma sağlamak için ışığın açısını ayarlayın.
- Kalıcı bir kalem üst kenarında Odak mikroskop. Dijital video edinme başlayın.
- Görüş alanında doğru bakan larva (Şekil 1) ön ile sadece görüş alanı dışında, yaklaşık 75 ° uzaklıkta dikey eksenden markör kapağın yan tarafında larva yerleştirin. Not: işaretleyici kapağın yan tarafında bulunan larva Yerleştirme th kayıt hareketine izin verir kamerayıBir yandan görünüşünü e larvası. Onlar işaretleyici kapağın yan düşmek yok bu yüzden su ile nemli larva tutmaya yardımcı olur. Bakım bu alanın karşısındaki süründüğü gibi aşırı miktarda larva uyacaktır gibi çok fazla su kullanmak değil, ancak olunmalıdır.
- Yavaşça kurcalamak ve görüş alanı üzerinde tarama için zorlamak için küçük bir fırça ile larva eşya. Larva nadiren işbirliği ve onlar düz alan üzerinde tarama önce genellikle başlangıç noktasına birçok kez iade edilmesi gereken sabırlı olun.
- Tutanak yaklaşık 10-15 kesintisiz dijital video görüntüleri ve mahsul dk ve dijital video düzenleme yazılımı ile tüm gereksiz görüntüleri alım sonrası kaldırın.
3. Görüntüleme Yetişkin Drosophila
- Bir tek 1.5 ml spektroskopik polistiren küvette bir tek yetişkin Drosophila yerleştirin.
Not: yetişkin Drosophila CO 2 anestezi hemen Behav önceHastada protokol analizleri sonuçları 12 bozabilir. Yetişkin Drosophila davranış testinde 13 gerçekleştirmeden önce CO 2 Anastetize kurtarmak için bir 24 saatlik dönem verilmesi önerilir. - Küçük bir pamuk ile küvetin ucunu. Pamuk büyük kap alanı işgal etmek yeterince sıkı doludur emin olun ve küvetin hacminde bölmeye sinek hapseder.
- Stereo bir mikroskop beyaz aşaması plaka küvet koyun ve dijital kamera LCD gözlenen görüş alanı ile küvetin hacminde bölmesi hizalayın.
- Bir fiber optik aydınlatma sistemi için ışık üstten küvet aydınlatır. Optimal aydınlatma sağlamak için ışığın açısını ayarlayın.
- Odak mikroskop ve dijital video edinme başlar.
- Tutanak yaklaşık 30-45 kesintisiz dijital video görüntüleri ve mahsul dk ve tüm gereksiz kaldırmakdijital video düzenleme yazılımı ile görüntüleri alım sonrası.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz başarıyla kazanmak ve stathmin genin fonksiyon kaybı (Şekil 2) 14 ile ilişkili larva davranışsal fenotip ölçmek için bu tekniği kullandık. Stathmin gen çözünür tübülinin havuzlarından Tübülin dimerlerini bölmeler bir mikrotübül düzenleyici proteini kodlar ve Mikrotübülleri bağlanır ve bunların sökme 15,16 teşvik etmektedir. Stathmin periferik sinirlerin fonksiyonu 14 aksonların mikrotübül bütünlüğünün muhafaza edilmesi gereklidir. Arka gövde segmentleri emekleme döngüsü sırasında kas kasılması, her peristaltik dalga sonra yukarı çevirmek hangi bir fenotip Drosophila üçüncü dönem larva sonuçlarında stathmin aktivitesinin bozulması. Bu posterior felç ya da 'kuyruk-flip fenotip kusurlu aksonal taşıma bir özelliğidir. Farklı yedi üçüncü instar larvaları posterior felç fenotipinin penetrasyonun ve şiddetini miktarı <em> yatay kuyruk üzerinde açıyı ölçerek mutant genotipler stathmin emekleme döngüsü (Tablo 1) sırasında büyüdü. Larvalar sergilenen eğer kuyruk kuyruk yatay yukarıdaki az 40 ° büyüdü eğer, hafif bir kuyruk kapağı tarama ve hiçbir kuyruk flip-yatay yukarıdaki fazla 40 ° büyüdü eğer larvalar sağlam bir kuyruk çevirme sergilemek belirlendi normal bir tarama davranışı.
Dijital kamera ile bir temel stereo mikroskop sistemi Şekil stereo mikroskop kullanarak bir yanal bakış açısıyla dijital video edinimi için kalıcı bir işaretleyici kap sahnede Üçüncü dönem larva 1. pozisyonu. Side-view trinoküler limanında monte edilmiş. Içerlek büyütme mikroskop aşamasında bantlanmış kalıcı marker yönünü ve konumunu göstermekte lateral açıdan anormal davranış dijital video edinimi için işaretleyici kapağı üzerindeki Üçüncü dönem larva. Görüntünün uzayın üç boyutları tayin edilir; x ekseni sürekli belirtecin uzunluğu boyunca uzanan ve mikroskop aşamasına paralel olup, y-ekseni, mikroskop aşamasının için x-eksenine paralel ve dik olan ve z-ekseni için işaretleyici kapağından dikeydir objektif lens ve mikroskop aşamasında dik. Üçüncü evre larva alanına doğru bakan ön larva ile sadece dijital kameranın görüş alanı dışında, yaklaşık 75 ° uzaklıkta y-eksenine doğru dikey z ekseni ikinci işaretleyici başlığın tarafına yerleştirilmiştir bakış. Markör kapağın yan tarafında bulunan larva yerleştirilmesi stereo mikroskop dijital kamera, bir yanal açıdan alanın karşısındaki larva hareketi kaydetmek için izin verir.
ftp_upload / 51981 / 51981fig2highres.jpg "/>
Şekil temsilcisi sonuçları 2. görüntüleri. Drosophila larva (A, B) ve yetişkin dijital video Temsilcisi görüntüleri (C, D) fenotipleri ve davranışları bir yanal bakış açısıyla satın aldı. Her resim bir video halen edinilmiş dijital video dosyaları elde karedir. (A) Yabani türde Üçüncü dönem larva sergi düz bir vücut duruşu maddesi boyunca tararken. (B) stathmin gen sergi anormal bir emekleme bir mutasyon Üçüncü evre larva homozigottur arka kaslarının bir felç göstergesidir kuyruk flip-davranış,. (C) vahşi tip yetişkin Drosophila kanatları sinek yürür gibi. (D) Yetişkin Drosophila, bilinmeyen bir mutasyon için homozigot, kanatlarını tutun vücuda göre düz tutulur normalin üzerinde yaklaşık 45 ° açıları. Anormal larva ve yetişkin fenotip hem deaçıklanan en iyi gözlenen bir yan yan görünüm açısından kazanılmış dijital video ile tebliğ vardır. Ölçek çubuğu = 1 mm Panel A ve B. Bu rakam Duncan ve arkadaşları modifiye edilmiştir., 2013.
| Arka Felç Fenotipinin Önem | ||||
| Genotip | n | Hayır Kuyruk-Flip | Hafif Kuyruk-Flip (<40 °) | Sağlam Kuyruk-Flip (> 40 °) |
| Yabanitip | 150 | % 100,0 (N = 150) | 0.0% (N = 0), | 0.0% (N = 0), |
| stai B200 / + | 130 | % 100,0 (N = 130) | 0.0% (N = 0), | 0.0% (N = 0), |
| stai rdtp / + | 140 | % 100,0 (N = 140) | 0.0% (N =) | 0.0% (N = 0), |
| Df (2 L) Exel6015 / + | 120 | % 100,0 (N = 120), | 0.0% (N = 0), | 0.0% (N = 0), |
| stai B200 | 120 | % 23.3 (N = 28) | % 23.3 (N = 28) | 53.4% (N = 64) |
| stai B200 / Df (2L) Exel6015 | 101 | % 10.9 (N = 11) | % 21.8 (N = 22) | 67.3% (N = 68) |
| stai rdtp | 125 | % 16.0 (N = 20) | 32.0% (N = 40) | % 52.0 (N = 65) |
| SSKÖ rdtp / DF (2 L) Exel6015 | 140 | % 7.7 (N = 11) | % 23,7 (N = 33) | % 68.6 (N = 96) |
Tablo 1. Penetrans ve şiddeti(DSKÖ) mutant, Drosophila üçüncü instar larvaları stathmin görülen felç fenotip posterior. mutan, Drosophila üçüncü instar larvaları stathmin arka felç fenotipinin penetrasyonun ve ciddiyetini attı ve bir yanal açısından davranış ve dijital video elde açısının ölçülmesiyle nicelleştirilmiştir kuyruk emekleme döngüsü sırasında, yatay tarama düzlemi üzerinde büyüdü ki. Larva kuyruk en az 40 °, yatay düzlemin üzerinde yükseltilir eğer kuyruk yatay düzlemde ve hafif bir kuyruk kapak üzerinde daha büyük 40 ° yükseltilmiştir ise sağlam bir kuyruk kapağı sahip olarak skorlandı. Normal bir tarama davranışı sergileyen Larva hiç kuyruk-Flip sahip olarak değerlendirildi. En az yüz larva tarama davranışı test edilen her bir genotip için analiz edildi. Bu tablo, Duncan ve al modifiye edilmiştir., 2013.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinir sistemi işlevini incelemek için bir model sistem olarak Drosophila melanogaster 'in gücü, büyük ölçüde mevcut güçlü genetik araçları yakınsama ve geliştirilen güçlü davranışsal testlerin geniş bir dizi kaynaklanmaktadır. Burada bir yanal bakış açısıyla Drosophila yetişkin ve larva lokomotif fenotipleri yüksek kaliteli dijital video elde etmek için basit ve yaygın olarak erişilebilir mikroskopi tekniğini sunuyoruz. Başarıyla tanımlama ve posterior felç şiddetini ölçmek için bu yaklaşımın kullanıldığı kuyruğu-flip doğrudan kuyruk tarama döngüsü 14 boyunca yatay ekseninden oluşturulması nedeniyle bu yüksek açısının ölçülmesiyle nörolojik üçüncü safha larva mutantların hepsinde gözlenen fenotipleri. Burada yer alan yaklaşımın faydası Video anormal lokomotif davranışı doğrudan gözlem ve analizler sağlayan yanal bir perspektif elde edilmektedir, yani, genellikle nörolojik larva ve gözlenenDult mutantlar, bir daha bilgilendirici 'yan görünümü' yönelimden. Sonuç olarak, larva Drosophila'da peristaltik kas kasılmaları, ve yetişkin Drosophila anormal yürüyüş fenotip görselleştirme daha kolay gözlenir ve analiz edilir. Bu tekniğin bir sınırlama, bir yüksek verimli bir yaklaşım değildir olmasıdır. Buna ek olarak, belirli bir Drosophila larva ve yetişkin davranışları nedeniyle sadece stereo bir mikroskop görüş alanının elde kısıtlayıcı izleme alanına kısa zaman süreleri için analiz edilebilir. Küvet bölmesinin hacmi stereo mikroskop görüş alanında önemli ölçüde daha büyük olduğu için, yetişkin Drosophila davranışların bir video satın Bu özellikle sorun yaratabilir. Biz küvet haznesi hacmi en aza indirmek ve yetişkin hareketi görüş alanı içinde yer alan bir boşluk uçmak kısıtlamak için pamuk ve karton ekler kullanarak bu sorunu ele alınmıştır. Ise bizim im çoğunluğuyaşlanma nörolojik larva mutantlar odaklanmıştır, biz de tekniği kolayca gibi kur, çiftleşme, ve saldırganlık gibi diğer Drosophila davranışların analizi kapsayacak şekilde genişletildi olabilir düşündüren, tımar dahil yetişkin mutant fenotipleri ve davranışlarını gözlemlemek için tekniği kullandık. Bu teknik, diğer Drosophilidae aile üyelerinin yanı sıra, benzer büyüklükteki diğer böcekler görüntülenmesi için yararlı olabileceğini mümkündür. Buna ek olarak, tekniğin daha küçük bir modifikasyonu böcek türlerine görüntülenmesine olanak sağlamak olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var olduğunu beyan etmişlerdir.
Acknowledgments
Yazarlar Video anlatım sağlamak için teknik yardım ve destek, James Barton için Alexandra Opie'yi kabul etmek istiyoruz ve beraberindeki video görünmesi için Ramona Flatz ve Joellen Sweeney. Bu çalışma MJ Murdock Charitable Trust (JED Hibe No 2012205) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43 mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58 mm to 48 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48 mm to 43 mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
References
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , Taylor & Francis Group. (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L. The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers. Curr Opin Cell Biol. 14, 18-24 (2002).
