Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تحريض حذف البروتين من خلال Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/51983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

Abstract

حذف الوراثي باستخدام نظام جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن في خطوط الماوس المعدلة وراثيا هو أداة قوية تستخدم لدراسة وظيفة البروتين. ومع ذلك، إلا في نماذج محددة للغاية لجنة المساواة العرقية، الحذف من البروتين طوال السكان الأنسجة أو الخلايا غالبا ما يؤدي إلى الظواهر المعقدة الناجمة عن آليات التفاعل متعددة. تحديد ما إذا كانت النتائج النمط الظاهري من تعطل آلية مستقلة خلية، وهو جوهري إلى الخلية في السؤال، أو من آلية مستقلة غير الخلية، التي من شأنها أن تنجم عن ضعف البيئة تلك الخلية، ويمكن أن يكون من الصعب تمييز. للحصول على نظرة ثاقبة وظيفة البروتين في سياق في الجسم الحي، في الرحم Electroporation لل(IUE) يتيح حذف الجينات في مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا داخل القشرة تطوير أو بعض منطقة في الدماغ مختارة أخرى. يمكن أن تستخدم IUE لاستهداف مناطق محددة في الدماغ، بما في ذلك الدماغ الانتهائي الظهرية، الدماغ الانتهائي وسطي، الحصين، أو البارزة العقدية. وهذا يسهل س الملاحظةو عواقب خلية مستقلة حذف الجينات في سياق بيئة صحية. والهدف من هذا البروتوكول هو لاظهار كيف يمكن استخدام IUE لتحليل وجود خلل في الهجرة شعاعي في خط الماوس المعدلة وراثيا floxed، مع التأكيد على التمييز بين الخلية آثار الحكم الذاتي مستقلة وغير خلية من البروتين الحذف. بمقارنة النمط الظاهري الناتج عن حذف الجينات داخل القشرة بأكملها مقابل IUE بوساطة حذف الجينات في خلية السكان محدود، مزيد من التبصر في وظيفة البروتين في نمو الدماغ ويمكن الحصول من استخدام إما تقنية في عزلة.

Introduction

الهجرة الشعاعية هي عملية مركزية في التنمية القشرية في وقت مبكر. ذلك يعتمد على مجموعة متنوعة من العوامل خلية مستقلة، مثل الصحيح للخروج الإنقسامية وتمايز الخلايا العصبية، الخلايا القطبية، وتنظيم ديناميات هيكل الخلية والتعبير عن مستقبلات عبر الغشاء، فضلا عن عدم خلية العوامل المستقلة، مثل تشكيل سقالة الدبقية شعاعي و إفراز التوجيه المهاجرة جزيئات 1-3. منذ تعطل أي من هذه الآليات يمكن أن يعوق هجرة الخلايا العصبية في نموذج الفأر المعدلة وراثيا 4-8، وتحديد السبب الكامن وراء وجود خلل في الهجرة يمكن أن يكون عملية معقدة وصعبة. في الرحم Electroporation لل(IUE) يمكن استخدامها لاستكمال وتبسيط تفسير النمط الظاهري من نموذج الجيني خروج المغلوب، وبالتالي توضيح الآليات الهامة المطلوبة للهجرة شعاعي 7،9-11.

في الرحم Electroporation لل(IUE) هو العملية التي من carryi بلازميد نانوغرام كل من الجينات في المصالح ومراسل يتم ضخها في البطين في دماغ فأر أو جرذ الجنين ومن ثم رسمها في الخلايا المبطنة للبطين من خلال استخدام تيار كهربائي 12-14. وهذا يسمح للمحقق لتحليل تأثير أعلى أو لأسفل التنظيم من الجينات في المصالح في التنمية أو وظيفة الخلايا العصبية electroporated. وبعد IUE، والعقول يمكن معالجتها لالمناعية 7،9-11، الكهربية 15 أو خلية الثقافة 16،17. والميزة الرئيسية لIUE هي التي تسمح للتلاعب محددة للغاية في التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم IUE لاستهداف منطقة محددة من الدماغ النامية من خلال توجه الحالي (الشكل 2). ويمكن أيضا أن تستخدم IUE لاستهداف نوع خلية معينة من خلال حقن البلازميدات تحمل الجينات تحت سيطرة المروجين مختلف أو الأنظمة تفعيل بلازميد (التتراسيكلين الناجم عن التعبير الجيني هو مثال) 10،18-21.

jove_content "> IUE يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن الجينات بوساطة نظام الختان 7-9،11،22. يمكن electroporated البلازميد التي تحتوي على الجين ترميز الرسالة للبروتين لجنة المساواة العرقية إلى متماثلة اللواقح الجنين لأليل floxed ( التي يتم يحيط المناطق الجينات أو الحمض النووي محددة من قبل اثنين من المواقع loxP لجنة المساواة العرقية بوساطة إعادة التركيب DNA). سوف لجنة المساواة العرقية ثم لحث على إعادة التركيب من الجينات في المصالح وتحديدا في السلائف العصبية electroporated، وتوليد الضربة القاضية للخروج من floxed allele.The تأثير البروتين ضربة قاضية على الهجرة العصبية والتنمية داخل الخلايا العصبية الفردية يمكن بعد ذلك درس. Electroporation للمن لجنة المساواة العرقية يدفع إعادة التركيب إلا في عدد صغير من السكان خلايا المصابة، وترك البيئة الداعمة سليمة. في المقابل، التعبير أنسجة معينة من لجنة المساواة العرقية تحت السيطرة من نوع خلية معينة المروج، يحدث في جميع أنحاء الأنسجة كامل بحيث أن كلا neuroblasts المهاجرة والبيئة المحيطة يمكن أن تتأثر. وهكذا، juxtaposition من هذين النهجين يمكن تحديد ما إذا كان هو عيب الهجرة نظرا يرجع إلى الخلية آليات غير المتمتعة بالحكم الذاتي أو الحكم الذاتي الخلية. الهجرة المعيبة في كل من النظم التجريبية تشير إلى أن النتائج النمط الظاهري المرصودة من آلية خلية مستقلة. الهجرة العادية التالية Electroporation للمن لجنة المساواة العرقية مع الهجرة المعيبة في نموذج محدد لجنة المساواة العرقية الأنسجة تشير إلى أن الجينات في المصالح يتصرف من خلال آلية غير خلية مستقلة.

ويمكن أيضا أن تستخدم لIUE إجراء تجارب الانقاذ electroporating الجينات تتفاعل المحتملة في ضرب الحيوانات 7،9،10. على سبيل المثال، يمكن أن محقق محاولة لانقاذ النمط الظاهري الهجرة في نموذج المعدلة وراثيا التي كتبها electroporating هدفا المصب وتحديد ما إذا كان يتم تصحيح الخلل الهجرة في الخلايا العصبية electroporated. وهذا له فائدة إضافية أن انقاذ ناجحة يشير إلى أن الهجرة العادية يمكن استعادة عن طريق التلاعب البروتين التعبير في جمعية مهندسي البترولمحدَّدة الخلايا العصبية، على الرغم من أن البيئة المحيطة لا تزال قاصرة عن الجينات المستهدفة. مرة أخرى، وهذا النهج هو المزيد من الوقت وفعالة من حيث التكلفة من عبور أو توليد خطوط المعدلة وراثيا، مع فائدة إضافية تتمثل في تحديد ما إذا كانت آلية المعيبة هي خلية مستقلة.

IUE يمكن استخدامها لتتبع هجرة الخلايا العصبية من خلال Electroporation للمن البلازميد مراسل في ضرب الأجنة (الشكل 4C). كما فقط الخلايا العصبية تبطن البطين في وقت الجراحة وelectroporated 17، IUE يمكن استخدامها لتتبع الخلايا العصبية ولدوا في وقت محدد مع الاستفادة من التصور من التشكل في الجسم الحي.

وأخيرا، فمن الممكن استخدام IUE لاستهداف مناطق الدماغ مثل الدماغ الانتهائي وسطي أو الظهرية، الحصين أو البارزة العقدية (الشكل 2). وهذا يعطي الباحثين القدرة على تحقيق وظيفة الجين في منطقة مستقلة محدد من مضاعفات نتائج لجي من البروتين ضربة قاضية في الهياكل المجاورة.

البروتين الشبكية (PRB)، P107 P130 وتتكون الأسرة من البروتين جيب وراسخة المنظمين للدورة الخلية الخروج. ومع ذلك، هناك أدلة متزايدة على أن هذه البروتينات أيضا تنظيم دورة الخلية جوانب مستقلة من التطور العصبي. كما بينا سابقا، وPRB P107 تلعب دورا حاسما في كل من عرضية 4،23 والهجرة شعاعي 6. هنا، علينا أن نظهر دور البروتين جيب أفراد الأسرة PRB وP107 على الهجرة العصبية 6 لتجسيد استخدام في الرحم Electroporation للمن لجنة المساواة العرقية في نموذج المعدلة وراثيا. وباختصار، IUE يوفر وسيلة قوية لتحليل الخلايا آثار الحكم الذاتي في حذف الجينات (أو overexpression). عندما جنبا إلى جنب مع أنسجة محددة ضرب النماذج، يمكن IUE تقديم معلومات إضافية بشأن آليات السيطرة على الهجرة العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل جامعة لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان أوتاوا، والتمسك بالمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان.

1. إعداد ما قبل العمليات الجراحية والمواد

  1. إعداد البلازميد:
    1. إعداد البلازميدات باستخدام QIAGEN MegaPrep وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تحصين لا يقل عن 400 مل من مرق LB مع البكتيريا تتحول لضمان العائد DNA عالية واحتضان بين عشية وضحاها.
    2. في resuspend بلازميد في 100-200 ميكرولتر TE إلى التركيز النهائي لا يقل عن 5 ميكروغرام / ميكرولتر. DNA قسامة وتخزينها في -20 ° C. إذا كان تركيز منخفض جدا، لا يعجل و resuspend لأن هذا يمكن أن تضيف الشوائب. البدء من جديد مع إعداد جديد.
    3. قبل الجراحة، وتمييع البلازميد واحد (لجنة المساواة العرقية-GFP على سبيل المثال) إلى 2 ميكروغرام / ميكرولتر في الماء المعقم مع 1 ميكرولتر من 0.1٪ (ث / ت) صبغ الأخضر سريع في 10 أو 20 ميكرولتر من الحل البلازميد المخفف. إذا GFPوهذا الجين من الفائدة من المقرر أن يشارك electroporated على البلازميدات منفصلة، ​​حقن البلازميد GFP البلازميد والتي تحمل الجينات في المصالح بنسبة 1: 4 لتحقيق أقصى قدر من احتمال أن جميع الخلايا التي تحمل علامة GFP وشارك في electroporated مع كل من البلازميدات.
  2. سحب أنابيب زجاجية microcapillary (1 مم القطر الخارجي - المشار إليه فيما الإبر) على مجتذب إبرة القياسية، وذلك باستخدام خطوة سحب واحد في 62 ° C.
  3. الأوتوكلاف حزمة الجراحية التي تحتوي على ما يلي: أصحاب الإبرة، ضام الجروح، ملقط، مقص لإجراء عملية جراحية، ومقص لالإبر، دباسة، والدبابيس، والشاش، ويغطي الجرح، والستائر الجراحية (الشكل 1A، B؛ المواد الجدول).
  4. اجمع أخرى الأدوات المطلوبة: Electroporator، Femtojet Microinjecter، Tweezertrodes (5 أو 7 ملم)، المالحة، خياطة، 5 مل حقنة (مواد الجدول).

2. إعداد الماوس لجراحة

  1. لإدارة الألم، وحقن ف توقيت الماوس النهج السائد مع البوبرينورفين (0.05 ملغ / كغ من وزن الجسم) ساعة واحدة قبل الجراحة. تطبيق هذا البروتوكول على الفئران توقيت في أي مكان من يوم الجنينية 12.5 (E12.5) لE17.5.
  2. استخدام نصائح ماصة microloader لدعم الحمل سحب الإبر مع الحل البلازميد. لا تملأ كل الطريق إلى غيض من الإبرة حتى الان وهذا سوف يسبب الإبرة إلى انسداد.
  3. تخدير الماوس باستخدام 2-5٪ الأيزوفلورين الغاز مع 1 لتر / دقيقة O 2. مرة واحدة قادرة على الحركة، ضع في قناع الوجه وتطبيق مرهم للعين لمنع جفاف. حقن مع 1 مل المالحة (0.9٪ كلوريد الصوديوم) تحت الجلد في الظهر.
    ملاحظة: عند العمل مع الغاز الأيزوفلورين، واستخدام زبال الغاز لاستعادة الغاز الزائد ومنعه من الهروب إلى الغرفة.
  4. حلق البطن. يغسل البطن مع Chlorohexadine فرك، وشطف مع الماء، وتطبيق حل الإعدادية النهائي من chlorohexadine و 70٪ من الإيثانول. غطاء الماوس مع ثنى العقيمة أو الشاش لتغطية الفراء لكنها لن يتعرض البطن (الشكل 1C، D).

الصورة = "jove_title"> 3. في الرحم Electroporation لل

  1. إجراء شق في الجلد فوق البطن بين أقل الحلمات. سحب الجلد بعيدا عن طبقة العضلات الأساسية التي تمزق النسيج الضام، ثم قطع طريق الغشاء البريتوني في تجويف البطن على طول الخط ألبا. أدخل ضام الجرح لسحب حواف الجرح على حدة.
  2. إزالة الرحم من تجويف البطن ويكمن ذلك كما هو مبين (الشكل 1E).
    1. إذا الجراء المختلفة ليتم حقنه مع البلازميدات مختلفة (مثل GFP مقابل GFP مع الجينات في المصالح)، عد الجراء على كل جانب والتي تقرر تلك وكم لحقن مع كل البلازميد. استبدال جانب واحد من الرحم مرة أخرى في البطن للحفاظ على الأجنة دافئة ومشحم. بلل فورا الرحم تتعرض بمحلول ملحي (يفضل تحسنت إلى درجة حرارة الجسم).
    2. إذا حقن جميع الجراء مع نفس بلازميد (مثل عند حقن لجنة المساواة العرقية-GFP في الأجنة وراثيا) فقط. tذ إزالة قرن واحد الرحم في وقت واحد.
  3. وضع إبرة تحميلها في رأسه قبضة عصا الحقن وبعناية قطع رأس مع زوج من مقص جراحي صغيرة أو ملقط غرامة. قطع رأس الإبرة حتى يبقى ممكن طالما حين لا يزال يسمح بالمرور عبر السائل (الشكل 1Ji-IV).
    1. ضبط طول حقن (في ثواني) وضغط الحقن على microinjector بحيث تظهر قطرات بعد مرئية بسهولة صغيرة من 0.1-0.2 ميكرولتر على رأس الإبرة عند الضغط على مجداف القدم. الحفاظ على حجم هذه القطيرات متسقة قدر الإمكان بين الإبر مختلفة.
      ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لبقاء الجنين (انظر المناقشة).
    2. استخدام المعلمات حقن التالية لFemtojet: حقن الضغط (بي) = 250-300 هكتوبسكال. الوقت الحقن (TI) = 0،8-1،2 ثانية؛ تعويض الضغط = 10-50 هكتوبسكال. إذا لزم الأمر، وضبط هذه المعلمات لاستيعاب الاختلاف بين الإبر.
  4. Sانتخاب الجنين ووضع برفق على ظهرها، إمالة الرأس إلى أعلى (الشكل 1F).
    ملاحظة: قد يتطلب هذا التحول أو الانتقال الجنين. يجب الحرص على عدم تطبيق الكثير من الضغوط وتجنب تمزق الكيس الذي يحيط بالجنين في حين التلاعب في الجنين.
  5. وبمجرد أن الجنين هو في مكان، حدد موقع البطين، الذي يعرض على أنه شكل هلال الظل بالتوازي مع الجيب السهمي. لمس رأس الإبرة إلى الرحم فوق البطين في زاوية طفيف وتوجيه الإبرة من خلال جدار الرحم. مقدار الضغط المطلوب يعتمد على حدة من الإبرة. دفع الإبرة من خلال القشرة إلى البطين.
    ملاحظة: على الرغم من أن هناك نادرا أي مقاومة للكشف إضافية، غالبا ما يتم دفع رأس الجنين بعيدا قليلا ثم ينتفض كما تمر الإبرة من خلال القشرة إلى البطين.
  6. ضخ مجداف القدم لحقن الحل البلازميد. الاستمرار في ضخ حتى منطقة خضراء مرئيا ويتفق معشكل قوس من البطين (الشكل 1G). في الأجنة الشباب (E12.5 لE14.5) سوف الصبغة غالبا منتشر في البطين المقابل.
    ملاحظة: يعتمد عدد من المضخات على قطر طرف الإبرة، وعمر الجنين (وما ينتج عنها من حجم البطين) وحجم الحقن المطلوب. إبقاء حجم حقن ثابت قدر الإمكان بين الأجنة.
  7. حقن ثلاثة أو أربعة أجنة. منع جميع الأجنة تتعرض رطبة مع المياه المالحة طوال الإجراء.
  8. العودة الى الأجنة الأولى حقن ووضع المجاذيف مثل أن القطب الموجب ورسم البلازميد إلى المنطقة المطلوب من الدماغ (الشكل 1H). زاوية القطب السالب بحيث أقصر مسار بين الأقطاب يمر مباشرة من خلال الهيكل المستهدف ل electroporation (الشكل 2).
  9. مرة واحدة المجاذيف في مكانها الصحيح، وتطبيق الصدمة. حسب عمر وحجم الأجنة، استخدم 5 نبضات من 35-50 V (انظر T1 قادرة). استخدام المعلمات التالية electroporation: طول النبض من 5 ميللي ثانية مع فاصل زمني نبض 950 ميللي ثانية. كرر مع جميع الأجنة المحقونة.
  10. قطع رأس إبرة قبل تحميلها جديدة كما في الخطوة 3.3 كما الإبرة مشاركة المرجح المجففة وانسداد خلال خطوة 3.9. حقن المجموعة التالية من ثلاثة أو أربعة أجنة سواء مع نفسه أو البلازميد البلازميد مختلفة ومن ثم تطبيق صدمة كما في الخطوة 3.9. عندما يتم حقن جميع الجراء في جانب واحد من الرحم، وإزالة الجانب الثاني من الرحم من البطن الأنثى ثم قم باستبدال الجانب الانتهاء لإبقائه دافئا.
  11. العودة جانبي الرحم للإناث والحرص على الحفاظ على سطح رطبة مع المياه المالحة وعدم تطبيق الكثير من الضغوط لمنع الصدمة إلى الحويصلات الذي يحيط بالجنين. خياطة طبقة العضلات مغلقة باستخدام غرزة المستمر بسيط. التيلة إغلاق الجلد. إذا السلع الاساسية غير متوفرة، خياطة الجلد مع غرزة انقطاع بسيط. (الشكل 1I)
  12. في حين suturiنانوغرام، بدوره تدريجيا إلى أسفل الأيزوفلورين للسماح التخدير الأنثى الحامل لتفتيح.
    ملاحظة: هذا وسوف التعجيل الإثارة من السد بعد اكتمال عملية جراحية. حفظ الأنثى تخدير لفترة قصيرة قدر الإمكان من شأنها تحسين بقاء الجنين. إجمالي وقت الجراحة، بدءا من عند مخدرة أولا الأنثى، يجب أن يكون حوالي 30 دقيقة.

4. الرعاية اللاحقة

  1. وضع الأنثى خياطة في حاضنة أو على وسادة التدفئة للتعافي من التخدير. سريرها على فراش نظيف ووضع جل انتعاش قياسي في القفص الحفاظ على الترطيب. لإدارة الألم بعد الجراحة، وإعطاء ثلاث جرعات من الإناث البوبرينورفين (0.05 ملغ / كغ من وزن الجسم) في 8 فترات ساعة بعد الجراحة، ثم أربع جرعات إضافية في 12 فترات ساعة.

5. العقول حصاد

يمكن حصاده العقل في أي سن تصل إلى مرحلة البلوغ: ملاحظة. ينطبق ما يليلجمع العقول قبل الولادة. لاحظ أنه بمجرد ولدت الجراء، يتم فقدان النظام داخل الرحم، لذلك يجب أن يتم حقن إما كل الجرو في القمامة مع نفس البلازميد، أو طريقة أخرى من التمييز بين السيطرة وحيوانات التجارب يجب أن توضع.

  1. إعداد الباردة (4 ° C) وتصفيتها 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) قبل القتل الرحيم الإناث.
  2. الموت ببطء الأنثى باستخدام حقنة داخل الصفاق من جرعة قاتلة من بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغ / كغ من وزن الجسم)، وقطع البطن المفتوح. سحب جانبي الرحم ووضع كما هو الحال عندما تم حقن الجراء في البداية.
    1. في حالة حيث تلقت كل الجراء نفس البلازميد، مثل عند حقن لجنة المساواة العرقية في القمامة المعدلة وراثيا والنظام الجنين ليس مهما، وبالتالي قطع الرحم من الأنثى ومكان في برنامج تلفزيوني.
    2. إذا تم حقن الجراء مع البلازميدات مختلفة، تأكد من تحديد موقع كل الجرو، مشيرة إلى أي الجراء الميتة، وتحديد تلك التي حقنوا السيطرة والتجربهالبلازميدات التل قبل إزالة الرحم من الإناث. كن حذرا لتتبع التي الجرو ينتمي إلى المجموعة التي بعد الرحم في برنامج تلفزيوني.
  3. إزالة كل الجرو بشكل فردي، وقطع رأس مع مقص حاد أو شفرة حلاقة ووضع الرأس في برنامج تلفزيوني. في حالة الفئران المعدلة وراثيا، وجمع عينات الأنسجة لالتنميط الجيني والحفاظ على كل رأس منفصلة، ​​كما هو الحال في لوحة 12-جيدا.
  4. تحت نطاق تشريح، وإزالة الدماغ من الجمجمة، والحرص على عدم شق القشرة أو المسيل للدموع خط الوسط. باستخدام مجهر فلوري، تحقق لمعرفة ما إذا كان لديها أدمغة GFP + التصحيح، مشيرا إلى أنهم كانوا electroporated بنجاح.
  5. إصلاح العقول عن طريق الغمر في PFA في 4 درجات مئوية خلال الليل.
    ملاحظة: تحقق العقول للتعبير عن GFP قبل التثبيت منذ PFA غالبا ما يروي الإشارة.
  6. أدمغة Cryoprotect من خلال الانغماس في 20٪ سكروز لمدة ثلاثة أيام على الأقل قبل التجميد. استخدام التدرج السكروز بنسبة 10٪ و 15٪ و 20٪ (24 ساعة في كل حل) رس منع تلف الأنسجة بسبب الضغط الاسموزي. تخزين العقول المجمدة في -80 ° C وقطع على ناظم البرد في 10-14 ميكرون أبواب سميكة.

6. التعاون مع تلطيخ مكافحة GFP

ملاحظة: إذا استرجاع مستضد هو ضروري من أجل أن تشارك في وصمة عار مع مكافحة GFP، فمن المهم استخدام لطيف مستضد بروتوكول استرجاع الذي لا يضر إشارة GFP. بعض البروتوكولات استرجاع مستضد قاسية جدا لاستخدام بالتزامن مع GFP تلطيخ (حتى مع وجود الأجسام المضادة ضد GFP). وحمض الستريك الأساسي المعالجة المسبقة قبل تطبيق الأجسام المضادة الأولية ناجحة لمعظم الحواتم 24.

  1. جعل 0.01 M محلول حامض الستريك في DDH 2 O. الرقم الهيدروجيني إلى 6 باستخدام الرقم الهيدروجيني متر معايرة.
  2. الحرارة حامض الستريك في غرفة تلطيخ في الميكروويف أو حمام مائي حتى الأحماض الليمون يصل 75-80 ° C. وضع الشرائح في غرفة تلطيخ لمدة 10-15 دقيقة. الحفاظ على درجة حرارة مستقرة ممكن.
  3. غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني3X لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تطبيق الأجسام المضادة الأولية والمضي قدما المناعية وفقا لبروتوكول قياسي.
  4. تحقق لجنة المساواة العرقية الختان بوساطة شارك في وضع العلامات لGFP والجينات في المصالح لتأكيد نهدم (الشكل 3A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اثنين من التحديات الرئيسية في أداء في electroporations الرحم هي 1) منع الفتك الجنين و2) تقليل التباين بين electroporations. واحدة من أهم العوامل في منع الفتك هو نوعية الإبرة، والإبر غير حادة تلحق المزيد من الضرر للجنين. عندما قطع الإبرة، والحفاظ على طرف لأطول فترة ممكنة في حين لا يزال يسمح بقطرة واضحة من 0.1-0.2 ميكرولتر من السوائل لتظهر بعد المضخة من مجداف القدم (الشكل 1J). إذا كانت إبرة مملة جدا أو رمح قصيرة جدا، يمكن أن تلف الأنسجة الناتجة يقتل الجنين. وعلى العكس، إذا كان رأس الإبرة على ما يرام أيضا، وسوف يستغرق وقتا طويلا لحقن حجم البلازميد كافية. ترك إبرة في الدماغ لفترة طويلة من الضرر الأسباب بسبب الاهتزازات التي لا يمكن تجنبها من أيدي المحقق وتناوب طفيفة للجنين. وعلاوة على ذلك، استخدم microbeveler لجعل الإبر مع حادة، نصائح مشطوف للسماح الحقن في أصغر سناوالأجنة أكثر هشاشة، على الرغم من أن هذا لا ينبغي أن يكون من الضروري للأجنة E13.5 وكبار السن.

مستوى الإجهاد من الإناث الحوامل هو عامل رئيسي آخر يؤثر على بقاء الجنين. ارتفاع مستوى الإجهاد السد، والأرجح أنها سوف يجهض القمامة. لهذا السبب من المهم لتقليل الوقت التخدير وتغيير السكن بأقل قدر ممكن قبل وبعد الجراحة. يمكن للإجهاد الخلفية أيضا تؤثر على مستوى الإجهاد، وأنه قد يكون من الضروري المستعمرات تهجين عرضة للقلق على سلالة مثل CD1، على افتراض أن النمط الظاهري قيد التحقيق يتم الحفاظ على سلالات عبر خلفية مختلفة.

أكبر القيد واحد لIUE هو التنوع الكامن بين electroporations. كل الدماغ electroporated مختلفة بسبب الاختلافات في حجم الحقن، والتنسيب مجداف، مجداف الاتصال وعمر الجنين. منذ الإبر هي المتغير، فإنه من غير الممكن لحقن حجم ثابت - بدلا من التحرياتيجب tigator تقريب حجم التصحيح الأخضر لتقديم مبالغ مماثلة لجميع الأجنة. وبالمثل، لأن الجنين يتحرك في السوائل تملأ الكيس، فإنه ليس من الممكن قياس منهجي الموقع والتوجه من المجاذيف على رأس الجنين، كما هو الحال لحقن المجسم. وأخيرا، يمكن للاختلافات طفيفة في سن الجنينية لها آثار كبيرة على النتائج التجريبية. لهذا السبب، يوصى المقارنة بين تتزاحم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Square Wave Electroporator BTX Harvard Apparatus 45-0052 Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830 BTX Harvard Apparatus 45-0211 Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm) Platinum forcep style electrodes
Femtojet Eppendorf 920010504 Microinjector
Griphead 0 Eppendorf 920007414 Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder Eppendorf 920007392 Connects griphead to tube
Injection Tube Eppendorf 920007431 Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control Eppendorf 920005098 Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit Qiagen 12181 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252-5G Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors Fine Science Tools 14084-09
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10 Straight
Colibri Retractors Fine Science Tools 17000-03
Stapler Fine Science Tools 12031-07 For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder Medical Tools SNH-6737 Straight, with lock
Needle Puller Narishige PC-10 For pulling microcappillaries
Microcapillaries Drummond 1-000-800 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
  2. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).
  3. Wu, Q., et al. The dynamics of neuronal migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).
  4. McClellan, K. A., et al. Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions. Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).
  5. Nguyen, L., et al. P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex. Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).
  6. Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis. Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).
  7. Hashimoto-Torii, K., et al. Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex. Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).
  8. Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse. Neural Dev. 6, (2011).
  9. Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors. J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).
  10. Heng, J. I., et al. Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2. Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).
  11. Alfano, C., et al. COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression. Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).
  12. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
  13. Dixit, R., et al. Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  14. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  15. Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).
  16. Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro. Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).
  17. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J. Vis. Exp. (44), (2010).
  18. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  19. Miyagi, S., et al. The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells. Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.
  20. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).
  22. Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. targeting in mice: a review. Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).
  23. Ferguson, K. L., et al. A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration. EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).
  24. Lagace, D. C., et al. Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis. J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).
  25. Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons. J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).
  26. Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression. Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.
  27. Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 95،
تحريض حذف البروتين من خلال<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation لللتحديد العجز في العصبية الهجرة في النماذج المعدلة وراثيا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Svoboda, D. S., Clark, A., Park, D.… More

Svoboda, D. S., Clark, A., Park, D. S., Slack, R. S. Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models. J. Vis. Exp. (95), e51983, doi:10.3791/51983 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter