Abstract
מחיקה גנטית באמצעות מערכת Cre-לקס בקווי עכבר מהונדסים היא כלי רב עוצמה המשמש ללמוד תפקוד חלבון. עם זאת, למעט בדגמי Cre ספציפיים מאוד, מחיקה של חלבון בכל אוכלוסיית רקמה או תא מוביל לעתים קרובות לפנוטיפים מורכבים הנובעים ממנגנוני אינטראקציה מרובים. קביעה אם תוצאות פנוטיפ משיבוש מנגנון אוטונומי תא, שהוא מהותי לתא בשאלה, או ממנגנון אוטונומי שאינו תא, אשר יביא מירידת הערך של הסביבה של התא ש, יכולות להיות קשות להבחין. כדי לקבל תובנה תפקוד חלבון בהקשר in vivo, electroporation ברחם (IUE) מחיקת גן מאפשר בתת-קבוצה קטנה של תאים בקליפת המוח מתפתח או אזור במוח שנבחר אחר. IUE יכול לשמש כדי להתמקד באזורים מסוימים במוח, כולל telencephalon הגב, telencephalon המדיאלי, היפוקמפוס, או רוממות ganglionic. זה מקל על o תצפיתf ההשלכות של מחיקת גן אוטונומית תא בהקשר של סביבה בריאה. המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד IUE ניתן להשתמש כדי לנתח פגם בהגירה הרדיאלי בקו עכבר מהונדס floxed, עם דגש על הבחנה בין ההשפעות האוטונומיות אוטונומיות ולא-תא התא של מחיקת חלבון. על ידי השוואת פנוטיפ כתוצאה ממחיקת הגן בתוך כל הקליפה לעומת מחיקת גן תיווך IUE באוכלוסיית תא מוגבלת, להבין טוב יותר את תפקוד חלבון בהתפתחות המוח ניתן להשיג יותר מאשר באמצעות אחת טכניקה בבידוד.
Introduction
הגירת רדיאלי היא תהליך מרכזי בהתפתחות קליפת המוח מוקדמת. זה תלוי במגוון גורמים אוטונומיים תא, כגון יציאה נכונה mitotic והבחנה עצבית, קוטביות תא, רגולציה של דינמיקת cytoskeletal וביטוי של קולטנים הטרנסממברני, כמו גם גורמים אוטונומיים שאינו תא, כגון היווצרות פיגום גליה רדיאלי ו הפרשת ההדרכה נודדת מולקולות 1-3. מאז שיבוש של כל אחד ממנגנונים אלה יכולים לפגוע בהעברה עצבית במודל של עכברים מהונדס 4-8, קביעת הסיבה הבסיסית של פגם בהגירה יכולה להיות תהליך מורכב וקשה. ברחם electroporation (IUE) ניתן להשתמש כדי להשלים ולפשט פרשנות של הפנוטיפ של מודל נוק-אאוט גנטי ובכך להבהיר מנגנונים חשובים הנדרשים להגירת רדיאלי 7,9-11.
Electroporation ברחם (IUE) הוא התהליך שבו carryi פלסמיד ng שני גן של עניין וכתב מוזרק לתוך החדר במוח של עובר עכבר או חולדה ולאחר מכן נשאב לתוך התאים המצפים את החדר באמצעות שימוש 12-14 זרם חשמלי. הדבר זה מאפשר לחוקר לנתח את ההשפעה של למעלה או למטה רגולציה של גן של עניין בפיתוח או פונקציה של נוירונים electroporated. בעקבות IUE, יכול להיות מעובד מוח אימונוהיסטוכימיה 7,9-11, תרבות אלקטרופיזיולוגיה 15 או תא 16,17. היתרון העיקרי של IUE הוא שהוא מאפשר למניפולציה מאוד ספציפית של ביטוי גנים. יתר על כן, IUE ניתן להשתמש כדי למקד לאזור מסוים של המוח המתפתח דרך נוכחי (איור 2) בבימויו. גם IUE יכול לשמש יעד סוג תא ספציפי באמצעות הזרקה של פלסמידים שנשאו גנים תחת שליטת יזמים שונים או מערכות הפעלת פלסמיד (ביטוי טטרציקלין מושרה גן הוא דוגמא) 10,18-21.
jove_content "> IUE יכול לשמש בשילוב עם מערכת כריתת גן תיווך Cre-לקס 7-9,11,22. פלסמיד המכיל גן המקודד את ההודעה לחלבון Cre ניתן electroporated להומוזיגוטים עובר לאלל floxed ( שבאזורי הגן או DNA ספציפי מוקף שני אתרי loxP לרקומבינציה DNA בתיווך Cre). לאחר מכן Cre יגרום רקומבינציה של הגן של עניין במיוחד במבשרים עצביים electroporated, שהניבו בנוק-אאוט של floxed allele.The ההשפעה אז יכול להיות למד חלבון מציאה על הגירה ופיתוח בתוך נוירונים בודדים עצביים. Electroporation של Cre גורמת רקומבינציה באוכלוסייה קטנה של תאים שנפגעו, עוזבת את הסביבה תומכת בשלמותה. בניגוד לכך, ביטוי רקמות הספציפיות של Cre תחת שליטה של סוג תא מסוים אמרגן, מתרחש לאורך כל הרקמה, כך ששניהם neuroblasts הנודד והסביבה עלולים להיות מושפעים. כך, juxtaposition של שתי גישות אלה יכול לקבוע אם פגם הגירה ניתנה בשל תא מנגנונים שאינם אוטונומיים אוטונומיים או תא. הגירה פגומה בשתי מערכות הניסיוניות עולה כי תוצאות הפנוטיפ שנצפו ממנגנון אוטונומי תא; הגירה נורמלית הבא electroporation של Cre עם הגירה פגומה במודל Cre רקמות ספציפי מצביעה על כך שהגן של העניין פועל באמצעות מנגנון אוטונומי שאינו תא.גם IUE ניתן להשתמש כדי לבצע ניסויי הצלה על ידי electroporating גני אינטראקציה פוטנציאליים לבעלי חיים לדפוק את 7,9,10. לדוגמא, חוקר יכול לנסות להציל את הפנוטיפ הגירה במודל מהונדס על ידי electroporating יעד במורד הזרם וקביעה אם פגם ההגירה זו תוקן בנוירונים electroporated. זה יש יתרון נוסף שחילוץ מוצלח מצביע על כך שהגירה רגילה ניתן לשחזר על ידי המניפולציה ביטוי חלבון בSPEנוירון cific, למרות שהסביבה היא עדיין חסרה לגן הממוקד. שוב, גישה זו היא יותר זמן ועלות אפקטיבי מאשר חצייה או יצירת קווים מהונדסים, עם היתרון הנוסף של קביעה אם המנגנון הפגום הוא תא אוטונומי.
IUE ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר נדידת נוירונים דרך electroporation של פלסמיד כתב לעוברי לדפוק את (איור 4C). כמו שרק תאי העצב המרפדים את החדר בזמן הניתוח הם electroporated 17, IUE יכול לשמש למעקב נוירונים נולדו בזמן מסוים עם היתרון של הדמיה של המורפולוגיה שלהם in vivo.
לבסוף, ניתן להשתמש IUE למקד אזורים במוח כגון telencephalon המדיאלי או גב, היפוקמפוס או רוממות ganglionic (איור 2). זה נותן לי חוקרי הכח לחקור את תפקוד גן בעצמאי אזור מסוים של סיבוכי תוצאה רצוייםing מחלבון מציאה במבנים שכנים.
חלבון רטינובלסטומה (PRB), p107 וp130 מרכיבים את משפחת חלבון כיס ומבוסס היטב רגולטורים של יציאת מחזור התא. עם זאת, יש ראיות גוברת שחלבונים אלה גם להסדיר היבטים עצמאיים מחזור התא של התפתחות עצבית. כפי שהראינו בעבר, גדוד המשטרה וp107 לשחק תפקיד מכריע בשני 4,23 המשיקים וההגירה רדיאלי 6. הנה, אנחנו מדגימים את התפקיד של גדוד משטרת בני משפחת חלבון הכיס וp107 על הגירה עצבית 6 כדי להדגים את השימוש בelectroporation ברחם של Cre במודל מהונדס. לסיכום, IUE מספק דרך רבת עוצמה של ניתוח השפעות אוטונומיות תא של מחיקת גן (או ביטוי יתר). בשילוב עם רקמה ספציפית לדפוק את מודלים, IUE יכול לספק מידע נוסף בנוגע למנגנוני השליטה הגירה עצבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הניסויים אושרו על ידי האוניברסיטה של ועדת האתיקה הטיפול בבעלי חיים של אוטווה, הקפדה על ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.
הכנה וחומרים 1. טרום ניתוחיים
- פלסמיד הכנה:
- הכן פלסמידים באמצעות MegaPrep Qiagen פי הפרוטוקול של היצרן. Innoculate לפחות 400 מיליליטר של מרק LB עם חיידקים הפכו להבטחת תשואת DNA גבוהה ודגירת הלילה.
- פלסמיד הגלול ב100-200 μl TE לריכוז סופי של לפחות 5 מיקרוגרם / μl. DNA Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. אם הריכוז נמוך מדי, לא לזרז וresuspend כמו זה יכול להוסיף זיהומים. להתחיל מחדש עם הכנה חדשה.
- לפני הניתוח, לדלל פלסמיד בודד (Cre-GFP למשל) עד 2 מיקרוגרם / μl במים סטריליים עם 1 μl של 0.1% (w / v) צבע ירוק מהיר לכל 10 או 20 μl של פתרון פלסמיד מדולל. אם GFPואת הגן של ריבית ללהיות שותף electroporated בפלסמידים נפרדים, להזריק פלסמיד GFP ופלסמיד הנושא את הגן של ריבית בשיעור של 1: 4 למקסם את הסיכוי שכל התאים מסומנים עם GFP הם שיתוף electroporated עם שני פלסמידים.
- משוך צינורות microcapillary הזכוכית (קוטר חיצוני 1 מ"מ - להלן כפי מחטים) על חולץ מחט סטנדרטי, באמצעות משיכה צעד אחד בגיל 62 ° C.
- החיטוי חבילה כירורגית המכילה את הדברים הבאים: מחזיקי המחט, מפשק פצע, מלקחיים, מספריים לניתוח, מספריים למחטים, סיכות, סיכות, גזה, כיסויי פצע, וילונות כירורגי (איור 1 א ', ב'; לוח חומרים).
- לאסוף כלים אחרים הנדרשים: electroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 או 7 מ"מ), מלח, תפר, מזרק 5 מיליליטר (לוח חומרים).
2. הכן העכבר לכירורגיה
- לניהול כאב, להזריק מתוזמן-p עכבר regnant עם עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) שעה אחת לפני הניתוח. החל פרוטוקול זה לעכברים מתוזמן בכל מקום בין עוברי היום 12.5 (E12.5) לE17.5.
- השתמש בעצות פיפטה microloader לגבות עומס משך מחטים עם פתרון פלסמיד. אין למלא את כל הדרך לקצה המחט עדיין כמו זה יגרום המחט ללהיות סתומה.
- לטשטש עכבר באמצעות 2-5% גז isoflurane עם L 1 O / 2 דקות. ברגע הנייח, למקם במסיכת פנים ולהחיל משחה לעיניים כדי למנוע התייבשות. הזרק עם 1 מיליליטר תמיסת מלח (0.9% NaCl) תת עורי בגב.
הערה: כאשר עובד עם גז isoflurane, להשתמש נבלות גז לשחזר גז עודף ולמנוע ממנו לברוח לחדר. - לגלח את הבטן. לשטוף בטן עם לשפשף Chlorohexadine, לשטוף עם מים, ולהחיל פתרון הכנה סופי של chlorohexadine ו -70% אתנול. עכבר כיסוי עם וילון או גזה סטרילית כדי לכסות פרווה אבל להשאיר חשוף בטן (איור 1 ג, ד).
s = "jove_title"> 3. ברחם electroporation
- עושה חתך בעור מעל הבטן בין השדיים נמוכים יותר. למשוך את העור משכבת השריר הבסיסית על ידי קריעת רקמות חיבור, ואז לחתוך דרך הצפק לתוך חלל הבטן לאורך alba המנחה. הכנס את מפשק הפצע למשוך את הקצוות של הפצע בנפרד.
- הסר את הרחם מחלל הבטן ולהוציא אותו כפי שמוצגים (1E איור).
- אם גורים שונים להיות מוזרקים עם פלסמידים שונים (כגון GFP לעומת GFP עם הגן של עניין), לספור את הגורים בכל צד ולהחליט אילו וכמה להזריק עם כל פלסמיד. להחליף צד אחד של הרחם בחזרה לתוך הבטן כדי לשמור על העוברים חמים ומשומנים. מייד להרטיב את הרחם החשוף עם מי מלח (רצוי חימם לטמפרטורת גוף).
- אם הזרקת כל הגורים באותה פלסמיד (למשל, כאשר הזרקת Cre-GFP לעוברי מהונדסים) only להסיר קרן אחת של הרחם בזמן.
- שים מחט טעונה בראש האחיזה של שרביט ההזרקה ובזהירות לחתוך את הקצה עם מספריים כירורגיות קטנים או מלקחיים בסדר. חותך את הקצה כך שהמחט נשארת זמן רב ככל האפשר בזמן שעדיין מאפשר נוזל לעבור (איור 1Ji-ד ').
- התאם אורך של הזרקה (בשניות) והזרקה בלחץ על microinjector כך שאגל עדיין נראה בקלות קטנה של 0.1-0.2 μl מופיע בקצה המחט, כאשר ההנעה הרגל נלחץ. לשמור על הנפח של טיפה זו עקבית ככל האפשר בין מחטים שונות.
הערה: שלב זה הוא חיוני להישרדות עובר (ראה דיון). - השתמש בפרמטרים הבאים להזרקת Femtojet: הזרקה בלחץ (pi) = 250-300 hPa; זמן הזרקה (ti) = .8-1.2 שניות; לחץ פיצוי = 10-50 hPa. במידת הצורך, להתאים את הפרמטרים אלה כדי להתאים וריאציה בין מחטים.
- התאם אורך של הזרקה (בשניות) והזרקה בלחץ על microinjector כך שאגל עדיין נראה בקלות קטנה של 0.1-0.2 μl מופיע בקצה המחט, כאשר ההנעה הרגל נלחץ. לשמור על הנפח של טיפה זו עקבית ככל האפשר בין מחטים שונות.
- Sלבחור עובר ובעדינות למקם אותה על הגב שלה, ראשו המוטה כלפי מעלה (איור 1F).
הערה: זה עשויה לדרוש הפיכה או הסטת העובר; היזהר שלא להפעיל לחץ רב מדי ולהימנע מקרע של השק השפיר ואילו מניפולציה העובר. - ברגע שהעובר נמצא במקום, לאתר את החדר, המציג כמקביל צל בצורה חצי סהר לסינוס sagittal. לגעת בקצה המחט אל הרחם מעל החדר בזווית קלה ולהנחות את המחט דרך דופן הרחם. כמות הלחץ הנדרש תלויה בחדות של המחט. לדחוף את המחט דרך הקליפה לתוך החדר.
הערה: למרות שיש רק לעתים נדירות כל התנגדות לגילוי נוספת, ראשו של העובר הוא דחף לעתים קרובות משם מעט ואז נרתע כמחט עוברת דרך הקליפה לתוך החדר. - לשאוב את ההנעה הרגל להזריק פתרון פלסמיד. תמשיך לשאוב עד אזור ירוק גלוי ועומד בצורת קשת של החדר (איור 1G). בעוברים צעירים (E12.5 לE14.5) הצבע לעתים קרובות מפוזר לתוך החדר הנגדי.
הערה: מספר המשאבות תלוי בקוטר של קצה המחט, גיל העובר (והגודל של החדר וכתוצאה מכך) והרצוי נפח ההזרקה. שמרו נפח מוזרק עקבי ככל האפשר בין עוברים. - הזרק שלושה או ארבעה עוברים. שמור את כל העוברים שנחשפו לחים עם מי מלח בכל הליך.
- חזור לעוברים הראשונים הזריקו ולמקם את המשוטים כך שהאלקטרודה החיובית תמשוך את הפלסמיד לאזור הרצוי של המוח (איור 1H). זווית האלקטרודה השלילית, כך שהמסלול הקצר בין האלקטרודות מעבירה ישירות דרך המבנה הממוקד עבור electroporation (איור 2).
- ברגע שהמשוטים נמצאים במקום, להחיל את ההלם. בהתאם לגיל והגודל של העוברים, להשתמש 5 פולסים של 35-50 V (ראה T1 מסוגל). השתמש בפרמטרי electroporation הבאים: אורך הפולס של 5 אלפיות שניים עם מרווח דופק של 950 אלפיות שניים. חזור עם כל העוברים המוזרקים.
- חותך את קצה המחט טעונה מראש חדשה כמו בשלב 3.3 כמחט האחרונה סביר מיובשת וסתום במהלך שלב 3.9. להזריק את הסדרה הבאה של שלושה או ארבעה עוברים עם או אותו פלסמיד או פלסמיד שונה ולאחר מכן להחיל את ההלם כמו בשלב 3.9. כאשר כל הגורים בצד אחד של הרחם מוזרקים, להסיר את הצד השני של הרחם מהבטן של הנקבה ולאחר מכן להחליף את הצד המוכן ללשמור אותו חם.
- חזור שני הצדדים של הרחם לנזהר לשמור המשטח לח עם מי מלח ולא להפעיל לחץ רב מדי על מנת למנוע טראומה לצ'קים מי השפיר הנשי. לתפור את שכבת השריר נסגרה באמצעות תפר רציף פשוט. סיכות העור סגור. אם סיכות אינן זמינות, לתפור את העור עם תפר שהופסק פשוט. (איור 1 ט)
- בעוד suturing, בהדרגה להנמיך את isoflurane לאפשר ההרדמה של הנקבה בהריון כדי להבהיר.
הערה: זה יזרז עוררות של הסכר לאחר הניתוח הוא מוחלט; שמירה על הנקבה הרדים לזמן קצר ביותר אפשרי ישפר הישרדות עובר. זמן ניתוח כולל, החל מכאשר הנקבה היא מורדמת ראשון, צריך להיות כ 30 דקות.
4. טפול עוקב
- הנח את הנקבה נתפרה בחממה או על כרית חימום להתאושש מהרדמה. מיטתה במצעים נקיים ומניח את הג'ל התאוששות סטנדרטי בכלוב לשמור על לחות. לניהול כאב לאחר ניתוח, לתת שלוש מנות הנשיות של עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) בשעה 8 במרווחי שעות לאחר ניתוח, ולאחר מכן ארבע מנות נוספות במרווחים של 12 שעות.
5. מוח קציר
ניתן לקצור מוח בכל גיל עד בגרות: הערה. הבא חללאיסוף מוח לפני הלידה. שים לב שברגע שהגורים נולדים, כדי בתוך הרחם הולכים לאיבוד, אז או שכל גור בהמלטה חייב להיות מוזרק עם אותו פלסמיד, או שיטה אחרת של הבחנה בין שליטה וחיות ניסוי חייבת להיות המציאה.
- הכן (4 ° C) הקר, מסונן paraformaldehyde 4% (PFA) לפני הרדמת החסד נשי.
- להרדים את הנקבה באמצעות זריקת intraperitoneal של מנה קטלנית של pentobarbital נתרן (100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) ולחתוך בטן פתוחה. משוך את שני הצדדים של הרחם ולהוציא ככאשר גורים היו בתחילה הזריקו.
- במקרה שבו כל הגורים קיבלו את אותו פלסמיד, כגון כאשר הזרקת Cre להמלטה מהונדס, כדי עובר הוא לא חשוב, לכן לחתוך את הרחם מתוך הנקבה והמקום בPBS.
- אם גורים הוזרקו עם פלסמידים שונים, להיות בטוח כדי לאתר כל גור, וציינו כל גורים מתים, ולקבוע אילו הוזרקו שליטה וexperimenפלסמידים טל לפני הסרת הרחם מהמין הנקבה. להיות זהיר כדי לעקוב אחר שהגור שייך לאיזו קבוצה לאחר הרחם הוא בPBS.
- הסר כל גור בנפרד, לערוף עם מספריים חדים או סכין גילוח ולמקם את הראש בPBS. במקרה של עכברים הטרנסגניים, לאסוף דגימות רקמה לgenotyping ולשמור על כל ראש נפרד, כגון בצלחת 12 גם.
- תחת בהיקף לנתח, להסיר את המוח מהגולגולת, נזהר שלא ניק הקליפה או לקרוע את קו האמצע. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לבדוק אם יש לי המוח GFP + תיקון, מצביע על כך שהם electroporated בהצלחה.
- תקן את המוח על ידי טבילה בPFA ב 4 ° C למשך לילה.
הערה: בדוק את המוח לביטוי של GFP לפני הקיבוע מאז PFA לעתים קרובות מרווה את האות. - מוח Cryoprotect באמצעות טבילה בסוכרוז 20% לפחות שלושה ימים לפני ההקפאה. השתמש בשיפוע סוכרוז 10%, 15% ו -20% (24 שעות בכל פתרון) to למנוע נזק לרקמות כתוצאה מלחץ האוסמוטי. אחסן את המוח קפוא ב -80 ° C ולגזור על cryostat ב10-14 מיקרומטר חלקים עבים.
6. Co-צביעה עם אנטי-GFP
הערה: אם אחזור אנטיגן הוא הכרחי על מנת לשתף את כתם עם אנטי-GFP, חשוב להשתמש בפרוטוקול אחזור אנטיגן עדין שאינו פוגע באות ה- GFP. פרוטוקולים אחזור אנטיגן חלקם קשים מדי לשימוש בשילוב עם צביעת GFP (אפילו עם נוגדן כנגד GFP). חומצת לימון בסיסית טיפול מראש לפני היישום של הנוגדן הראשוני הוא מוצלח ביותר לepitopes 24.
- הפוך פתרון 0.01 מ 'של חומצת הלימון בDDH 2 O. pH 6 באמצעות מד pH מכויל.
- חומצת לימון חום בחדר צביעה במיקרוגל או אמבט מים עד חומצות לימון מגיעה 75-80 מעלות צלזיוס. שים שקופיות בתא מכתים במשך 10-15 דקות. לשמור על טמפרטורה יציבה כככל האפשר.
- לשטוף שקופיות בPBS3x עבור 3 דקות בטמפרטורת חדר. החל הנוגדן הראשוני ולהמשיך עם immunostaining לפי פרוטוקול סטנדרטי.
- לאמת כריתת תיווך Cre על ידי שיתוף תיוג לGFP והגן של עניין כדי לאשר להפיל (איור 3 א).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שניים מהאתגרים העיקריים בביצוע בelectroporations ברחם הם 1) מניעה קטלני עובר ו 2) הפחתת שונות בין electroporations. אחד הגורמים החשובים ביותר במניעה קטלנית הוא איכות מחט, כמחטים קהות לגרום יותר נזק לעובר. בעת חיתוך המחט, לשמור על קצה זמן רב ככל האפשר בזמן שעדיין מאפשר אגל גלוי של 0.1-0.2 μl של נוזל להופיע הבא משאבה של ההנעה כף הרגל (איור 1J). אם המחט היא משעממת מדי או קצרה מדי הפיר, נזק לרקמות וכתוצאה מכך יכול להרוג את העובר. לעומת זאת, אם קצה המחט הוא דק מדי, הוא ייקח יותר מדי זמן כדי להזריק מספיק פלסמיד נפח; משאיר את המחט במוח לנזק סיבות זמן רב מדי בשל תנודות בלתי נמנעות של ידיו של החוקר וסיבובים קלים של העובר. יתר על כן, להשתמש בmicrobeveler לעשות מחטים עם טיפים חדים, משופעים כדי לאפשר זריקות לצעירות, עוברים שבירים יותר, אם כי זה לא צריך להיות הכרחי לE13.5 עוברים ומעלה.
רמת הלחץ של הנשים בהריון היא עוד גורם מרכזי המשפיע על הישרדות עובר. רמת הלחץ של הסכר גבוהה יותר, כך גדלתי סיכוי שהיא תתבטל ההמלטה. מסיבה זו חשוב כדי למזער את זמן הרדמה ולשנות דיור קטן ככל האפשר לפני ואחרי הניתוח. זן הרקע יכול להשפיע גם על רמת לחץ וזה עשוי להיות נחוץ כדי מושבות outcross נוטות חרדה על מתח כגון CD1, בהנחה שהפנוטיפ תחת החקירה נשמר על פני זני רקע שונים.
המגבלה הגדולה ביותר לIUE היא ההשתנות הטבועה בין electroporations. כל מוח electroporated הוא שונה עקב שינויים בנפח הזרקה, מיקום ההנעה, קשר ההנעה וגיל עובר. מאז מחטים משתנות, לא ניתן להזריק נפח קבוע - ולא investigator חייב להתקרב לגודל של הכתם הירוק לספק כמויות דומות לכל העוברים. בדומה לכך, משום שהעובר הוא צף בצק נוזלים מלאים, לא ניתן למדוד את המיקום וכיוון של המשוטים על ראשו של העובר באופן שיטתי, כפי שנעשה לזריקות stereotactic. לבסוף, הבדלים קלים בגיל עוברי יכולים להיות השפעה משמעותית על תוצאות ניסוי. מסיבה זו, השוואה בין ההמלטה מומלצת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Square Wave Electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Electroporator only – buy cables separately (45-0204) |
| 1250FS Footswitch for ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | Foot paddle is necessary for hands-free electroporation |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5mm) 45-0488 (7mm) | Platinum forcep style electrodes |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Holds the pulled needle |
| Universal Capillary Holder | Eppendorf | 920007392 | Connects griphead to tube |
| Injection Tube | Eppendorf | 920007431 | Connects capillary holder to Femtojet |
| Foot Control | Eppendorf | 920005098 | Foot paddle for hands-free injection |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Tips for loading the pulled capillary tubes |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Non-toxic dye |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | For trimming the needles |
| Bonn Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Straight |
| Colibri Retractors | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 | For 7mm clips |
| Castroviejo Needle Holder | Medical Tools | SNH-6737 | Straight, with lock |
| Needle Puller | Narishige | PC-10 | For pulling microcappillaries |
| Microcapillaries | Drummond | 1-000-800 | 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes |
References
- Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).
- Wu, Q., et al.
- McClellan, K. A., et al. Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions. Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).
- Nguyen, L., et al. P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex. Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).
- Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis. Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex. Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).
- Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse. Neural Dev. 6, (2011).
- Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors. J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).
- Heng, J. I., et al. Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2. Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).
- Alfano, C., et al. COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression. Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Dixit, R., et al. Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).
- Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro. Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Miyagi, S., et al. The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells. Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.
- Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).
- Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K.
- Ferguson, K. L., et al. A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration. EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).
- Lagace, D. C., et al. Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis. J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).
- Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons. J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).
- Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression. Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.
- Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).
