Abstract
Genetische Löschen mit Hilfe des Cre-Lox-System in transgenen Mauslinien ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Proteinfunktion zu untersuchen. Außer in sehr spezifische Cre-Modelle, Deletion eines Proteins während eines Gewebe- oder Zellpopulation führt häufig zu komplexen Phänotypen aus mehreren zusammenwirkenden Mechanismen resultieren. Bestimmen, ob ein Phänotyp Ergebnisse Störung einer Zelle autonom Mechanismus, der untrennbar mit der betreffenden Zelle, oder von einem nicht-zellautonomen Mechanismus ein, wodurch Beeinträchtigung der Umgebung dieser Zelle führen würde, kann schwer zu erkennen sein. Um einen Einblick in die Proteinfunktion in einem in vivo-Kontext zu ermöglichen, in utero Elektroporation (IUE) ermöglicht Gendeletion in einer kleinen Untergruppe von Zellen innerhalb des Entwicklungsrinde oder einem anderen ausgewählten Hirnregion. IUE können bestimmte Gehirnbereiche, einschließlich der dorsalen Telencephalon, Endhirn medialen, Hippocampus oder Ganglienhügel zielen werden. Dies erleichtert die Beobachtung of die Folgen der Zelle autonom Gendeletion im Rahmen einer gesunden Umwelt. Das Ziel des Protokolls ist es, zu zeigen, wie IUE können zur Unterscheidung zwischen den Zell autonom und nicht zell autonome Wirkungen von Protein Löschung verwendet werden, um einen Defekt in radiale Migration in einer floxed transgene Mauslinie zu analysieren, mit einem Schwerpunkt. Durch den Vergleich des Phänotyps, die aus Gen-Deletion innerhalb des gesamten Kortex im Vergleich IUE-vermittelte Gen-Deletion in einem begrenzten Zellpopulation, einen besseren Einblick in die Proteinfunktion in der Entwicklung des Gehirns kann als mit beiden Techniken in Isolation erreicht werden.
Introduction
Radial Migration ist ein zentraler Prozess zur frühen kortikalen Entwicklung. Es hängt von einer Vielzahl von Zell autonomen Faktoren wie korrekte mitotischen Ausfahrt und die neuronale Differenzierung, Zellpolarität, die Regulierung des Zytoskeletts und die Expression des Transmembran-Rezeptoren, wie auch nicht-zell autonomen Faktoren, wie die Bildung von radialen Gliazellen Gerüst und Sekretion der Migrationsberatung Moleküle 1-3. Da Störungen einer dieser Mechanismen neuronaler Migration in einem transgenen Mausmodell 4-8 In utero Elektroporation (IUE) beeinträchtigt, die Bestimmung der Ursache eines Fehlers in der Migration kann ein komplexer und schwieriger Prozess sein. Kann verwendet werden, zu ergänzen und zu vereinfachen Interpretation des Phänotyps einer genetischen Knock-out-Modells und damit wichtige Mechanismen aufzuklären radiale Migration 7,9-11 erforderlich.
In utero Elektroporation (IUE) ist der Vorgang, bei dem ein Plasmid carryi ng sowohl ein Gen von Interesse und ein Reportergen in die Ventrikel des Gehirns eines Maus oder Rattenembryo injiziert und dann in die Zellen der Herzkammer durch Anwendung eines elektrischen Stroms 12-14 gezogen. Dies ermöglicht dem Prüfer, die Wirkung der nach oben oder unten Regulation eines Gens von Interesse in der Entwicklung oder Funktion elektroporiert Neuronen zu analysieren. Nach IUE können Gehirne für die Immunhistochemie 7,9-11, Elektrophysiologie 15 oder Zellkultur 16,17 verarbeitet werden. Der große Vorteil ist, dass IUE wird ermöglicht hochspezifische Manipulation der Genexpression. Weiterhin kann IUE verwendet, um einen bestimmten Bereich des sich entwickelnden Gehirns durch einen gerichteten Strom (Abbildung 2) zu zielen. IUE können auch verwendet werden, um einen spezifischen Zelltyp, durch Injektion von Plasmiden, die Gene unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren oder Plasmid Aktivierungssysteme abzuzielen (Tetracyclin induzierte Genexpression ist ein Beispiel) 10,18-21.
jove_content "> IUE kann in Verbindung mit dem Cre-Lox-vermittelten Gen Exzision System 7-9,11,22 verwendet werden. kann ein Plasmid, das ein Gen, das die Nachricht für die Cre-Protein kodiert, in einen Embryo homozygot für das Allel floxed (elektroporiert werden in denen das Gen oder spezifische DNA-Regionen werden durch zwei loxP-Stellen für Cre-vermittelte DNA-Rekombination) flankiert. Cre dann induzieren Rekombination des Gens von Interesse spezifisch in elektroporiert neuralen Vorläuferzellen, Erzeugen eines Knock-out des floxed allele.The Wirkung Protein auf neuronale Migration und Entwicklung in einzelnen Neuronen Knockdown kann dann untersucht werden. Die Elektroporation von Cre Rekombination induziert in nur einer kleinen Population von betroffenen Zellen, so dass die Unterstützung von Umwelt intakt. Im Gegensatz dazu gewebespezifische Expression von Cre unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotor, tritt während des gesamten Gewebes, so daß beide Migration Neuroblasten und der Umgebung beeinträchtigt werden. So juxtaposition dieser beiden Ansätze können bestimmen, ob ein bestimmter Migrationsdefekt aufgrund autonomer oder Zell nicht autonomen Mechanismen der Zelle ist. Defekte Migration in beiden experimentellen Systemen legt nahe, dass die beobachteten Phänotyp resultiert aus einer Zelle autonom Mechanismus; normaler Migrations nach Elektroporation von Cre mit defekten Migration auf eine gewebespezifische Cre Modell zeigt, dass das Gen von Interesse durch eine nicht-zell autonomen Mechanismus wirkt.IUE kann auch verwendet werden, um Rettungsversuche durch Elektroporation potenzielle Interaktion von Genen in Knock-out-Tiere 7,9,10 durchzuführen. Zum Beispiel könnte ein Forscher versucht, eine Migration Phänotyp in einer transgenen Modells durch Elektroporation ein stromabwärtiges Ziel und Bestimmen, ob die Migration Defekt in elektroporierten Neuronen korrigiert retten. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass ein erfolgreicher Rettungs zeigt an, daß normale Migration kann durch Manipulieren der Proteinexpression in einer spe wiederhergestelltsche Neuron, obwohl die Umgebung noch defizient Zielgens. Wiederum ist dieser Ansatz mehr Zeit und kostengünstiger als die Kreuzung oder transgene Linien, mit dem zusätzlichen Vorteil der Bestimmung, ob der defekte Mechanismus Zelle autonom.
IUE verwendet werden, um die Migration zu verfolgen Neuronen durch Elektroporation von einem Reporter-Plasmid in Knock-out-Embryonen (4C) werden. Da nur die Neuronen Auskleidung der Herzkammer zu der Zeit der Operation werden elektroporiert 17 kann IUE verwendet, um die Nervenzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt mit dem Vorteil der Visualisierung ihrer Morphologie in vivo geboren folgt.
Schließlich ist es möglich, IUE wie der medialen oder dorsalen Telencephalon, Hippocampus oder Ganglienhügel (Abbildung 2) zu verwenden, um Hirnregionen gezielt. Dies gibt Forschern die Möglichkeit Genfunktion in einem bestimmten Bereich unabhängig von Komplikationen zu untersuchendie sich aus Protein in benachbarten Strukturen Knockdown.
Retinoblastom Protein (pRb), p107 und p130 umfassen die Tasche Proteinfamilie und sind gut etabliert Regulatoren des Zellzyklus zu beenden. Allerdings gibt es immer mehr Anzeichen dafür, dass diese Proteine des Zellzyklus unabhängige Aspekte der neuralen Entwicklung regulieren auch. Wie wir bereits gezeigt haben, pRb und p107 spielen eine entscheidende Rolle in beiden tangentialen 4,23 und radiale Migration 6. Hier zeigen wir die Rolle der Tasche Proteinfamilienmitglieder pRb und p107 neuronaler Migration 6, den Einsatz von in utero Elektroporation von Cre in einem transgenen Modell veranschaulichen. Zusammengefasst stellt IUE eine leistungsfähige Möglichkeit zum Analysieren Zelle autonom Wirkungen der Gen-Deletion (oder Überexpression). Wenn mit gewebespezifischen Knock-out-Modelle kombiniert werden, können IUE zusätzliche Informationen über die Mechanismen, die neuronale Migration bieten.
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Protocol
HINWEIS: Alle Experimente wurden von der University of Ottawa Animal Care Ethikkommission genehmigt wurde, zu den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care haften.
1. Präoperative Vorbereitung und Materialien
- Plasmidpräparation:
- Bereiten Plasmiden unter Verwendung des Qiagen MegaPrep nach dem Protokoll des Herstellers. Innoculate mindestens 400 ml LB-Medium mit transformierten Bakterien, um eine hohe DNA-Ausbeute zu gewährleisten und Inkubation über Nacht.
- Resuspendieren Plasmid in 100-200 ul TE auf eine Endkonzentration von wenigstens 5 & mgr; g / & mgr; l. Aliquoten DNA und bei -20 ° C. Wenn die Konzentration zu niedrig ist, nicht ausfallen und Resuspendieren da dies Verunreinigungen hinzufügen. Starten Sie mit einem neuen Präparat.
- Vor der Operation, verdünnte ein einzelnes Plasmid (Cre-GFP zum Beispiel) zu 2 ug / ul in sterilem Wasser mit 1 & mgr; l von 0,1% (w / v) Fast Green Farbstoff pro 10 oder 20 & mgr; l verdünnt Plasmidlösung. Wenn GFPund das Gen von Interesse sind, auf getrennten Plasmiden co-elektroporiert werden, spritzen die GFP-Plasmid und das Plasmid, das das Gen von Interesse in einem Verhältnis von 1: 4, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, dass alle mit GFP markierten Zellen werden mit beiden co-elektroporiert Plasmide.
- Ziehen Glas Mikrokapillarröhrchen (1 mm Außendurchmesser - im Folgenden als Nadeln bezeichnet) auf einem Standard-Nadelzieher, mit einem einzigen Schritt Pull bei 62 ° C.
- Autoklavieren eine chirurgische Packung, die die folgenden: Nadelhalter, Wundhaken, Zangen, Scheren für die Chirurgie, Scheren für Nadeln, Hefter, Heftklammern, Gaze, Wundabdeckungen, OP-Abdeckungen (1A, B, Werkstoff-Tabelle).
- Sammeln Sie anderen erforderlichen Werkzeuge: Electroporator, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 oder 7 mm), Kochsalzlösung, Naht, 5-ml-Spritze (Werkstoff-Tabelle).
2. Bereiten Maus für Chirurgie
- Zur Schmerztherapie, spritzen ein zeitlich-pregnant Maus mit Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) eine Stunde vor der Operation. Wenden Sie dieses Protokoll, um Mäuse überall von embryonalen Tag 12,5 (E12.5) E17.5 zeitgleich.
- Verwenden Sie Microloader Pipettenspitzen zu Back-Last gezogen Nadeln mit dem Plasmid-Lösung. Nicht ganz zu füllen nicht in die Spitze der Nadel noch da sonst die Nadel verstopft zu werden.
- Betäuben Maus unter Verwendung von 2-5% Isofluran Gas mit 1 l / min O 2. Sobald unbeweglich, legen Sie in der Gesichtsmaske und wenden Salbe die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Injizieren mit 1 ml Salzlösung (0,9% NaCl) subkutan im Rücken.
HINWEIS: Bei der Arbeit mit Isofluran Gas, mit einem Gas-Scavenger, um überschüssiges Gas zurückerobern und verhindern, dass sie an der Flucht in den Raum. - Rasur Bauch. Waschen Sie Bauch mit Chlorohexadine Peeling, mit Wasser abspülen, und tragen Sie eine endgültige Lösung von prep chlorohexadine und 70% Ethanol. Abdeckung Maus mit sterilen Tuch oder Gaze zu Pelz ab, sondern lassen Leib ausgesetzt sind (Abbildung 1 C, D).
In utero Elektroporation
- Einen Einschnitt in die Haut über dem Bauch zwischen den unteren Zitzen. Ziehen Sie die Haut von der zugrunde liegenden Muskelschicht durch Abreißen des Bindegewebes, dann durch das Bauchfell geschnitten in die Bauchhöhle entlang der Linea alba. Legen Sie die Wundhaken, um die Wundränder auseinander zu ziehen.
- Entfernen Sie die Gebärmutter aus der Bauchhöhle und legte es wie gezeigt (Abbildung 1E).
- Wenn verschiedene Welpen mit verschiedenen Plasmiden (wie GFP gegen GFP mit dem Gen von Interesse) eingespritzt werden, zählen die Jungen auf jeder Seite und entscheiden, welche und wie viele mit jedem Plasmid injizieren. Ersetzen Sie eine Seite der Gebärmutter wieder in den Bauch, um die Embryonen warm und geschmiert zu halten. Sofort befeuchten ausgesetzt Gebärmutter mit Kochsalzlösung (vorzugsweise auf Körpertemperatur erwärmt).
- Wenn die Injektion alle Welpen mit dem gleichen Plasmid (wie bei der Injektion Cre-GFP in transgenen Embryos) only entfernen ein Horn des Uterus zu einer Zeit.
- Setzen Sie einen geladenen Nadel im Spannkopf der Spritzstab und schneiden Sie vorsichtig die Spitze mit einem Paar von kleinen chirurgischen Schere oder feinen Pinzette. Schneiden Sie die Spitze, so dass die Nadel bleibt so lange wie möglich, während immer noch damit Fluid durch (Abbildung 1ji-iv) übergeben.
- Verstellbaren Länge der Injektion (in Sekunden) und der Einspritzdruck am Mikroinjektor so daß ein kleines, leicht sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 & mgr; l wird auf der Spitze der Nadel, wenn der Fuß Paddel gedrückt. Halten Sie die Lautstärke dieses Tröpfchen so konsistent wie möglich zwischen verschiedenen Nadeln.
Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben Embryo (siehe Diskussion). - Verwenden Sie die folgenden Einspritzparameter für den FemtoJet: Injektion Druck (pi) = 250-300 hPa; Einspritzzeit (ti) = 0,8-1,2 sec; Kompensationsdruck = 10 bis 50 hPa. Falls erforderlich, stellen Sie diese Parameter, um Unterschiede zwischen den Nadeln unterzubringen.
- Verstellbaren Länge der Injektion (in Sekunden) und der Einspritzdruck am Mikroinjektor so daß ein kleines, leicht sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 & mgr; l wird auf der Spitze der Nadel, wenn der Fuß Paddel gedrückt. Halten Sie die Lautstärke dieses Tröpfchen so konsistent wie möglich zwischen verschiedenen Nadeln.
- Swählt einen Embryo und sanft positionieren Sie es auf dem Rücken, den Kopf nach oben geneigt (1F).
HINWEIS: Dies kann erfordern, Drehen oder Verschieben des Embryos; darauf achten, nicht zu viel Druck anwenden und vermeiden Ruptur der Fruchtblase, während die Manipulation des Embryos. - Sobald der Embryo vorhanden ist, suchen Sie die Herzkammer, die als halbmondförmigen Schatten parallel zum Sinus sagittalis präsentiert. Berühren Sie die Spitze der Nadel in die Gebärmutter über der Herzkammer in einem leichten Winkel und führen Sie die Nadel durch die Gebärmutterwand. Der erforderliche Druck hängt von der Schärfe der Nadel. Die Nadel in die Rinde in die Herzkammer.
HINWEIS: Auch wenn es selten jede zusätzliche nachweisbar Widerstand, Leiter des Embryos wird oft weg leicht geschoben und dann zurückweicht, wenn die Nadel durch die Rinde in die Herzkammer führt. - Pumpen Sie den Fuß Paddel, um das Plasmid-Lösung zu injizieren. Weiter zu pumpen, bis ein grüner Bereich sichtbar und entspricht derBogenform des Ventrikels (Figur 1G). In jungen Embryonen (E12.5 bis E14.5) der Farbstoff oft diffundieren in die kontralaterale Ventrikels.
HINWEIS: Die Anzahl von Pumpen ist abhängig vom Durchmesser der Nadelspitze, dem Alter des Embryos (und resultierende Größe des Ventrikels) und dem gewünschten Einspritzvolumen. Halten Volumen zwischen Embryonen injiziert so konsistent wie möglich. - Injizieren drei oder vier Embryonen. Bewahren Sie alle exponierten Embryonen feucht mit Kochsalzlösung im gesamten Verfahren.
- Zurück zu den ersten Embryonen injiziert und legen die Paddel, so daß die positive Elektrode, die das Plasmid in die gewünschte Region des Gehirns (Abbildung 1H) ziehen. Winkel der negativen Elektrode, so dass der kürzeste Weg zwischen den Elektroden direkt durch die Struktur zur Elektroporation gezielte (Abbildung 2).
- Sobald die Paddel sind vorhanden, wenden Sie den Schock. Je nach Alter und Größe des Embryos, nutzen 5 Impulse von 35-50 V (siehe TLage 1). Verwenden Sie die folgenden Elektroporationsparameter: Impulslänge von 5 ms mit einer Impulspause von 950 ms. Wiederholen Sie dies mit allen injizierten Embryonen.
- Schneiden Sie die Spitze der neuen vorinstallierten Nadel, wie in Schritt 3.3 als die letzte Nadel wahrscheinlich, getrocknet und im Schritt 3.9 verstopft. Injizieren Sie die nächste Gruppe von drei oder vier Embryonen entweder mit dem gleichen Plasmid oder einem anderen Plasmid und dann den Schock wie in Schritt 3.9. Wenn alle Welpen in einer Seite der Gebärmutter injiziert werden, entfernen Sie die zweite Seite der Gebärmutter von Bauch des Weibchens und ersetzen Sie dann die fertige Seite, um sie warm zu halten.
- Zurück auf beiden Seiten der Gebärmutter auf die weibliche darauf achten, die Oberfläche feucht mit Kochsalzlösung und nicht zu halten, um zu viel Druck, um Verletzungen der Fruchtblasen zu verhindern. Naht der Muskelschicht geschlossen mit einem einfachen kontinuierlichen Stich. Staple die Haut verschlossen. Wenn Heftklammern nicht verfügbar sind, nähen die Haut mit einer einfachen unterbrochenen Stich. (1I)
- Während suturing, schrittweise reduzieren Sie die Isofluran-Narkose, damit der schwangeren Weibchens zu erhellen.
Hinweis: Dies wird Erregung des Dammes zu beschleunigen, nachdem die Operation abgeschlossen ist; Halten des weiblichen für so kurze Zeit wie möglich wird Embryo Überleben verbessern betäubt. Gesamtoperationszeit, ab wann sich der weibliche zunächst betäubt, sollte ca. 30 min.
4. Nachsorge
- Legen Sie die Naht weiblichen in einem Brutschrank oder auf einem Heizkissen, um aus der Narkose zu erholen. Bed sie auf saubere Bettwäsche und legen Sie ein Standard-Recovery-Gel in den Käfig zu halten Feuchtigkeit. Für die Schmerztherapie nach einer Operation, ergeben die weiblichen drei Dosen von Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) in 8 Stunden Intervallen nach der Operation erhalten die vier zusätzlichen Dosen in 12 Stunden Intervallen.
5. Ernten Brains
HINWEIS: Brains kann in jedem Alter bis zum Erwachsenenalter geerntet werden. Es giltzum Sammeln Gehirn vor der Geburt. Beachten Sie, dass einmal Welpen geboren werden, die Reihenfolge in der Gebärmutter ist verloren, also entweder alle Welpen im Wurf mit der gleichen Plasmid injiziert werden, oder ein anderes Verfahren zur Differenzierung zwischen Kontroll- und Versuchstiere müssen entwickelt werden.
- Bereiten kaltem (4 ° C) und filtriert, 4% Paraformaldehyd (PFA) vor euthanizing weiblich.
- Euthanize das weibliche Verwendung einer intraperitonealen Injektion einer letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg Körpergewicht) und aufgeschnitten Abdomen. Ziehen Sie beide Seiten der Gebärmutter und das Layout wie der Jungtiere zunächst injiziert.
- In dem Fall, wo alle Jungtiere erhielten die gleiche Plasmid wie beim Injizieren Cre zu einer transgenen Wurf ist Embryo Reihenfolge unwichtig, deshalb schneiden den Uterus aus dem weiblichen und in PBS.
- Bei Jungtieren wurden mit verschiedenen Plasmiden injiziert ist, lesen Sie jeden Welpen zu finden und stellt fest, tote Jungtiere, und festzustellen, welche mit Steuer und experimen injiziert wurdental Plasmiden vor dem Entfernen der Gebärmutter vom Weibchen. Achten Sie darauf, den Überblick zu behalten, welche Welpen zu welcher Gruppe nach der Uterus in PBS.
- Nehmen Sie jedes Welpen einzeln, enthaupten mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge und legen den Kopf in PBS. Im Falle von transgenen Mäusen, sammeln Gewebeproben für die Genotypisierung und halten jeden Kopf getrennt, wie in einer 12-Well-Platte.
- Unter einem Binokular, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, man aufpassen, nicht nick die Rinde oder reißen die Mittellinie. Mit einem Fluoreszenzmikroskop, prüfen Sie, ob Gehirne haben eine GFP + Patch, was darauf hinweist, dass sie erfolgreich elektroporiert wurden.
- Fix Gehirn durch Eintauchen in PFA bei 4 ° C über Nacht.
HINWEIS: Überprüfen Sie Gehirne für die Expression von GFP vor der Fixierung seit PFA oft das Signal löscht. - Cryoprotect Gehirn durch Eintauchen in 20% Saccharose für mindestens drei Tage vor dem Einfrieren. Verwenden einen Saccharosegradienten von 10%, 15% und 20% (24 h in jeder Lösung) to verhindern Gewebeschädigung durch osmotischen Druck. Bewahren gefrorenen Gehirne bei -80 ° C und auf einem Kryostat geschnitten auf 10-14 um dicke Abschnitte.
6. Co-Färbung mit anti-GFP
HINWEIS: Wenn Antigen-Retrieval, um Co-Fleck mit anti-GFP notwendig ist, ist es wichtig, eine schonende Antigen-Retrieval-Protokoll, das die GFP-Signal nicht beeinträchtigt verwenden. Einige Antigen-Retrieval-Protokolle sind zu hart, um in Verbindung mit der GFP-Färbung (sogar mit einem Antikörper gegen GFP) zu verwenden. Eine grundlegende Zitronensäure Vorbehandlung vor dem Aufbringen des primären Antikörpers ist erfolgreich für die meisten Epitope 24.
- Machen Sie eine 0,01 M Lösung von Zitronensäure in ddH 2 O. pH 6 unter Verwendung eines kalibrierten pH-Meters.
- Wärme Zitronensäure in Färbung Kammer in Mikrowelle oder Wasserbad, bis Zitronensäure erreicht 75 bis 80 ° C. Legen Sie Folien in Färbung Kammer für 10-15 min. Haltetemperatur so stabil wie möglich.
- Waschen Sie Dias in PBS3x für 3 min bei Raumtemperatur. Übernehmen Sie die primären Antikörper und fahren Sie mit Immunfärbung nach einem Standardprotokoll.
- Bestätigen Cre vermittelte Exzision durch Co-Kennzeichnung für GFP und des Gens von Interesse zu bestätigen, knock down (3A).
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Discussion
Zwei der wichtigsten Herausforderungen bei der Durchführung in utero Elektroporationen sind 1) verhindert Embryoletalität und 2) abnehmende Variabilität zwischen Elektroporationen. Einer der wichtigsten Faktoren bei der Vermeidung Letalität ist Nadelqualität, da stumpfe Nadeln verursachen mehr Schaden an dem Embryo. Beim Schneiden der Nadel, halten Sie die Spitze so lange wie möglich während immer noch eine sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 & mgr; l der Flüssigkeit zu erscheinen im Anschluss an eine Pumpe des Fußes Paddel (Abbildung 1J). Wenn die Nadel zu langweilig oder die Welle zu kurz ist, kann die resultierende Gewebeschaden, den Embryo zu töten. Umgekehrt, wenn die Spitze der Nadel zu fein ist, wird es zu lange dauern, um eine ausreichende Plasmid Volumen zu injizieren; so dass die Nadel im Gehirn zu lange Ursachen Schäden aufgrund von unvermeidlichen Vibrationen der Hand des Untersuchers und leichte Drehungen des Embryos. Darüber hinaus verwenden Sie einen microbeveler Nadeln mit einem scharfen, abgeschrägten Spitzen machen, um Injektionen in jüngeren ermöglichen, Zerbrechlicher Embryonen, obwohl dies nicht notwendig sein sollte für Embryos E13.5 aufwärts.
Das Spannungsniveau der Schwangeren ist ein weiterer wichtiger Faktor, der die Embryo Überleben. Die höhere Spannungsniveau der Mutter, desto eher wird sie das Katzenklo abzubrechen. Aus diesem Grund ist es wichtig, Anästhesiezeit zu minimieren und das Gehäuse zu ändern so wenig wie möglich vor und nach der Operation. Die Hintergrundstamm kann auch Auswirkungen auf Stresslevel und kann es notwendig sein Outcross Kolonien anfällig für Angst auf einem Stamm wie CD1, vorausgesetzt, dass der Phänotyp untersucht wird über unterschiedliche Hinter Stämme erhalten.
Die größte Beschränkung auf IUE ist die inhärente Variabilität zwischen Elektroporationen. Jede elektroporiert Gehirn unterscheidet aufgrund von Variationen in Injektionsvolumen Defibrillationselektroden, Paddle Kontakt und Embryoalter. Da Nadeln sind variabel, ist es nicht möglich, ein festes Volumen einzuspritzen - vielmehr die Untersutigator muss die Größe der grünen Fleck annähernd ähnliche Mengen an alle Embryonen zu liefern. Entsprechend werden, da der Embryo in ein mit Flüssigkeit gefüllter Beutel schwimmen, ist es nicht möglich, den Ort und die Orientierung der Schaufeln über den Kopf des Embryos systematisch zu messen, wie für stereotaktische Injektionen erfolgt. Schließlich können kleine Unterschiede in der embryonalen Alter erheblichen Auswirkungen auf die Versuchsergebnisse haben. Aus diesem Grund wird ein Vergleich zwischen Wurf empfohlen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Square Wave Electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Electroporator only – buy cables separately (45-0204) |
| 1250FS Footswitch for ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | Foot paddle is necessary for hands-free electroporation |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5mm) 45-0488 (7mm) | Platinum forcep style electrodes |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Holds the pulled needle |
| Universal Capillary Holder | Eppendorf | 920007392 | Connects griphead to tube |
| Injection Tube | Eppendorf | 920007431 | Connects capillary holder to Femtojet |
| Foot Control | Eppendorf | 920005098 | Foot paddle for hands-free injection |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Tips for loading the pulled capillary tubes |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Non-toxic dye |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | For trimming the needles |
| Bonn Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Straight |
| Colibri Retractors | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 | For 7mm clips |
| Castroviejo Needle Holder | Medical Tools | SNH-6737 | Straight, with lock |
| Needle Puller | Narishige | PC-10 | For pulling microcappillaries |
| Microcapillaries | Drummond | 1-000-800 | 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes |
References
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