Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Induksjon av Protein Sletting Gjennom Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/51983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

Abstract

Genetisk sletting hjelp av Cre-Lox system i transgene mus linjer er et kraftig verktøy som brukes for å studere protein funksjon. Imidlertid, bortsett fra i meget spesifikke Cre-modeller, fører delesjon av et protein gjennom et vev eller cellepopulasjon ofte komplekse fenotyper som følge av flere samvirkende mekanismer. Bestemmelse av hvorvidt en fenotype som skyldes forstyrrelse av en celle autonom mekanisme, som er iboende i den aktuelle celle, eller fra et ikke-cellestyrte mekanisme, noe som ville resultere i svekkelse av at cellemiljø, kan det være vanskelig å skjelne. Å få innsikt i protein funksjon i en in vivo sammenheng, i utero elektroporering (iue) gjør genet sletting i en liten undergruppe av celler i å utvikle cortex eller annen valgt hjernen regionen. Iue kan brukes til å målrette bestemte hjerneområder, inkludert rygg telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, eller ganglie eminense. Dette letter observasjon of konsekvensene av celle autonome genet sletting i forbindelse med et sunt miljø. Målet med denne protokollen er å vise hvordan iue kan brukes til å analysere en defekt i radial migrasjon i en floxed transgen muse linje, med vekt på å skille mellom cellestyrte og ikke-celle autonome effekter av protein sletting. Ved å sammenligne den fenotype som følge av genet delesjon innen hele cortex versus iue-mediert genet delesjon i en begrenset cellepopulasjon, større innsikt i proteinfunksjon i hjernens utvikling kan oppnås enn ved å bruke enten teknikk isolert.

Introduction

Radial migrasjon er en sentral prosess for tidlig kortikal utvikling. Den avhenger av en rekke cellestyrte faktorer, slik som korrekt mitotisk utgang og neuronal differensiering, celle polaritet, regulering av cytoskeletal dynamikk og ekspresjon av transmembranreseptorer, så vel som ikke-cellestyrte faktorer, slik som dannelsen av den radielle glial stillaset og sekresjon av trekkende veiledning molekyler 1-3. Siden avbrudd av noen av disse mekanismene kan svekke neuronal migrasjon i en transgen musemodell 4-8, bestemme den underliggende årsaken til en defekt i migrasjon kan være en kompleks og vanskelig prosess. I utero elektroporering (iue) kan brukes til å utfylle og forenkle tolkning av fenotypen av en genetisk knock-out modell og dermed belyse viktige mekanismer som kreves for radiell flytting 7,9-11.

I utero elektroporering (iue) er den prosessen der en plasmid carryi ng både et gen av interesse, og en reporter sprøytes inn i ventrikkelen i hjernen hos en mus eller rotte embryo og deretter trekkes inn i cellene som kler ventrikkel ved bruk av en elektrisk strøm 12-14. Dette gjør det mulig for undersøkeren å analysere effekten av opp- eller nedregulering av et gen av interesse i utvikling og funksjon av nerveceller elektroporerte. Etter iue, kan hjernen bli behandlet for immunhistokjemi 7,9-11, elektrofysiologi 15 eller cellekultur 16,17. Den store fordelen med iue er at det åpner for svært spesifikk manipulering av genuttrykk. Videre kan iue anvendes for å målrette et bestemt område av utviklingen av hjernen ved et rettet strøm (figur 2). Iue kan også brukes for å målrette en bestemt celletype ved injeksjon av plasmider som bærer gener under kontroll av forskjellige promotere eller plasmid aktiveringssystemer (tetracyklin-indusert genekspresjon er et eksempel) 10,18-21.

jove_content "> iue kan brukes i forbindelse med Cre-Lox-formidlet gen excision system 7-9,11,22. Et plasmid inneholdende et gen som koder for meldingen for Cre-protein kan elektroporert inn i et foster homozygote for floxed allelet ( hvor genet eller en bestemt DNA-regioner er flankert av to loxP-seter for Cre-formidlet DNA-rekombinasjon). Cre vil da indusere rekombinasjon av genet av interesse spesielt i elektroporerte nevrale forløpere, generering av et knock-out av floxed allele.The virkning protein knockdown på nevral migrasjon og utvikling innen individuelle nevroner kan deretter bli undersøkt. Elektroporering av Cre induserer rekombinasjon i bare en liten populasjon av angrepne celler, slik at den understøttende miljø intakt. I motsetning til dette, vevsspesifikke ekspresjon av Cre under kontroll av en celletype spesifikk promoter, skjer gjennom hele vev slik at både migrere neuroblasts og miljø omgivelsene kan bli påvirket. Dermed juxtaposition av disse to tilnærmingene kan avgjøre om en gitt migrasjon mangelen skyldes celle autonome eller celle ikke-selvstyrte mekanismer. Defekt migrasjon i både eksperimentelle systemer tyder på at de observerte fenotype resultater fra en celle autonom mekanisme; normal migrering etter elektroporering av Cre med defekt migrasjon i en vevsspesifikk Cre-modellen indikerer at genet av interesse er som virker gjennom en ikke-cellestyrte mekanisme.

Iue kan også brukes til å utføre redningsforsøk ved electroporating potensielle samvirkende gener i knock out dyr 7,9,10. For eksempel kan en undersøker forsøker å redde en migrering fenotype i en transgen modell av electroporating en nedstrøms mål, og å bestemme om migrering feilen er rettet opp i elektroporerte neuroner. Dette har den ekstra fordelen at en vellykket redningsaksjon indikerer at normal migrasjon kan gjenopprettes ved å manipulere protein uttrykk i en specific neuron, selv om det omgivende miljøet er fremdeles mangelfull for den måls genet. Igjen, er denne tilnærmingen mer tid og kostnadseffektivt enn å krysse eller generere transgene linjer, med den ekstra fordelen av å avgjøre om det defekte mekanismen er celle autonome.

Iue kan brukes til å spore migrerer neuroner ved elektroporering av et reporter-plasmid inn i knock out embryoer (figur 4C). Som bare neuronene lining ventrikkel ved tidspunktet for kirurgi blir elektroporert 17, kan iue brukes til å følge neuroner født på et bestemt tidspunkt med fordelen av visualisering av deres morfologi in vivo.

Endelig er det mulig å bruke iue å målrette områder av hjernen som medial eller rygg telencephalon, hippocampus eller ganglie eminence (figur 2). Dette gir forskerne makt til å undersøke gen-funksjon i et bestemt område uavhengig av komplikasjoner resultating fra protein knockdown i nabostrukturer.

Retinoblastom protein (pRb), p107 og p130 omfatter lommen protein familie og er godt etablert regulatorer av cellesyklus exit. Men det er økende bevis for at disse proteinene også regulere cellesyklus uavhengige aspekter av nevral utvikling. Som vi tidligere har vist, pRb og p107 spille en avgjørende rolle i både tangential 4,23 og radial migrasjon 6. Her viser vi rollen som lomme protein familiemedlemmer pRb og p107 på nevrale migrasjon 6 for å eksemplifisere bruken av i utero elektroporering av Cre i en transgen modell. Oppsummert gir iue en kraftig måte å analysere cellestyrte effekter av genet sletting (eller overekspresjon). Når det kombineres med vevsspesifikk knock out-modeller, kan iue gi ytterligere informasjon om mekanismene som kontrollerer nevrale migrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle forsøkene ble godkjent av University of Ottawa Animal Care etikkutvalg, å følge retningslinjene i den kanadiske Council on Animal Care.

1. Pre-kirurgisk Forberedelse og Materialer

  1. Plasmid Forberedelse:
    1. Forberede plasmider ved hjelp av Qiagen MegaPrep henhold til produsentens protokoll. Innoculate minst 400 ml LB-næringsløsning med transformerte bakterier for å sikre et høyt DNA-utbytte og inkuberes over natten.
    2. Resuspender plasmidet i 100-200 ul TE til en sluttkonsentrasjon på minst 5 pg / mL. Delmengde DNA og oppbevares ved -20 ° C. Hvis konsentrasjonen er for lav, ikke utfelles og resuspender da dette kan legge urenheter. Starte på nytt med en ny forberedelse.
    3. Før kirurgi, fortynne et enkelt plasmid (Cre-GFP for eksempel) til 2 ug / ul i sterilt vann med 1 mL av 0,1% (w / v) Fast grønt fargestoff per 10 eller 20 pl av plasmid fortynnet løsning. Hvis GFPog genet av interesse er å ko-elektroporert på separate plasmider, injisere GFP plasmid, og plasmidet som bærer genet av interesse i et forhold på 1: 4 for å maksimere sannsynligheten for at alle celler som er merket med GFP er co-elektroporert med både plasmider.
  2. Trekk glass microcapillary rør (1 mm ytre diameter - heretter referert til som nåler) på en standard nål avtrekker, ved hjelp av et enkelt trinn trekk ved 62 ° C.
  3. Autoklav en kirurgisk pakke som inneholder følgende: nål holdere, sår retractor, tang, saks for kirurgi, saks for nåler, stiftemaskin, stifter, gasbind, sår dekker, kirurgiske gardiner (figur 1A, B; Materialer Table).
  4. Samle andre nødvendige verktøy: Electroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 eller 7 mm), saltvann, sutur, 5 ml sprøyte (Materialer Table).

2. Forbered Mouse for kirurgi

  1. For smertebehandling, injisere en tidsbestemt-pregnant mus med buprenorfin (0,05 mg / kg kroppsvekt) en time før operasjonen. Bruk denne protokollen til mus timet alt fra embryonale dag 12.5 (E12.5) til E17.5.
  2. Bruk microloader pipettespisser til back-load trakk nåler med plasmidet løsning. Ikke fyll helt inn tuppen av nålen ennå da dette vil føre til at nålen tettes.
  3. Bedøver musen med 2-5% isofluran gass med en L / min O 2. Når immobile, plasserer i ansiktsmaske og bruke salve til øynene for å hindre uttørking. Injiser med 1 ml saltvann (0,9% NaCl) subkutant i ryggen.
    MERK: Når du arbeider med isofluran gass, bruk en gass åtseldyr å gjenerobre overflødig gass og hindre den fra å rømme inn i rommet.
  4. Barbere magen. Vask magen med Chlorohexadine skrubb, skyll med vann, og påfør en endelig prep løsning av chlorohexadine og 70% etanol. Cover mus med steril drapere eller gasbind å dekke pels, men la magen eksponert (figur 1C, D).

I utero Electroporation

  1. Lage et snitt i huden over magen mellom de lavere spener. Trekk huden vekk fra den underliggende muskel lag ved å rive av bindevev, og deretter skjære gjennom bukhinnen inn i bukhulen langs linea alba. Sett såret rullen til å trekke kantene av såret fra hverandre.
  2. Fjerne livmor fra bukhulen og legge den ut som vist (figur 1E).
    1. Hvis forskjellige valpene er å bli injisert med forskjellige plasmider (som GFP vs. GFP med genet av interesse), telle valpene på hver side og bestemme hvilke og hvor mange det skal injisere med hvert plasmid. Erstatte den ene siden av livmoren tilbake i magen for å holde embryoene varme og smøres. Umiddelbart fukte den eksponerte livmor med saltvann (helst varmes opp til kroppstemperatur).
    2. Hvis injisere alle unger med samme plasmid (for eksempel når injisere Cre-GFP i transgene embryoer) only fjerne en horn av uterus på en gang.
  3. Sett en lastet nål i grep hodet på injeksjonsstav og nøye kutte spissen med et par små kirurgiske saks eller fin pinsett. Skjær tuppen slik at nålen holder seg så lenge som mulig samtidig gir væske kan passere (Figur 1Ji-iv).
    1. Juster lengden på injeksjon (i sekunder) og injeksjon press på microinjector slik at en liten, men likevel lett synlig dråpe 0,1-0,2 ul vises på spissen av nålen når foten padle trykkes. Holde volumet av denne dråpen så konsekvent som mulig mellom ulike nåler.
      MERK: Dette trinnet er avgjørende for embryo overlevelse (se diskusjon).
    2. Bruk følgende injeksjon parametere for Femtojet: injisere trykk (pi) = 250-300 hPa; injeksjon tid (ti) = 0,8-1,2 sekunder; kompensasjon press = 10-50 hPa. Juster om nødvendig disse parameterne for å imøtekomme variasjon mellom nålene.
  4. Svelge et embryo og forsiktig plassere den på ryggen, hodet vippes oppover (figur 1F).
    MERK: Dette kan kreve å snu eller flytte fosteret; være forsiktig med å bruke for mye press og unngå ruptur av fostersekken mens manipulere embryoet.
  5. Når embryoet er på plass, finner ventrikkel, som viser som et halvmåneformet skygge parallelt med sagittal sinus. Trykk på nålespissen til livmoren over ventrikkelen i en liten vinkel og veilede nålen gjennom livmorveggen. Hvor mye press som kreves avhenger av skarphet av nålen. Skyve nålen gjennom cortex inn i ventrikkelen.
    MERK: Selv om det er sjelden noen ekstra påviselig motstand, embryoet hode er ofte skjøvet bort litt og deretter recoils som nålen passerer gjennom cortex i ventrikkelen.
  6. Pump foten padle for å injisere plasmid løsning. Fortsetter å pumpe inntil et grønt område er synlig og er i overensstemmelse med denbueformen av ventrikkelen (figur 1G). Hos unge embryo (E12.5 til E14.5) fargestoffet vil ofte diffus i kontralateral ventrikkel.
    MERK: antall pumper avhenger av diameteren av nålespissen, i en alder av embryoet (og resulterende størrelse på ventrikkelen) og den ønskede injeksjonsvolum. Hold volum injisert så konsekvent som mulig mellom embryoer.
  7. Injisere tre eller fire embryoer. Hold alle utsatte embryoer fuktige med saltvann gjennom hele prosedyren.
  8. Går tilbake til de første embryoer injisert og plassere elektrodene, slik at den positive elektrode vil trekke plasmidet inn i det ønskede område av hjernen (figur 1 H). Vinkel den negative elektrode, slik at den korteste bane mellom elektrodene passerer direkte gjennom strukturen målrettet for elektroporering (figur 2).
  9. Når padleåre er på plass, gjelder sjokket. Avhengig av alder og størrelse på embryoene, bruker fem pulser på 35-50 V (se Tstand 1). Bruke følgende electroporation parametere: pulslengde på 5 msek med en pulsintervall på 950 ms. Gjenta med alle injisert embryoer.
  10. Skjær tuppen av ny pre-lastet nål som i trinn 3.3 som siste nål sannsynlig tørket og tett under trinn 3.9. Injisere det neste settet med tre eller fire embryo med enten samme plasmid eller en annen plasmid og deretter bruker sjokket som i trinn 3.9. Når alle valpene i den ene siden av livmoren er injisert, må du fjerne den andre side av livmoren fra kvinnens underliv og deretter erstatte det utfylte side for å holde den varm.
  11. Returnere begge sider av livmoren til kvinnen er forsiktig med å holde overflaten fuktig med saltvann og ikke bruke for mye press for å hindre traumer til fosterblærer. Sutur muskelen laget lukkes med en enkel sammenhengende sting. Stift huden stengt. Hvis stifter er ikke tilgjengelig, sutur huden med en enkel avbrutt sting. (Figur 1I)
  12. Mens suturing, gradvis skru ned isofluran å la den gravide kvinnens anestesi å lysne.
    MERK: Dette vil fremskynde opphisselse av demningen etter operasjonen er fullført; holde den kvinnelige bedøvet for så kort tid som mulig vil forbedre embryo overlevelse. Total tid kirurgi, som starter når hunnen er først bedøvet, bør være omtrent 30 min.

4. Ettervern

  1. Plasser sutureres kvinne i en inkubator eller på en varmepute for å gjenopprette fra anestesi. Bed henne på rent sengetøy og plassere en standard gjenoppretting gel i buret opprettholde hydrering. For smertebehandling etter kirurgi, gi de kvinnelige tre doser av buprenorfin (0,05 mg / kg kroppsvekt) ved 8 timers intervaller etter operasjonen, og deretter ytterligere fire doser med 12 timers intervaller.

5. Høsting Brains

MERK: Brains kan høstes i alle aldre opp til voksen alder. Gjelder følgendefor å samle hjerner før fødselen. Oppmerksom på at når valpene er født, er rekkefølgen i livmoren tapt, så enten hver valp i kullet må injiseres med samme plasmid, eller en annen metode for å skille mellom kontroll og forsøksdyr må utarbeides.

  1. Forbered kaldt (4 ° C), filtrert 4% Paraformaldehyde (PFA) før euthanizing kvinne.
  2. Avlive den kvinnelige ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av en dødelig dose av natriumpentobarbital (100 mg / kg kroppsvekt) og skåret opp buken. Trekk ut begge sider av livmor og legge ut så når valpene ble først injisert.
    1. I det tilfelle hvor alle valper mottok det samme plasmid, slik som ved injeksjon i Cre en transgen kull, er embryo rekkefølge ikke er viktig, og derfor kuttet livmoren ut av hunn og plasser i PBS.
    2. Hvis valpene ble injisert med forskjellige plasmider, sørg for å finne hver valp, og bemerker noen døde valper, og finne ut hvilke som ble injisert med kontroll og experimental plasmider før du fjerner livmoren fra hunnen. Vær nøye med å holde styr på hvilken valp som tilhører hvilken gruppe etter at livmoren er i PBS.
  3. Fjern hver valp individuelt, halshogge med skarp saks eller et barberblad og plassere hodet i PBS. I tilfelle av transgene mus, samle vevsprøver for genotyping og holde hvert hode separat, for eksempel i en 12-brønns plate.
  4. Under en dissekere omfang, fjerne hjernen fra skallen, være forsiktig med å nick cortex eller rive midtlinjen. Ved hjelp av en fluorescerende mikroskop, sjekk for å se om hjernen har en GFP + patch, noe som indikerer at de ble elektroporert hell.
  5. Fix hjerner etter nedsenking i PFA ved 4 ° C over natten.
    MERK: Sjekk hjerner for uttrykk av GFP før fiksering siden PFA slukker ofte signalet.
  6. Cryoprotect hjerner gjennom nedsenking i 20% sukrose i minst tre dager før frysing. Bruke en sukrosegradient på 10%, 15% og 20% ​​(24 timer i hver løsning) to forhindre vevsskade som følge av osmotisk trykk. Oppbevar frosset hjerner ved -80 ° C og kuttet på en kryostat ved 10-14 mikrometer tykke seksjoner.

6. Co-farging med anti-GFP

MERK: Hvis er nødvendig for å co-flekken med anti-GFP antigen henting, er det viktig å bruke en mild antigen henting protokoll som ikke går ut over GFP signal. Noen antigen protokoller for henting er for tøffe til å bruke i forbindelse med GFP flekker (selv med et antistoff mot GFP). En grunnleggende sitronsyre forbehandling før påføring av det primære antistoff er vellykket for de fleste 24 epitoper.

  1. Lag en 0,01 M løsning av sitronsyre i DDH 2 O. pH til 6 ved hjelp av en kalibrert pH-meter.
  2. Varmesitronsyre i fargings kammer i mikrobølgeovn eller vannbad til sitronsyre når 75-80 ° C. Sett lysbilder i farging kammeret for 10-15 min. Opprettholde temperaturen så stabil som mulig.
  3. Vask slides i PBS3x i 3 minutter ved romtemperatur. Påfør den primære antistoff og fortsette med farging i henhold til en standard protokoll.
  4. Validere Cre mediert excision av co-merking for GFP og genet av interesse å bekrefte slå ned (figur 3A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

To av de viktigste utfordringene i å opptre i utero electroporations er 1) å forebygge embryoletalitet og 2) å redusere variasjonen mellom electroporations. En av de viktigste faktorene i å forebygge dødelighet er nål kvalitet, som sløve nåler påføre mer skade på fosteret. Ved skjæring av nålen, holder spissen så lenge som mulig mens det fremdeles tillater en synlig dråpe på 0,1-0,2 pl av fluid som skal vises etter en pumpe av foten åre (figur 1J). Hvis nålen er for kjedelig eller skaftet for kort, kan den resulterende vevsskade drepe fosteret. Derimot, hvis tuppen av nålen er for fin, vil det ta for lang tid å injisere tilstrekkelig plasmid volum; forlater nålen i hjernen for lenge årsaker skade på grunn av uunngåelig vibrasjoner av undersøkerens hender og små rotasjoner av embryo. Videre bruker en microbeveler å lage nåler med en skarp, skrå tips for å tillate injeksjoner i yngre, Mer skjøre embryoer, selv om dette ikke bør være nødvendig for embryoer E13.5 og eldre.

Stress nivået av den gravide kvinnen er en annen viktig faktor som påvirker foster overlevelse. Jo høyere demningen stressnivå, jo mer sannsynlig at hun vil avbryte kullet. Av denne grunn er det viktig å minimalisere anestesi tid og endre huset så lite som mulig før og etter operasjonen. Bakgrunnen stammen kan også påvirke spenningsnivå, og det kan være nødvendig å outcross kolonier utsatt for angst mot en stamme som CD1, forutsatt at fenotypen som skal undersøkes blir opprettholdt på tvers av forskjellige bakgrunns-stammer.

Den største enkelt begrensning til iue er den iboende variabilitet mellom electroporations. Hver elektroporert hjerne er annerledes på grunn av variasjoner i injeksjonsvolum, padle plassering, padle kontakt og embryo alder. Siden nåler er variabel, er det ikke mulig å injisere et fast volum - heller de investigator må tilnærme størrelsen på den grønne lappen å levere tilsvarende beløp til alle embryoer. Likeledes, fordi embryoet er flytende i en fluidfylt sekk, er det ikke mulig å systematisk måle plasseringen og orienteringen av skovlene over fosteret hode, som er gjort for stereotaktisk injeksjon. Endelig kan små forskjeller i embryonale alder har signifikant effekt på eksperimentelle resultater. Av denne grunn blir sammenligning mellom kullsøsken anbefalt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Square Wave Electroporator BTX Harvard Apparatus 45-0052 Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830 BTX Harvard Apparatus 45-0211 Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm) Platinum forcep style electrodes
Femtojet Eppendorf 920010504 Microinjector
Griphead 0 Eppendorf 920007414 Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder Eppendorf 920007392 Connects griphead to tube
Injection Tube Eppendorf 920007431 Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control Eppendorf 920005098 Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit Qiagen 12181 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252-5G Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors Fine Science Tools 14084-09
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10 Straight
Colibri Retractors Fine Science Tools 17000-03
Stapler Fine Science Tools 12031-07 For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder Medical Tools SNH-6737 Straight, with lock
Needle Puller Narishige PC-10 For pulling microcappillaries
Microcapillaries Drummond 1-000-800 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
  2. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).
  3. Wu, Q., et al. The dynamics of neuronal migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).
  4. McClellan, K. A., et al. Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions. Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).
  5. Nguyen, L., et al. P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex. Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).
  6. Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis. Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).
  7. Hashimoto-Torii, K., et al. Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex. Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).
  8. Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse. Neural Dev. 6, (2011).
  9. Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors. J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).
  10. Heng, J. I., et al. Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2. Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).
  11. Alfano, C., et al. COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression. Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).
  12. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
  13. Dixit, R., et al. Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  14. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  15. Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).
  16. Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro. Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).
  17. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J. Vis. Exp. (44), (2010).
  18. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  19. Miyagi, S., et al. The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells. Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.
  20. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).
  22. Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. targeting in mice: a review. Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).
  23. Ferguson, K. L., et al. A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration. EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).
  24. Lagace, D. C., et al. Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis. J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).
  25. Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons. J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).
  26. Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression. Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.
  27. Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).

Tags

Developmental Biology , hjernens utvikling nevrale migrasjon transgene celle autonome musemodell
Induksjon av Protein Sletting Gjennom<em&gt; I Utero</em&gt; Electroporation Definere Underskudd i Neuronal Migrasjon i transgene Modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Svoboda, D. S., Clark, A., Park, D.… More

Svoboda, D. S., Clark, A., Park, D. S., Slack, R. S. Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models. J. Vis. Exp. (95), e51983, doi:10.3791/51983 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter