Abstract
Transgenik fare hatları Cre-Lox sistemini kullanarak Genetik silme protein fonksiyonunu incelemek için kullanılan güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, çok özel Cre modellerinde dışında, bir doku veya hücre popülasyonu içinde bir proteinin silme genellikle birden fazla etkileşim mekanizmalardan kaynaklanan karmaşık fenotiplere yol açar. Söz konusu, ya da hücrenin çevre düşüklüğü kaynaklanabilecek olmayan bir hücre özerk bir mekanizma, gelen hücreye özgü bir hücre özerk mekanizmasının bozulması bir fenotip sonuçları, ayırt etmek zor olabilir olup olmadığını belirleme. Utero elektroporasyon, bir in vivo bağlamda protein işlevi anlamak için (İUE), gelişmekte olan korteks ya da seçilen diğer beyin bölgesi içindeki hücrelerin küçük bir alt grubu içerisinde, gen silme sağlar. İUE sırt telencephalon medial telencephalon, hipokampus veya ganglionik eminensinden da dahil olmak üzere spesifik beyin alanları, hedef için kullanılabilir. Bu gözlem o kolaylaştırırsağlıklı bir çevrede bağlamında hücre özerk gen silme sonuçları f. Bu protokolün amacı, İEÜ protein silme hücre özerk olmayan hücre özerk etkileri ayırt üzerinde durularak, floxed transgenik fare doğrultusunda radyal göç bir kusur analiz etmek nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Beyin gelişiminde proteinin işlevi sınırlı hücre popülasyonunda İUE aracılı gen silme karşı tüm korteks içinde gen silme kaynaklanan fenotip, daha iyi bir fikir karşılaştırarak izolasyonu ya tekniği kullanılarak daha yüksek verim elde edilebilir.
Introduction
Radyal göç erken kortikal gelişim merkezi bir süreçtir. Bu tür doğru mitotik çıkış ve nöronal farklılaşması, hücre polarite, sitoskeletal dinamikleri ve zar-ötesi reseptörlerin ekspresyonunun düzenlenmesini, hem de bu tür bir radyal glial iskele oluşumu olmayan hücre otonom faktörleri ve hücre otonom faktörler, çeşitli bağlıdır göçmen rehberlik salgılanması 1-3 molekülleri. Bu mekanizmaların herhangi birinin bozulması beri karmaşık ve zor bir süreç olabilir göç bir kusur yatan nedenini belirlemek, bir transgenik fare modelinde 4-8 nöronal göç bozabilir. Utero elektroporasyon (İEÜ) olarak tamamlayacak ve basitleştirmek için kullanılabilir böylece genetik knock-out model fenotip ve yorumlanması radyal göç 7,9-11 için gerekli önemli mekanizmaları aydınlatmak.
Utero elektroporasyon (İEÜ) süreci olan bir plazmid carryi tarafından İlgili bir geni ve bir raportör hem ng bir fare veya sıçan embriyo beyninde ventrikül içine enjekte edilir ve daha sonra bir elektrik akımı 12-14 kullanımı ile ventrikül astar hücreleri içine çekilir. Bu araştırmacı yukarı veya geliştirme ya da Electroporated nöronların fonksiyonu ilgi bir gen düzenlenmesi aşağı etkisini analiz etmeyi sağlar. İEÜ sonra, beyinleri immunohistokimyasal 7,9-11, elektrofizyoloji 15 ya da hücre kültürü 16,17 için işlenebilir. İEÜ büyük avantajı, bu gen ekspresyonunun yüksek oranda spesifik müdahale edilebilmesini sağlar olmasıdır. Ayrıca, İUE yönlendirilmiş bir akım (Şekil 2) boyunca gelişen beynin belirli bir bölgeyi hedef için kullanılabilir. İUE çeşitli promotörler ya da plazmid tahrik sistemleri kontrolü altındaki genleri taşıyan plazmid enjeksiyonu yoluyla, belirli bir hücre türü hedef için kullanılabilir 10,18-21 (tetrasiklin ile uyarılan gen ifadesi bir örnektir).
> İUE Cre Lox aracılığıyla gen eksizyon sistemi 7-9,11,22 ile bağlantılı olarak kullanılabilir jove_content ". Cre proteini için mesaj kodlayan bir gen içeren bir plazmid floxed alel için bir embriyo homozigot (elektroporasyona edilebilir olup, burada gen veya belirli DNA bölgeleri Cre aracılı DNA rekombinasyon, iki loxP sitelerinin) tarafından kuşatılmıştır. Cre daha sonra, spesifik elektroporasyona sinir ön ilgi konusu genin rekombinasyona neden olacaktır, ve floxed allele.The etkisinin bir knock-out üretilmesi sinir göç ve bireysel nöronlar içinde gelişimine demonte protein daha sonra incelenebilir. Cre Elektroporasyon sağlam destek ortamı terk etkilenen hücrelerin sadece küçük bir popülasyonda rekombinasyonu neden olur. Bunun tersine, belirli bir hücre tipinin kontrol altında Cre dokuya özgü sentezleme promotör, tüm dokusu boyunca meydana hem göç Nöroblastlar ve çevresini etkilenmiş olabileceğini. Böylece, Jux böyleceBu iki yaklaşımın taposition verilen göç kusur özerk ya da hücre dışı özerk mekanizmaları hücre bağlı olup olmadığını belirleyebilir. Her iki deneysel sistemlerde Arızalı göç anlaşılacağı bir hücre özerk mekanizması gözlemlenen fenotip sonuçları olduğunu; bir doku-spesifik Cre modelinde kusurlu göç Cre elektroporasyonu, aşağıdaki normal bir göç ilgi konusu gen, bir hücre olmayan bağımsız bir mekanizma yoluyla etki olduğunu gösterir.İEÜ da nakavt hayvanlar 7,9,10 içine potansiyel etkileşim genleri electroporating kurtarma deneyleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, bir araştırmacı bir alt hedef electroporating ve göç kusur Electroporated nöronlar giderilmiştir ise belirleyerek bir transgenik modelinde bir göç fenotip kurtarmak için çalışabilir. Bu başarılı bir kurtarma normal bir göç SPE protein ifadesini manipüle tarafından restore edilebileceğini belirtir ek yararı vardır, spesifik nöron, çevredeki ortam hala hedeflenen gen için eksik olsa. Yine, bu yaklaşım daha fazla zaman ve kusurlu mekanizma hücre özerk olup olmadığını belirlemek yararı, transgenik çizgiler kapısı veya oluştururken daha maliyetli olduğunu.
İUE nakavt embriyolar (Şekil 4C) bir haberci plazmid elektroporasyonu yoluyla nöronlar göç izlemek için kullanılabilir. Ameliyat sırasında ventrikül astar sadece nöronlar 17 elektropore olarak, İEÜ in vivo morfolojisi görselleştirme avantajı ile belirli bir zamanda doğmuş nöronlar takip etmek için kullanılabilir.
Son olarak, bu tür orta veya dorsal telencephalon, hipokamp veya ganglionik eminensinden (Şekil 2) gibi beyin bölgeleri hedef IUE kullanmak mümkündür. Bu araştırmacılara komplikasyon sonuç belirli bir alanda bağımsız gen fonksiyonunu araştırmak için güç verirkomşu yapılarda demonte proteinden ing.
Retinoblastoma proteini (pRb), p107 ve p130 cep protein ailesini oluşturan ve iyi hücre döngüsü çıkış regülatörleri kurulmuştur. Bununla birlikte, bu proteinler, aynı zamanda, nöral gelişimi, hücre döngüsü bağımsız yönlerini düzenleyen dair artan kanıtlar vardır. Daha önce görüldüğü gibi, pRb ve p107 hem teğet 4,23 ve radyal göç 6 önemli bir rol oynamaktadır. Burada, biz bir transgenik modeli Cre utero elektroporasyon kullanımını örneklendirmek için sinir göç 6 cep protein aile üyeleri pRb ve P107 rolünü göstermektedir. Özetle, İEÜ gen silme (veya aşırı ekspresyonu) hücre özerk etkilerini analiz güçlü bir yol sağlar. Modelleri nakavt özel dokusu ile kombine edildiğinde, İEÜ nöral göçü kontrol mekanizmaları ile ilgili ek bilgi sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm deneyler Hayvan Bakımı Kanada Konseyi Rehberi bağlı kalarak, Ottawa Hayvan Bakım etik kurul Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Ön cerrahi hazırlanması ve Malzeme
- Plazmid hazırlanması:
- Üreticinin protokolüne göre Qiagen MegaPrep kullanılarak plazmidler hazırlayın. Yüksek DNA verimi sağlar ve bir gece boyunca inkübe etmek, transforme edilen bakterilerden LB et suyu, en az 400 ml aşılanmasında.
- En az 5 ug / ml'lik bir son konsantrasyona kadar, 100-200 ul TE içinde yeniden süspanse plazmid. -20 ° C'de kısım, DNA ve saklayın. Konsantrasyonu çok düşük ise, çökmez ve bu kirlilikleri ekleyebilirsiniz olarak tekrar süspansiyon. Yeni bir hazırlık üzerine başlayın.
- Ameliyat öncesi% 0.1 seyreltilmiş plazma çözeltisi 10 ya da 20 ul başına (ağırlık / hacim) hızlı yeşil boya 1 ul steril su içinde 2 ug / ml tek bir plazmid (örneğin Kre-GFP) seyreltin. GFP EğerGFP ile işaretlenmiş tüm hücreler hem de-elektroporasyona CO ihtimalini en üst düzeye çıkarmak için 4: ve ilgi konusu genin, GFP plazmidi ve 1 arasında bir oranda ilgilenilen geni taşıyan plazmid enjekte ayrı plasmidler üzerindeki birlikte elektropore edilecekse plazmidler.
- 62 ° C 'de bir tek aşamalı çekme kullanılarak, standart bir iğne çektirmenin - Cam Mikro kapiller tüpler (bundan sonra iğneler olarak adlandırılır 1 mm dış çapında) çekin.
- Aşağıdaki içeren bir cerrahi paketi Otoklav: iğne sahipleri, yara retraktör, forseps, cerrahi makas, iğne için makas, zımba, zımba, gazlı bez, yara örtüleri, cerrahi örtüler (Şekil 1A, B; Malzeme Tablosu).
- Diğer gerekli araçları toplayın: Electroporator, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 veya 7 mm), tuzlu, dikiş, 5 ml şırınga (Malzeme Tablo).
2. Cerrahi Fare hazırlayın
- Ağrı yönetimi için, bir zamanlanmış-p enjektebir saat ameliyat öncesi Buprenorfin (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) ile regnant fare. E17.5 embriyonik gün 12.5 (E12.5) yerden zamanlanmış farelere bu protokolü uygulayın.
- Arka yük için Microloader pipet ipuçlarını kullanın plazmid çözümü ile iğne çekti. Bu iğne tıkalı hale gelmesine neden olacaktır henüz iğne ucu içine tüm yol doldurmayın.
- 1 L / dk O 2 ile% 2-5 izofluran gaz kullanarak fare uyuşturan. Bir kez hareketsiz, yüz maskesi yerleştirmek ve kurumasını önlemek için gözlere merhem uygulayın. 1 ml tuzlu suda arka (% 0.9 NaCl), deri altından enjekte edilir.
NOT: izofluran gaz ile çalışırken, aşırı gaz hatırlamak ve odasına kaçmasını önlemek için gaz süpürücü kullanın. - Karın Tıraş. , Chlorohexadine fırçalayın ile karın yıkayın su ile durulayın ve chlorohexadine ve% 70 etanol son hazırlık çözümü uygulayın. Steril örtü veya gazlı bez ile kapak fare kürk kapsayacak, ancak karın maruz (Şekil 1C, D) terk etmek.
utero Elektroporasyon olarak
- Alt meme arasındaki karın üzerinde deride bir kesi yapmak. Bağ dokusu yırtılarak alttaki kas tabakasından cilt çekin, sonra linea alba boyunca karın boşluğuna periton kesti. Ayrı yara kenarlarını çekmek için yara ekartörünü yerleştirin.
- Karın boşluğundan rahim çıkarın ve gösterilen (Şekil 1E) olarak ortaya koymak.
- Farklı yavrular (örneğin, ilgi konusu gen ile GFP genel GFP gibi), farklı plazmitler ile enjekte edilecek ise, her iki tarafta yavrular sayısı ve her bir plasmid ile kaç enjekte hangilerinin ve karar verirler. Geri sıcak ve yağlanmış embriyolar tutmak için karın içine rahim bir tarafını değiştirin. Hemen serum fizyolojik ile maruz rahim (tercihen vücut sıcaklığına ısıtılmış) nemlendirin.
- Aynı plazmid tüm yavrular enjekte Eğer haftaları (örneğin transgenik embriyolar içine Kre-GFP enjekte olduğu gibi)Y aynı anda rahim bir boynuz çıkarın.
- Küçük cerrahi makas veya ince forseps bir çift ile ucu kesilmiş dikkatle enjeksiyon değnek kavrama kafasına dolu bir iğne koyun ve. Henüz akışkan bir (Şekil 1Ji-iv) geçmesine izin verirken, iğne sürece mümkün kalması ucu kesilir.
- Ayak kürek basıldığında 0.1-0.2 ul küçük ama kolayca görülebilir damlacık iğne ucu görünür şekilde mikropüskürtücü (saniye cinsinden) enjeksiyonu uzunluğunu ve enjeksiyon basıncını ayarlayın. Farklı iğneler arasında mümkün olduğunca tutarlı Bu damlacık hacmini tutun.
NOT: Bu adım, embriyo hayatta (tartışma) için önemlidir. - FemtoJet için aşağıdaki enjeksiyon parametrelerini kullanın: basınç enjekte (pi) = 250-300 hPa; Enjeksiyon süresi (ti) = 0.8-1.2 sn; tazminat basıncı = 10-50 hPa. Gerekirse, iğneler arasında bir farklılaşmanın düzeltileceği bu parametreleri ayarlamak.
- Ayak kürek basıldığında 0.1-0.2 ul küçük ama kolayca görülebilir damlacık iğne ucu görünür şekilde mikropüskürtücü (saniye cinsinden) enjeksiyonu uzunluğunu ve enjeksiyon basıncını ayarlayın. Farklı iğneler arasında mümkün olduğunca tutarlı Bu damlacık hacmini tutun.
- SBir embriyo seçme ve yavaşça arka, yukarı eğimli kafa (Şekil 1F) üzerine yerleştirin.
NOT: Bu dönüm veya embriyo değişen gerektirebilir; Çok fazla baskı uygulamak ve embriyo manipüle ederken amniyon kesesinin yırtılması önlemek için dikkatli olun. - Embriyo yerleştirildikten sonra, sagital sinüs bir hilal şeklinde gölge paralel olarak sunuyor ventrikül bulun. Hafif bir açıyla ventrikül üzerindeki rahim iğne ucu dokunun ve rahim duvarından iğne rehberlik. Gerekli basmç miktarı iğne netlik bağlıdır. Ventrikül içine korteks ile iğne itin.
NOT: nadiren herhangi bir ek saptanabilir direnç olmasına rağmen, embriyonun kafası genellikle biraz uzağa itti ve sonra iğne ventrikül içine korteks geçerken geri teper. - Plazmid çözüm enjekte etmek için ayak raket Pompa. Yeşil alan görünen ve uygun kadar pompalamaya devamventrikül (Şekil 1G) ark şekli. Genç embriyoların (E14.5 E12.5 için) boya genellikle karşı ventrikül içine nüfuz edecek.
Not: pompa sayısı iğne ucu çapına bağlıdır, embriyo (ve karıncığın elde edilen boyutu) ve istenilen enjeksiyon hacmi yaşı. Hacmi tutun embriyolar arasında mümkün olduğunca tutarlı enjekte. - Üç ya da dört embriyolar enjekte edilir. Prosedür boyunca tuzlu su ile nemli tüm maruz embriyolar tutun.
- Geri enjekte ilk embriyoların gidin ve pozitif elektrot beynin (Şekil 1 H) istenen bölgeye plazmid çekecektir böyle kürekler yerleştirin. Açı negatif elektrot için elektrotlar arasındaki en kısa yol elektroporasyon için hedef yapı (Şekil 2) içinden geçer.
- Kürekler yerdesiniz kez, şok uygulanır. Embriyoların yaş ve boyutuna bağlı olarak, 35-50 V 5 bakliyat kullanın (T bkzmümkün 1). Aşağıdaki elektroporasyon parametreleri kullanın: 5 msn darbe uzunluğu 950 msn darbe aralığı ile. Tüm enjekte embriyolar ile tekrarlayın.
- Geçen iğne olasılıkla kurutulmuş ve adım 3.9 sırasında tıkanmış gibi adım 3.3 gibi yeni ön-yüklenmiş iğne ucu kesin. Aynı plasmid ya da farklı bir plazmid ya da üç ya da dört embriyo sonraki resim enjekte edilir ve daha sonra adım 3.9 olarak darbe uygulanır. Rahim bir tarafında tüm yavrular enjekte edildiğinde, dişinin karın rahim ikinci tarafını kaldırın ve daha sonra sıcak tutmak için tamamlanmış tarafı değiştirin.
- Amnion kesesi travma önlemek için çok fazla baskı uygulamak için tuzlu su ile değil, nemli yüzey tutmak için dikkatli olmak kadın rahim her iki tarafını dön. Basit bir sürekli dikiş kullanılarak kapatıldı kas tabakası dikin. Zımba cilt kapattı. Zımba mevcut değilse, basit bir kesintiye dikiş ile cilt sütür. (Şekil 1 H)
- Suturi dang, giderek hamile dişinin anestezi hafifletmek için izin izofluran aşağı çevirin.
NOT: Ameliyat tamamlandıktan sonra bu barajın uyarılma hızlandırmak olacaktır; embriyo yaşam artıracak mümkün olduğunca kısa bir süre için anestezi kadın tutmak. Toplam ameliyat süresi, kadın ilk kez anestezi ne zaman başlayarak, yaklaşık 30 dakika olmalıdır.
4. Sonrası Bakım
- Bir inkübatör veya anestezi kurtarmak için bir ısıtma pedi üzerinde dikildi kadın yerleştirin. Temiz yatak onu yatak ve kafes içinde standart bir toparlanma jel hidrasyon korumak yerleştirin. Cerrahi sonrası ağrı tedavisi için, daha sonra ameliyat sonrası 8 saat aralıklarla, 12 saat aralıklarla dört ek dozlar en Buprenorfin (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) bir kadın üç doz vermek.
5. Hasat Brain
NOT: Brain yetişkinliğe herhangi bir yaş kadar hasat edilebilir. şu geçerlidirdoğumdan önce beyinleri toplamak için. Yavrular dünyaya bir kez, rahim içinde sipariş çöp her yavru ya aynı plazmid ile enjekte edilmelidir, böylece kaybolur, ya da kontrol ve deney hayvanlar arasındaki farklılaşma başka bir yöntem icat gerektiğini unutmayın.
- Soğuk (4 ° C) Hazırlama kadın ötenazi önce% 4 paraformaldehid (PFA) filtre edilmiştir.
- Sodyum pentobarbital (100 mg / kg vücut ağırlığı) öldürücü bir dozda intraperitonal enjeksiyonu ile dişi öldürülür ve açık karın kesti. Rahim iki tarafını çekin ve yavrular başlangıçta enjekte edildiğinde olarak yatıyordu.
- Tüm yavrular gibi bir transgenik çöp içine Cre enjekte ederken aynı plazmid, alınan durumunda, embriyo sırası nedenle PBS içinde kadın ve yersiz rahim kesmek, önemli değil.
- Yavrular farklı plazmid ile enjekte olsaydı, herhangi bir ölü yavrular belirterek, her yavru bulmak için emin olun, kontrol ve experimen enjekte edildi hangilerinin belirlemekkadın rahim çıkarmadan önce tal plazmidler. Yavru uterus PBS içinde hangi grup daha sonra ait olduğu izlemek için dikkatli olun.
- Her biri tek tek yavru çıkarın keskin bir makas veya bir tıraş bıçağı ile başını kesmek ve PBS içinde kafa yerleştirin. Transgenik farelerin durumunda, genotipleme için doku numuneleri toplamak ve bir 12-çukurlu plaka içindeki gibi, ayrı ayrı her bir kafayı tutun.
- Diseksiyon kapsamında, değil nick dikkatli olmak, kafatası korteks beyin kaldırmak veya orta hat gözyaşı. Bir floresan mikroskop kullanarak, başarılı elektropore belirten, beyinleri bir GFP + yama olup olmadığını görmek için kontrol edin.
- Gece boyunca 4 ° C'de PFA içine daldırma ile beyin sabitleyin.
NOT: PFA sık sık sinyal doyurur çünkü önce tespite GFP ifade beyinlerini kontrol edin. - Dondurulmadan önce en az üç gün boyunca% 20 sukroz içinde daldırma yoluyla cryoprotect beyinleri. T sükroz% 10 gradyan,% 15 ve% 20 (her bir çözelti içinde, 24 saat) kullanarakO ozmotik basınca bağlı doku hasarı önlemek. -80 ° C'de dondurulmuş beyinleri saklayın ve 10-14 mikron kalınlığında kesitler bir kriyostat üzerinde kesti.
Anti-GFP ile 6. Ortak boyama
Not: antijen geri alma ko-leke anti-GFP ile gerekli ise, GFP sinyali ödün vermeyen hafif bir antijen geri alma protokolü kullanılması önemlidir. Bazı antijen alma protokolleri (hatta GFP karşı bir antikor ile) GFP boyama ile birlikte kullanmak için çok sert. Önce birincil antikor uygulaması temel sitrik asit ön-işlem, en epitoplar 24 için başarılı olur.
- GKD 2 O. sitrik asit 0.01 M bir solüsyon yapmak bir kalibre edilmiş pH metre kullanılarak 6 pH değerine sahiptir.
- Sitrik asit kadar mikrodalga ya da su banyosu içinde boyanması odasındaki ısı sitrik asit, 75-80 ° C'ye ulaştı. 10-15 dakika boyama odasında slaytlar koyun. Mümkün olduğunca istikrarlı olarak sıcaklığını muhafaza.
- PBS slaytlar yıkayın3x, oda sıcaklığında 3 dakika daha karıştırıldı. Primer antikor uygulayın ve bir standart protokole göre immün devam edin.
- (Şekil 3A) yıkmak onaylamak için GFP eş-etiketleme ve ilgi gen tarafından Cre aracılı eksizyon doğrulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utero electroporations performans birincil sorunlar iki embriyo öldürücü ve 2) electroporations arasındaki değişkenliği azaltarak engelliyor) 1 bulunmaktadır. Künt iğne embriyo daha fazla hasar gibi öldürücü önlemede en önemli faktörlerden biri, iğne kalitesidir. İğneyi keserken hala ayak kürek (Şekil 1J) bir pompa aşağıdaki görünmesini sıvı 0.1-0.2 ul görünür damlacık izin verirken, mümkün olduğunca uzun ucu tutun. İğne çok sıkıcı ya da şaft çok kısa ise, ortaya çıkan doku hasarı embriyo öldürebilir. Iğne ucu kadar ince ise tersine, yeterli plazmid hacmini enjekte çok uzun sürer; nedeniyle araştırmacının elinde kaçınılmaz titreşim ve embriyo hafif dönüşleri çok uzun nedenler hasar için beyinde iğne bırakarak. Ayrıca, genç içine enjeksiyonlar izin keskin, eğimli ipuçları iğne yapmak için bir microbeveler kullanınDaha kırılgan embriyolar, bu embriyolar E13.5 ve yaşlı için gerekli olmamalıdır rağmen.
Hamile kadın stres düzeyi embriyo sağkalımı etkileyen bir başka önemli faktördür. yüksek Baraj stres düzeyi, daha büyük olasılıkla o çöp iptal edecektir. Bu nedenle bu anestezi süresini en aza indirmek ve ameliyat öncesi ve sonrası mümkün olduğunca az konut değiştirmek önemlidir. arka plan suşu da stres düzeyini etkileyebilir ve bu soruşturma kapsamında fenotip farklı arka plan suşları arasında muhafaza olduğunu varsayarak, örneğin CD1 gibi bir zorlanma üzerine anksiyete eğilimli outcross koloniler için gerekli olabilir.
İEÜ tek büyük sınırlama electroporations arasındaki doğal değişkenlik olduğunu. Her Electroporated beyin dolayı enjeksiyon hacmi, kürek yerleştirme, kürek temas ve embriyo yaş değişikliklere farklıdır. Iğneler değişken olduğu için, sabit bir hacim enjekte etmek mümkün değildir - yerine investigator tüm embriyoların benzer miktarlarda sunmak için yeşil yama boyutunu tahmin gerekir. Embriyo sıvı dolu bir kese içinde yüzen çünkü stereotaktik enjeksiyon için yapıldığı gibi benzer şekilde, bu, sistematik olarak embriyonun kafasına kanatların konumu ve yönlenişinin ölçmek mümkün değildir. Son olarak, embriyonik yaş küçük farklılıklar deneysel sonuçlar üzerinde önemli etkileri olabilir. Bu nedenle, littermates karşılaştırılması önerilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Square Wave Electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Electroporator only – buy cables separately (45-0204) |
| 1250FS Footswitch for ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | Foot paddle is necessary for hands-free electroporation |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5mm) 45-0488 (7mm) | Platinum forcep style electrodes |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Holds the pulled needle |
| Universal Capillary Holder | Eppendorf | 920007392 | Connects griphead to tube |
| Injection Tube | Eppendorf | 920007431 | Connects capillary holder to Femtojet |
| Foot Control | Eppendorf | 920005098 | Foot paddle for hands-free injection |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Tips for loading the pulled capillary tubes |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Non-toxic dye |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | For trimming the needles |
| Bonn Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Straight |
| Colibri Retractors | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 | For 7mm clips |
| Castroviejo Needle Holder | Medical Tools | SNH-6737 | Straight, with lock |
| Needle Puller | Narishige | PC-10 | For pulling microcappillaries |
| Microcapillaries | Drummond | 1-000-800 | 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes |
References
- Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).
- Wu, Q., et al.
- McClellan, K. A., et al. Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions. Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).
- Nguyen, L., et al. P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex. Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).
- Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis. Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex. Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).
- Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse. Neural Dev. 6, (2011).
- Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors. J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).
- Heng, J. I., et al. Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2. Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).
- Alfano, C., et al. COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression. Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Dixit, R., et al. Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).
- Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro. Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Miyagi, S., et al. The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells. Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.
- Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).
- Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K.
- Ferguson, K. L., et al. A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration. EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).
- Lagace, D. C., et al. Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis. J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).
- Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons. J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).
- Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression. Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.
- Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).
