Introduction
Es koppeln und Regeneration tissuesis einem themain Ziele der Medizin wegen einer Läsion in einem Gewebe ororgan kann kampfunfähig sein, und in manchen Fällen tödlich ist. In Zusammenhang werden die Gesundheit der Arbeitnehmer und Forscher ständig auf der Suche Techniken, Methoden und Werkzeuge, um neue therapeutische Alternativenzu fördern dort paarRegenerationsProzess von beschädigtem Gewebe. Daher haben Biomedizin auf die Untersuchung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs), insbesondere adulten Stammzellen konzentriert, da diese Zelllinie stellt ein ideales Modell für die Geweberegenerationsprozess zu studieren, aufgrund seines Potenzials an ektodermale, mesodermale und endodermale differen Zelllinien jedoch die Therapie mit MSCs Wirklichkeit werden zu lassen, muss die Charakterisierung thetherapeutic Potential von MSCs durch die Umsetzung neuer Zellkulturtechniken unter Verwendung von Biomaterialien und Zellgerüste, die das gewünschte Verhalten der MSCs in das Wirtsgewebe garantieren begleitet werden.
Protocol
Diese Untersuchung wurde in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki des Weltärztebundes betreffend das ethische Verhalten der Forschung am Menschen durchgeführt und von der Forschung Ethik Board of Facultad de Medicina, UNAM (Projektnummer 101-2012) genehmigt.
1. Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen
- Herstellung von Reagenz
- Bereiten phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Zuschlag mit 1% Antibiotika-Antimykotika-Lösung.
- Bereiten Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, hoher Glucose (HG-DMEM), und gibt 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum-Antimykotikum solution.Sterilize dieses Kulturmedium durch Filtration durch einen 0,2 um Filter.
- Bereiten Sie eine Collagenase II Lösung bei 100 U / ml in HG-DMEM ohne FBS und Antibiotika-Antimykotika-Lösung.
- Sterilisieren Sie die folgenden chirurgischen Instrumenten, die für die Isolierung benötigt werden, durch Autoklavieren: Standard-Scheres, einfache Dissektionszangen, feinPunkt und Zahnzange und eine Skalpellgriff (# 4).
- Isolierung von mesenchymalen Stammzellen humanen Amnionmembran
- Halten Sie die Nabelschnur mit einer Hand und mit der anderen Hand, nehmen Sie den Amnionmembran (AM), die wie eine durchlässige Scheibe aussieht, um ein Fragment von etwa 5 cm 2 zu erhalten. Wenn das Chorion Abschnitt in der Probe vorhanden ist, trennen Sie die zugrunde liegenden Chorion durch manuelle Dissektion als das Chorion Abschnitt ist dicker als die Fruchtblase.
- Rückstände von Blut mit drei Wäschen von 5 ml PBS und Blutgerinnsel entfernen, mit den einfachen Zange. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Uhr mit dem Skalpell, um Fragmente von etwa 0,5 cm 2 zu erzeugen.
- Enzymatische Verdauung von Amnionmembran
- Inkubieren AM mit 5 ml 0,125% Trypsin / 0,5 mM EDTA-Lösung bei 37 ° C für 30 min in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Zentrifuge bei 250xg und 25 ° C für 5 Minuten und entfernen Sie die Trypsin-Lösung von der Überstand verworfen.
- 15 ml Kollagenase Typ II-Lösung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Atmosphäre unter gelegentlichem Schütteln nach Leyva et al. 9
- Unmittelbar nach der Verdauung mit Collagenase II, 15 ml PBS und Zentrifugation bei 250 × g und 25 ° C für 10 min.
- Überstand verwerfen und waschen Sie den Zellpellet mit 15 ml PBS-Lösung und Zentrifuge bei 250 xg und 25 ° C für 15 min. Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Zellpellet in 10 ml HG-DMEM durch leichtes Schütteln.
- Expansion von mesenchymalen Stammzellen
- Seed 2 ml der Zellsuspension (1 x 10 4 Zellen / cm 2) in Kulturflasche, und 2 ml von HG-DMEM und Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Die Beseitigung der nicht-adhärenten Zellen durch Änderung des Kulturmediums nach 5-7Tagen.
- Nach dieser Zeit, ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage für weitere 7-10 Tage, um eine zelluläre Zusammenfluss von 90% zu erhalten.
- Recover die Zellen und Inkubation sie für 5 min bei 37 ° C in einer 5% CO 2 -Atmosphäre mit 0,125% Trypsin / EDTA-Lösung (Trypsinierung).
- Unmittelbar nach Trypsinisierung gesammelt Zellen mit einer Pipette und in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugiert bei 250 g für 5 min.
- Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 10 ml HG-DMEM.
- Kulturzellsuspension in zwei 75 cm 2 Kulturflaschen (5 ml in jeden Kolben) und die Kultur bis zu 90% Zusammenfluss aufrechtzuerhalten.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4.3. bis 1.4.6, bis zum 9. Durchgang oder Subkultur.
- Recover Zellen durch Trypsinisierung wie in den Schritten 1.4.3 bis für die Durchflusszytometrie oder andere Studien 1.4.5.
2. Herstellung der porösen Knochenmatrix Datenträger (NKB)
- Um die NKB Scheiben nass(Durchmesser 12 mm; Dicke 2 mm). Inkubieren jede Platte über Nacht mit 3 ml HG-DMEM ohne FBS in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C, nach Fassina et al 5
- Nach der Benetzungsprozess, setzen Sie die Festplatte in einem 50 ml konischen Rohr und Spin bei 250 xg für 5 min, um überschüssige Kulturmedium zu entfernen. Legen Sie die Festplatte in einer 24-Well-Zellkulturplatte.
- Gib 500 ul der HG-DMEM und Inkubation für 30 min bei 25 ° C. Darauf achten, dass keine Luftblasen auf der NKB Platte, um die richtige Verteilung der Nährstoffe und Zellen begünstigen vorhanden sind.
- Wenn sich Blasen an der Platte festgestellt, schütteln und 300 ul Kulturmedium und Inkubation für 15 min in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Nach dieser Zeit entfernen 300 ul Kulturmedium, das Saugen durch die Wand des Zellkultur und bestätigen, dass sich keine Blasen bilden.
- Legen Sie die Festplatte in einem neuen 24-Well-Platte mit einfachen Zange.
- Saatgut eine Zellsuspension (5 x 10 & sup5 AM-hMSCs in 100 ul DMEM-HG) von drei Subkulturen, die auf der Oberfläche des vorbenetzten Biomaterial Platte und Inkubation für 30 min in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Diesen Schritt langsam und kontinuierlich auf der oberen Fläche des Biomaterials, damit die Zellen mit der Topographie des gesamten Gerüsts zusammenwirken. Hinweis: Dieses Verfahren wird erreicht, 60% der Zellen auf der in der Tabelle 1 gezeigt Biomaterial gebunden.
- 1,5 ml von HG-DMEM bei 37 ° C und halten die Kultur für 3 Tage in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C. Turbulenzen in der Zugabe von Kulturmedium für vermeiden erzeugen Sie nicht, dass die Ablagerung von Zellen auf dem Boden des Kulturplatte Gericht. Dies ist Anfangszeit.
4. Zelloberflächenmarker Charakterisierung von Flow Cytometrie
- Trennen Sie die Zellen aus 9. Subkultur vor der Aussaat sie auf der Matrix Platte. Verwenden Sie 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und befestigen Sie sie für 30 Minuten in eiskaltem 2% Formaldehyd. Nach der Fixierung, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS 0,05%.
- Blockieren nicht-spezifischer Bindung durch Inkubation der Zellen mit 20% Human-Immunglobulin für 3 Minuten auf Eis inkubiert und 0,1 x 10 6 Zellen Aliquots mit Phycoerythrin (PerCP) -konjugiertem MAb gegen CD73, FITC-konjugierten monoklonalen CD90, PE-konjugierte MAb gegen CD34 FITC-konjugiertem MAb CD45 und PE-konjugiertem MAb CD105 für 1 h bei 25 ° C im Dunkeln. Isotyp-FITC-konjugiertem MAb, PE-konjugiertem MAb andPerCP konjugierten MAb wird als negative Kontrollen dienen.
- Berechnung der Expressionsniveaus der Oberflächenmarkern unter Verwendung von Software für die Datenerfassung und -analyse.
5. Cell Adhesion Erkennung durch Rasterelektronenmikroskopie
- Zweimal mit PBS spülen zellScheibenProben bei 3 Tagen Kulturund fixthe Proben mit 4% (v / v) Glutaraldehyd solutionin einer 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer (pH 7,2).
- Vorbereitung der Proben für die mikroskopische Beobachtung, wie zuvor von Rivera-N et al. 10 und Beobachtung mit einem Rasterelektronenmikroskop bei einer elektrischen Spannung von 15 kV und bei einer Vergrößerung von 500X und 2000X.
6. Cell Proliferation Assay
- Zu den Zellplatten-Proben mit 1,5 ml Kulturmedium mit 150 & mgr; l von Vitalfarbstoff (AB) nach Herstellervorgaben und Inkubieren der Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C.
- Sofort nach der Zugabe von AB (0 h) und jeweils 24 h bis zum Erreichen von 7 Tagen nach der Zellkultur wird die Extinktion bei 570 nm mit einer Referenzwellenlänge von 600 nm.
7. koloniebildende Einheit (CFU) 11
- Kultur 100 Zellen pro 100 mm-Gewebekultur Diskin HG-DMEM und Inkubation für 14Tage in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C.
- Waschen der Kultur mit PBS und Fleck mit 0,5% Kristallviolett in Methanol für 5-10 min bei Raumtemperatur.
- Zweimal Waschen Sie die Platten mit PBS und zählen Sie die sichtbaren Kolonien mit einer Zählkammer.
Representative Results
Humane mesenchymale Stammzellen Isolation
Nach der mechanischen Trennung der Uhr aus dem Chorion mit stumpf (Abbildung 1) wurde ein Anhänger Zellpopulation durch Trypsin und Collagenase II Verdauung erhalten. Diese Zellpopulationen in der Kulturschale presenta fibroblastenartige Zellmorphologie nach 3 Tagen nach der Isolierung befestigt ist, wie in der optischen Mikrographie (2A) und die rasterelektronenmikroskopische Aufnahme (2B) .Die Plazenten in dieser Arbeit verwendeten dargestellt wurden aus gesunden Spender erhalten Mütter withprevious informierte Zustimmung.
Zellcharakterisierung mittels Durchflusszytometrie
Die Zellpopulation, die von der Uhr erhaltene war fest an die Oberfläche mesenchymalen Marker CD90 + (93,5% ± 6,85) und CD73 + und CD105 + (79% ± 3,46) reaktiv und zeigte eine negative Reaktion auf hämatopoetischen Marker wie CD34 und CD45. SomitDie AM-hMSCs in dieser Arbeit verwendet wurden mesenchymalen, in der Accor Informationen zuvor von Leyva et al. (Abbildung 3) ausgewiesen. Zusätzlich diese Resultat deckt sich mit den Immunphänotyp Eigenschaften, die von der International Society for Cellular Therapy (ISCT) für mesenchymale Stammzellen etabliert wurden.
Die Zelladhäsion an Knochenmatrix
Die Scan-Aufnahmen zeigen das Verhalten der AM-hMSCs sieben Tage nach der Schichtung auf dem NKB. Die Oberfläche des Biomaterials mit sphärischen Zellen (Tag) und einige Streuzellen anscheinend mit der Rindermatrixoberfläche am siebenten Tag verknüpft sind. Bei höherer Vergrößerung erschienen die Verbreitung Zellen, in engem Kontakt über filipodial Prozesse (FL) (Abbildung 4) sein.
Die Zellproliferation auf Knochenmatrix
Die Ergebnisse der AB-Assay zeigte eine geringe Abnahme der relativen Extinktion u Nissen (RAU) von Rinder-Matrix erhalten (+ Knochenmatrix) nach dem 1. Tag der Inkubation und dann am fünften Tag, das Vorhandensein des Gerüstes induziert eine Erhöhung der Zellproliferation im Vergleich mit der Kultur in der Abwesenheit von Rindergeführt statistisch signifikante Matrix (-bone Matrix) (Figur 5).
Koloniebildende Einheit
Die CFU-Assay ist ein traditionell von Stammzellen. Die AM-hMSCs isoliert in dieser Arbeit erhaltenen seine Fähigkeit, diskrete Kolonien nach 14 Tagen in Kultur bilden.
Abbildung 1: Isolierung von Amnionmembran. (A) Die Nabelschnur (UC) ist mit einer Hand gehalten, um die Region, in der die Amnionmembran erhält identifizieren. (B) Die Amnionmembran (AM) ähnelt einem durchscheinenden Film ohne Blut Innervationen.
Fig. 2: Morphologische Eigenschaften von Stammzellen aus dem menschlichen Amnion AM-hMSC Kulturen nach 3 Tagen nach der Trennung wurden mit einem optischen Mikroskop untersucht und gezeigt, die Fibroblasten-ähnliche Morphologie aufweist.
Abb. 3: Die Durchflusszytometrie Charakterisierung der Zellen aus menschlichen Amnionmembran waren meist mesenchymalen Zellen, weil sie positiv für mesenchymalen Marker (CD73, CD90, CD105) waren, wie durch die Verschiebung des Histogramms auf der rechten Seite gezeigt, und negativ für hämatopoetischen Marker (CD34 und CD45), wie durch die Verschiebung des Histogramms links bestätigt. Die Antigene werden in rote Histogramme gezeigt, während die Steuer isotypesfor den PE und FITC Fluorochrome sind im beobachtetenschwarz.
Fig. 4:. Zelladhäsion auf Rinderknochenmatrix Eine Reihe von REM-Aufnahmen, die die Befestigung der Zellen an Poren des Biomaterials (A) Panoramasicht eines NKB Poren mit mehreren Zellen, um das Biomaterial in der sphärischen Zustand (CS) geklebt und abgeflacht (CF) auf der Oberfläche des Biomaterials ist auch möglich, die Knochenlücke bezeichnet als (Lac) an drei Tag der Kultur auf dem Rinder-Matrix schätzen. (B) Die Amplifikation der Zelle in dem Prozess der Anpassung an der Oberfläche das Material durch filipodial Projektionen (C) Die Interaktion zwischen zwei Zellen eingehalten und auf der Rindermatrix abgeflacht (C1, Zelle 1 und C2, Zelle 2).. Bitte klicken Sie hier, um vIEW eine größere Version dieser Figur.
Abb. 5: Die Proliferation von Zellen auf Rinder-Knochenmatrix Zellproliferation wurde durch AB Reduzierung ausgewertet und in relativen Absorptionseinheit an 7 Tagen nach der Kultivierung. Ergebnisse sind dargestellt der Einfluss von Knochenmatrix (+ Knochenmatrix) in AM-hMSCs Proliferation, die im Vergleich mit der negativen Bedingung (-bone Matrix) statisch war anders. (* P <0,05)
Abbildung 6: CFU-Assay von MSCs zunächst mit unterschiedlicher Dichte plattiert und für 14 Tage inkubiert (Mittelwert * / - SD, n = 10).
| Zellen eingehalten | Zelladhäsion (%) | |
| Zellen auf dem Boden | 187.667 ± 1208 | 62,47 |
| Zellen auf dem Gerüst | 312.333 ± 1208 | 37,53 |
Tabelle 1:. Effizienz der Haftung auf Rindermatrix Die an der Unterseite der Plattenteller und die Zellen auf dem Gerüst haften adhärierten Zellen wurden mittels eines Hämocytometers nachdem sie durch trypsinization.The Daten in der Tabelle dargestellt gewonnen gezählt entsprechen zwei Experiment dreifach unabhängig ± Standardabweichung
Discussion
Die Stammzellen, die aus menschlichen amniotischen Membran (Figur 1) erhalten wurden, zeigten eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie, ähnlich mesenchymale Zellen (Abbildung 2) und waren hauptsächlich MSCs. Zusätzlich Durchflußzytometrie-Assays zeigten, dass diese Zellen waren positiv für mesenchymale Zellmarkern (CD73, CD90 und CD105) und negativen hämatopoetischen Linie Marker (CD34, CD45) (Abbildung 3). Auch die AM-hMSCs isoliert in dieser Arbeit präsentieren die Fähigkeit zur Bildung von KBE (Abbildung 6). Ebenso können die isolierten mesenchymalen Stammzellen in dieser Form behielt die Fähigkeit, sich an osteoinductor Biomaterials (4) zu befestigen, und vermehren sich auf dem Gerüst (5).
Aus diesen Gründen wird das Kulturverfahren AM-hMSCs auf makroporösen Knochen Biomaterial, das in dieser Arbeit verwendet wurde, stellt eine Möglichkeit dar, um Zellen in verletzten Knochen Gewebeeinsatz und induzieren ihre differentiation auf die Osteoblasten-Linie. Dieses Kultursystem erfordert nicht die Zugabe von osteoblastischen Induktoren, um die Osteoblasten-Phänotyp und Osteoblastendifferenzierungsprozess aufrechtzuerhalten, da NKB eine osteokonduktive andosteoinductive Material 8. Die Verwendung von Abfall Geweben wie Plazenta, stellt eine einfache und ethischen alternative, um eine Population von Stammzellen, die das Potenzial Zugriff in MSCs differenzieren, im Vergleich mit anderen Quellen, die umfassen häufig invasive Methoden oder geringe Zellausbeute.
Die vorgeschlagene Kulturverfahren könnte in vivo Systemen extrapolieren, da die Zellen in Mikromasse auf der Oberseite Material ausgesät und die Zellen zu besiedeln und sich an die gesamte Biomaterial-Oberfläche nach dem entsprechenden Inkubationszeiten. Des Weiteren werden anspruchsvolle Reagenzien, Geräte und Verfahren nicht erforderlich, im Gegensatz zu bestehenden Methoden bei der Durchführung dieser Technik sind die Mikromassen cultureas sowie dielangsame und stetige Abscheidung des zellulären Aliquot vom Material, um sicherzustellen, dass die Zellen bevorzugt mit dem Biomaterial zu kommunizieren, und nicht mit der Unterseite der Platte. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Verwendung von vorbenetzten Material vor dem Kultivieren der Zellen, da dies gewährleistet, dass die Zellen die notwendigen Nährstoffe aus dem Kulturmedium, wenn sie unabhängig in das Material integriert ist, wenn sie auf der Oberfläche oder in den Poren sind. Schließlich ist die Verwendung eines osteoinduktiven Biomaterials für diesen Prozess, weil es das Hinzufügen von externen Faktoren zu induzieren und aufrechtzuerhalten osteoblastische Differenzierung verhindert. Die Einschränkung der Technik ist, dass es auf der osteoinduktiven Potential des Rindermatrix basiert; Allerdings kann das vorgeschlagene Kultursystem einem porösen Material mit einem Porenverteilung von 20 bis 200 & mgr; m hochgerechnet werden. Daher ist die in dieser Arbeit vorgestellten Verfahren eine alternative Methode zur Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus verschiedenen Materialien that sich für das Tissue Engineering zur Anwendung, insbesondere zur Knochenregeneration.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir sind uns der Wissenschaft und von der Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 und DGAPA IN216213 finanzielle Unterstützung; Salvador Correa des Instituto Nacional de Perinatología um Hilfe mit dem biologischen Material; und Biocriss, SA de C. V für die Spende Nukbone. Danke auch an Ing. Héctor Martínez von IIM, UNAM und M en C Fabiola Gonzalez von CINVESTAV für die technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
| penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
| FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
| collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
| 3 mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
| trypsin/0.5 mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
| Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
| alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
| SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |
References
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