Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.
Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.
Det pare og regenerering av tissuesis en av themain målene for medisinsk vitenskap fordi en lesjon i en vev ororgan kan være invalidiserende, og i noen tilfeller dødelig. I sammenheng, er helsearbeidere og forskere stadig på jakt teknikker, metoder og verktøy for å gi ny terapeutisk alternativesto fremme det pair-regenerering prosessen skadet vev. Derfor har biomedisin fokusert på studiet av mesenchymale stamceller (MSC), spesielt voksne stamceller, fordi denne celle linjen representerer en ideell modell for å studere vevsregenerering prosessen, på grunn av sitt potensial til å differensiere til ectodermal, mesodermal og endodermal celle linjene Men for å gjøre behandlingen med MSC en realitet, må karakterisering av thetherapeutic potensialet i MSC være ledsaget av implementering av nye cellekultur teknikker ved hjelp av biomaterialer og cellulære stillasene som garanterer ønsket atferd av MSC i vertsvevet.
<pclass = "jove_content"> Den viktigste utfordringen å overvinne i gjennomføringen av en kultur med MSC i benregenerering er å sikre celleadhesjon på den valgte biomateriale, som generelt viser en porøs struktur med adistribution av porer som strekker seg fra mikrometer til millimeter er blitt benyttet men ofte krever sofistikerte reagenser, utstyr og prosedyrer som endrer oppførselen til cellene. Disse fremgangsmåtene er egnet for in vitro vurdering, men ikke for ekstrapolering og gjennomføring i komplekse åpne systemer, så som humane eller in vivo-tester. Teknikker som fokuserer på å sikre celleadhesjon til tilfeldige topografier, slik som porøse skjelettmaterialer, har blitt studert ved adhesjon av materialet til bunnen av kulturbrønner og anvendes kollagen og agarose polymerer. For disse fremgangsmåter, ble cellene som ble sådd på overflaten som holdes tilbake i porene og på toppflaten. Imidlertid kan dette aspektet ikke kan sikres i en in vivo-system, i hvilket de kroppsvæsker som omgir biomateriale kunne dra cellene fra det ønskede sted på porøse stillasene er bruken av ultralyd stimulering, noe som krever sofistikert utstyr, men fremmer ekspresjonen av osteoblastiske markører i in vitro analyser 5. Bruken av kontinuerlige kulturer krever bioreaktorer, som garanterer en homogen fordeling av næringsstoffer i kulturen medium; imidlertid en betydelig andel av de dyrkede celler tapt ved utskifting av kulturmediet på grunn av den strømningshastighet som er brukt i denne teknikk og mediet kleber til veggene av utstyret. Disse problemene øker den cellulære masse som er nødvendig for denne type av kultur og tiden for å oppnå et tilstrekkelig antall celler 7. Således kan metoden presentert i dette arbeidet er en teknikk som skal ekstrapoleres til in vivo systemer fordi cellene sådd ut i mikro masse på en øvre overflatemateriale, og etter hensiktsmesspiste inkubasjonstider, er 60% av den opprinnelige cellemasse følges. Videre betyr denne teknikken krever tillegg av osteoblastiske inductors (f.eks deksametason, askorbinsyre, eller beta-glycerophosphate) eller ultralyd stimuli for å indusere osteoblastiske differensiering og vedlikehold av osteoblast fenotype fordi NKB er et osteoconductive og osteoinduktive stillaser 8, metoden for kulturen i MSC fra menneskets foster membran (AM-hMSCs) på macroporous bein biomateriale presentert i dette arbeidet representsapossibility å sette inn celler i skadet benvev og indusere differensiering til osteoblastisk avstamning.Stamcellene som ble oppnådd fra humant fostervann membranen (figur 1) viste en fibroblast-lignende morfologi, i likhet med mesenchymale celler (figur 2) og var hovedsakelig MSC. I tillegg er flowcytometri-analyser viste at disse cellene var positive for mesenchymale cellemarkører (CD73, CD90, og CD105) og negativ for hematopoetiske avstamning markører (CD34, CD45) (figur 3). Også, AM-hMSCs isolert i dette arbeidet presentere evnen til å danne CFU (figur 6). Tilsvarende mesenchymale stamceller isolert i denne formen beholdt evnen til å feste til osteoinductor biomateriale (figur 4), og sprer på stillaset (Figur 5).
Av disse grunner, dyrkning av AM-hMSCs på makroporøs ben biomateriale som ble brukt i dette arbeidet representerer en mulighet for å sette cellene i skadet benvev og indusere sin differentiation til osteoblastisk avstamning. Denne kultursystem krever ikke tilsetning av osteoblastiske induktorer for å opprettholde osteoblast fenotype og osteoblastiske differensieringsprosessen fordi NKB er en osteoconductive andosteoinductive materiale 8. Bruken av avfalls vev, slik som human placenta, representerer en enkel og etisk alternativ til å få tilgang til en populasjon av stamceller med potensiale til å differensiere til MSC, i sammenligning med andre kilder som ofte involverer invasive metoder eller lave celleutbyttet.
Den foreslåtte dyrkningsmetode kan bli ekstrapolert til in vivo systemer fordi cellene blir sådd ut i mikro massen på den øvre overflaten materiale, og cellene kolonisere og følge den hele biomateriale overflaten etter at de riktige inkubasjonstider. Videre er sofistikert reagenser, utstyr og prosedyrer ikke nødvendig, i motsetning til eksisterende metoder ved implementering av denne teknikken er mikro-masse cultureas vel somlangsom og jevn avsetning av den cellulære delmengde av materialet for å sikre at cellene fortrinnsvis samvirke med biomateriale, og ikke med bunnen av platen. Et annet kritisk punkt er bruken av pre-fuktede materialet før dyrking av cellene, da dette sikrer at cellene vil ha de nødvendige næringsstoffer fra kulturmediet når de blir integrert inn i materialet, uansett om de er på overflaten eller i porene. Endelig er anvendelse av et osteoinduktivt biomateriale kritisk for denne fremgangsmåte fordi den unngår tilsetning av eksterne faktorer for å indusere og opprettholde osteoblastiske differensiering. Begrensningen av teknikken er at den er basert på osteoinduktivt potensialet av det bovine matrise; imidlertid kan den foreslåtte kultursystem bli ekstrapolert til en hvilken som helst porøst materiale med en porestørrelse fordeling av 20 til 200 um. Derfor er fremgangsmåten presentert i dette arbeidet er en alternativ fremgangsmåte for dyrking av stamceller i ulike materialer thatten er ansatt for tissue engineering, spesielt for bein regenerasjon.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner stipend og økonomisk støtte fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 og DGAPA IN216213; Salvador Correa fra Instituto Nacional de Perinatología for å få hjelp med det biologiske materialet; og Biocriss, SA de C. V for å donere Nukbone. Også takke til Ing. Héctor Martínez av IIM, UNAM og M en C Fabiola Gonzalez av CINVESTAV for teknisk assistanse.
sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
3mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
trypsin/0.5mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |