Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.
Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.
Der parre og regenerering af tissuesis et af themain mål for lægevidenskaben, fordi en læsion i et væv ororgan kan være invaliderende, og i nogle tilfælde dødelige. I sammenhæng er de sundhedspersonale og forskere konstant søger teknikker, metoder og værktøjer til at give ny terapeutisk alternativesto fremme der pair-regenereringsproces af beskadigede væv. Derfor har biomedicinske videnskaber fokuseret på undersøgelse af mesenchymale stamceller (MSC'er), især voksne stamceller, fordi denne celle afstamning udgør en ideel model til at studere vævsregeneration proces på grund af dens potentiale til at differentiere til ektodermal, mesodermal og endoderm celleafstamninger Men for at gøre behandling med MSC en realitet, skal karakteriseringen af thetherapeutic potentiale MSC'er ledsages af implementering af nye celledyrkningsteknikker hjælp af biomaterialer og cellulære stilladser, der sikrer den ønskede adfærd MSC'erne i værtens væv.
<pclass = "jove_content"> Den vigtigste udfordring at overvinde i gennemførelsen af en kultur med MSC'er i knogleregenerering er at sikre celleadhæsion på den valgte biomateriale, som generelt udgør en porøs struktur med adistribution af porer lige fra mikrometer til millimeter er blevet anvendt men ofte kræver sofistikerede reagenser, udstyr og procedurer, der ændre adfærden af celler. Disse procedurer er egnet til in vitro vurdering, men ikke for ekstrapolation og gennemførelse i komplekse åbne systemer, såsom human eller in vivo assays. Teknikker, der fokuserer på at sikre celleadhæsion til tilfældige topografier, såsom porøse knogle materialer, er blevet undersøgt af adhæsion af materialet til bunden af dyrkningsbrønde og ansat collagener og agarose polymerer. For disse metoder, blev de celler, der blev podet på overfladen bibeholdes i porerne og på den øverste overflade. Dog kan dette aspekt ikke sikres i en in vivosystem, hvor kropsvæsker omgiver biomaterialet kan trække celler fra det ønskede sted på porøse stilladser er brugen af ultralyd stimulation, som kræver sofistikeret udstyr, men fremmer ekspressionen af osteoblastiske markører i in vitro assays 5. Brugen af kontinuerlige kulturer kræver bioreaktorer, som garanterer en homogen fordeling af næringsstoffer i dyrkningsmediet; imidlertid en væsentlig procentdel af de dyrkede celler tabt, når udskiftning af dyrkningsmediet på grund af den flowhastighed, der anvendes i denne teknik, og mediet klæber til væggene af udstyret. Disse spørgsmål øge cellemasse, der er nødvendig for denne type kultur og tiden til opnåelse af et tilstrækkeligt antal celler 7. Således metoden fremlagt i dette arbejde er en teknik, der skal ekstrapoleres til in vivo systemer, fordi cellerne podes i mikro-masse på en øverste overflade materiale, og efter det er passende,spiste inkubationstider, er 60% af den oprindelige cellemasse klæbet. Desuden har denne teknik ikke kræver tilsætning af osteoblastiske spoler (f.eks dexamethason, ascorbinsyre, eller beta glycerophosphat) eller ultralyds stimuli inducerer osteoblastisk differentiering og vedligeholdelse af osteoblastfænotypen fordi NKB er en osteokonduktiv og osteoinduktive stilladser 8, hvilken fremgangsmåde til dyrkning af MSC'er fra det humane fosterhinde (AM-hMSC'er) på makroporøs knogle biomateriale præsenteres i dette arbejde representsapossibility at indsætte celler i beskadiget knoglevæv og inducere differentiering til den osteoblastiske afstamning.De stamceller, der blev opnået fra humant fostervand membran (figur 1) viste en fibroblast-lignende morfologi, svarende til mesenchymale celler (figur 2) og var hovedsagelig MSC'er. Desuden flowcytometri assays viste, at disse celler var positive for mesenchymale cellemarkører (CD73, CD90 og CD105) og negative for hæmatopoietisk linje markører (CD34, CD45) (figur 3). Også AM-hMSC'er isoleret i dette arbejde præsentere evne til at danne CFU'er (figur 6). Tilsvarende mesenkymale stamceller isoleret i denne form bibeholdt evnen til at knytte til osteoinductor biomateriale (figur 4), og proliferere på stilladset (figur 5).
Af disse grunde dyrkningsmetode af AM-hMSC'er på makroporøs knogle biomateriale, der blev anvendt i dette arbejde er en mulighed for at indsætte celler inden skadet knoglevæv og inducere dets Forskelntiation til osteoblastiske afstamning. Denne kultur kræver ikke tilsætning af osteoblastiske spoler til at opretholde osteoblastfænotypen og osteoblastisk differentiering proces, fordi NKB er en osteokonduktiv andosteoinductive materiale 8. Anvendelsen af affald væv, såsom human placenta, udgør en enkel og etisk alternativ adgang til en population af stamceller med potentiale til at differentiere til MSC'er i sammenligning med andre kilder, der ofte involverer invasive metoder eller lav celleudbytte.
Den foreslåede dyrkningsmetode kan ekstrapoleres til in vivo systemer, fordi cellerne podes i mikro-masse på den øverste overflade materiale, og cellerne koloniserer og overholde hele biomateriale overflade efter passende inkubationstider. Desuden er sofistikerede reagenser, udstyr og procedurer ikke er påkrævet, i modsætning til eksisterende metoder, når de gennemfører denne teknik er mikro-masse cultureas samtlangsomt og støt aflejring af den cellulære portion af materialet for at sikre, at cellerne fortrinsvis interagere med biomateriale og ikke med bunden af pladen. Et andet kritisk punkt er anvendelsen af præ-befugtet materiale, før dyrkning af cellerne, da dette sikrer, at cellerne vil have de nødvendige næringsstoffer fra dyrkningsmediet, når de integreres i materialet, uanset om de er på overfladen eller i porerne. Endelig er anvendelsen af en osteoinducerende biomateriale er afgørende for denne proces, fordi den undgår tilsætning af eksterne faktorer til at inducere og vedligeholde osteoblastisk differentiering. Begrænsningen af teknik er, at den er baseret på det osteoinduktive potentiale bovine matrix; imidlertid kan det foreslåede system kultur ekstrapoleres til porøst materiale med en pore distribution af 20 til 200 um. Derfor proceduren præsenteres i dette arbejde er en alternativ metode til dyrkning mesenchymstamceller i forskellige materialer that er ansat for tissue engineering, især for knogle regeneration.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender stipendiet og finansiel støtte fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 og DGAPA IN216213; Salvador Correa fra Instituto Nacional de Perinatología om hjælp med det biologiske materiale; og Biocriss, SA de C. V for at donere Nukbone. Også tak til Ing. Héctor Martínez af IIM, UNAM og M DA C Fabiola Gonzalez af CINVESTAV til teknisk bistand.
sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
3mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
trypsin/0.5mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |