Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Däggdjurs cellinjer kan klassificeras i en av tre kategorier baserat på deras tillväxtegenskaper: celler som växer i suspension, celler som växer som aggregat, och celler som växer förankrade till ett substrat. Fastän luft-hjuliga bioreaktor demonstreras i denna video är i stånd att växa alla tre typer av celler, kommer denna video demonstrerar användandet av bioreaktorn att växa förankringsberoende celler på mikrobärare. Förankringsberoende däggdjursceller kan odlas för att producera fler celler – där cellerna själva produkten. Till exempel är humant benmärgs mesenchymala stamceller närvarande odlas med syfte att skörda celler och injicera dem i sjuk vävnad. Den pneumatiska bioreaktor demonstreras i den här videon har visat lämplig för produktion av sådana mesenkymala stamceller för denna applikation (Serra et al., Personlig kommunikation, 2013).
Anchorage dependent däggdjursceller är vanligtvis odlas i liten skala i 2D odlingskärl som cellodlingsplattor, cellodlingsflaskor eller rullflaskor, där de ansluter sig till en specialbehandlad tillväxtytan 1. När flera celler önskas kan plattorna eller kolvar utökas genom att använda fler eller större fartyg. Emellertid, för mer kostnadseffektiv odling av stora mängder av förankringsberoende celler, ökning av ytarean för cellbindning kan åstadkommas genom användning av små fasta pärlor kallade mikrobärare. Beroende på anslutningsegenskaperna hos cellen, flera olika typer av mikrobärare är kommersiellt tillgängliga, såsom dextran, peptid, eller kollagen belagda. Mikrobärare har en stor ytarea till volymförhållande som ger en större ytarea för celltillväxt; och de mikrobärare kan hållas i suspension under omröring, vilket gör att de celler som skall odlas till höga densiteter i bioreaktorsystem 2. För närvarande, de typer av bioreactors där vidhäftande celler odlas på mikro bärare inkluderar spinnerflaskor och omrörda tanksystem, som använder axiella pumphjul för att bibehålla ett tillfälligt upphävande av cellbelagda mikrobärare.
Flera faktorer är viktiga för en framgångsrik odling av celler inkluderande syrespänning, skjuvspänning, yta matris och näringsämnen och metabolitkoncentrationer. Användningen av bioreaktorer möjliggör realtidsövervakning av villkoren tillväxt och potential att väsentligt lägre produktionskostnader 1. Det finns flera gemensamma bioreaktor design för in vitro cell odling inklusive, omrörd suspension, roterande väggkärl, ihåliga fibrer, väska bioreaktor på en rocker-plattform, och fluidiserad bädd-system 3. Många av dessa system presenterar unika problem för cellodling och skala -up, såsom höga kostnader, närings koncentrationsgradienter, hydrodynamiska skjuvning, cellaggregation, och svårigheter att provtagning, övervakning och styrning av cell uppskalning.
Olika vidhäftande cellinjer används i produktionen av virus, antingen i produktionen av virusvacciner eller för produktion av virala vektorer för genterapi applikationer. I den här videon, med hjälp av engångs pneumatiska (lufthjul) bioreaktorsystem visar vi den kultur av mänskliga lungkarcinomceller (A549) celler på mikrobärare för produktion av en onkolytiskt adenovirus. Den pneumatiska bioreaktor design använder en vertikal agitation hjul som drivs av flytkraften av gas spolades in i botten av bioreaktorn. Denna varsam omrörning metod begränsar hydrodynamiska skjuvkrafter, men ändå garanterar optimal medium och cell blandning 4. Jämfört med omrörd tankreaktor, har den pneumatiska reaktorn låg mur skjuvspänning även med hög volym luft-Wheel bioreaktorsystem (Figur 1). I motsats till omrörda tank bioreaktorer, är den vertikala impeller av denna enda användning reaktorn vrids av en ström av gasbubblor inomfartyget, vilket gör det möjligt för skonsam och jämn medelblandning (Figur 2).
Denna engångs bioreaktorsystem är relativt enkelt att använda och ger realtidsanalyser för reaktor uppföljning och analys. Det är mycket väl lämpad för däggdjur och insektscellkultur med celldensiteter når mer än 30 miljoner celler / ml. Förutom A549-celler som beskrivs i denna rapport 11, har vi vuxit SF-9 insektsceller i bioreaktorn också. Den milda blandning från den pneumatiska lufthjul minskar cellskador. Flera steg är avgörande när du ställer in denna reaktor. Först korrekt kalibrering av pH-och DO-sensorer är viktigt för optimal övervakning av kulturen och för tillsats av reagens för att justera pH eller syre i systemet. För det andra måste reagens och utsädesflaskor fyllas och luer bilagor görs i en steril miljö som en BSC. När reagensflaskorna flyttas ut ur den sterila miljön måste anslutningarna till bioreaktorn matarledningar göras försiktigt för att undvika mikrobiell kontamination.
<pclass = "jove_content"> Även om detta bioreaktor systemet fungerar bra för däggdjurs och insektscellinjer Den är inte avsedd för bakteriekulturer. Systemet kan inte tillhandahålla en snabb blandning och syresättning som krävs för bakterieceller. Bakterietillväxt åstadkommes bäst i en omrörd tank bioreaktor. Jämfört med andra engångs bioreaktorer för däggdjurs eller insektscellkultur är detta system lätt att använda, ger tillräckliga data för analys av körningar, och har liknande eller bättre celltillväxt än den andra engångsbruk system vi har utvärderat.Den enda användning pneumatiska bioreaktorsystem har potential att möta många av forskning och kliniska tillämpningar inom områdena proteinläkemedel, vaccin, stamceller och personlig medicin 4. Dessutom tillåter flexibilitet i detta system för Batch, Fed-batch, Perfusion och Transfektionsexperiment baserad bioreaktor program 5. Slutligen engångsengångs bioreaktorsystem har potential att möta behoven av storskalig industriell produktion och att följa riktlinjer och rekommendationer från nationella och internationella tillsynsmyndigheter 6-10.
The authors have nothing to disclose.
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
PBS 3 | PBS | n/a | |
Single Use Assembly | PBS | n/a | |
Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
DMEM High Glucose Medium | |||
Fetal Bovine Serum | |||
Trypsin EDTA, 0.25% | |||
Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
Antifoam C | Sigma | A8011 |