Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מהדם היקפי באמצעות אסטרטגית תכנות מחדש episome מבוסס ומעכבי היסטון deacetylase.
Abstract
כתב יד זה מדגים פרוטוקול ליעילות יצירת תאים ללא אינטגרציה אנושית הנגרם גזע pluripotent (iPSCs) מהדם היקפי באמצעות פלסמידים episomal וdeacetylase היסטון מעכבים (HDAC). היתרונות של גישה זו כוללים: (1) השימוש בכמות מינימאלית של דם היקפי כחומר מקור; (2) nonintegrating וקטורי תכנות מחדש; שיטה חסכונית ליצירת iPSCs החופשי וקטור (3); transfection יחיד (4); ו- (5) השימוש במולקולות קטנות כדי להקל על תכנות מחדש אפיגנטיים. בקצרה, תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) מבודדים מדגימות לקיחת דם שגרתיות ולאחר מכן בתרבית גורמי גדילה מוגדרת להניב אוכלוסיית תא אב כדורית אדומה שגשוג מאוד כי להפליא ניתן לתכנות מחדש. Nonintegrating, פלסמידים episomal nontransmissible להביע Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, וסיכת ראש קצרה RNA p53 (SH) הם introduCED לerythroblasts נגזר באמצעות nucleofection יחיד. Cotransfection של episome שמבטא משופר חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) מאפשר זיהוי קל של תאי transfected. פלסמיד כפול מחסרת נפרד להביע אפשטיין-באר אנטיגן הגרעיני 1 (EBNA1) הוא גם הוסיף לתערובת התגובה לביטוי מוגבר של חלבוני episomal. אז תאי transfected הם מצופים על שכבת פיברובלסטים עכבר המוקרן עובריים (iMEFs) לתכנות מחדש המשיך. ברגע שהמושבות כמו-iPSC מופיעות בכ-עשרה ימים לאחר nucleofection, מעכבי HDAC מתווספים למדיום כדי להקל על שיפוץ אפיגנטיים. מצאנו כי הכללת מעכבי HDAC באופן שגרתי מגבירה את הדור של מושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא על ידי 2 קיפול. ברגע שמושבות iPSC להציג מורפולוגיה טיפוסית של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC), הם מועברים בעדינות לצלחות אישיות מצופות iMEF רקמת תרבות לצמיחה והתרחבות.
Introduction
iPSCs נגזרים מרקמות סומטיות באמצעות ביטוי חוץ-רחמי של מספר מינימלי של גני pluripotency. טכניקה זו הייתה בתחילה הודגמה על ידי התמרה retroviral של פיברובלסטים אנושיים עם Oct4, Sox2, KLF4, וcMYC, אשר באות לידי ביטוי ביותר במדינת pluripotent 1. זמנית הביעו "גורמי תכנות מחדש" אלה לשנות את פרופיל הביטוי של תא המטרה אפיגנטיים נוף והגן דומה לתאי גזע עובריים אנושיים 2. לאחר שנוצר, iPSCs יכול להיות מובחן פוטנציאלי לכל סוג רקמה לחקירה נוספת. כך, יש להם הבטחה לשימוש ברפואת רגנרטיבית, דוגמנות מחלה, ויישומי ריפוי גנטי. עם זאת, לשבש את הגנום עם וירוסי שילוב יש את הפוטנציאל לשנות את ביטוי הגנים אנדוגני, פנוטיפ הסלולר השפעה, וסופו של דבר מטה את תוצאות מדעיות. יתר על כן, אינטגרציה נגיפית אקראית יכולה להוביל לדואר סלולארי מזיקffects, כולל האפשרות לשינוי ממאיר 3 מחדש או ביטוי של הגנים המושתלים שעור 4. יישומים קליניים בעתיד ידרשו דור iPSC-שילוב שאינו.
Episomes, שהם מולקולות הדנ"א בכרומוזומים מעגליים נוספות, מציע אסטרטגיה ליצירת iPSCs חסכוני, ללא אינטגרציה 5. השילוב של וקטורי episomal מוצגים בטבלה 1 להביע את תכנות מחדש של גורמי Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, וLIN28A. פלסמיד pCXLE_hOCT3 / 4 shp53-F מכיל גם p53 shRNA לדיכוי זמני של TP53 כדי לשפר את תכנות מחדש של תאי 6. וקטור pCXWB-EBNA1 חסר השכפול מקדם הגברה של גורמי תכנות מחדש ויעילות תכנות מחדש מוגברת על ידי מתן עלייה זמנית בביטוי EBNA1 7. פלסמיד pCXLE_EGFP ניתן להוסיף לתערובת nucleofection לצורך Determining יעילות transfection או ליישומי מיון תא. למעט CXWB-EBNA1 p, פלסמידים episomal שימוש בפרוטוקול זה מכילים את מקור נגיף אפשטיין-באר בשכפול נגיף וגן EBNA1, אשר מתווך שכפול וחלוקת episome במהלך חלוקת התא המארח 8. Episomes באופן ספונטני לאיבוד עם התרחבות iPSC רצוף 7. Subcloning ואפיון של iPSCs עם אובדן וקטור episomal, שניתן להסיק מאובדן של ביטוי eGFP, יכולים להוביל ללחלוטין iPSCs החופשי אינטגרציה ליישומים קליניים בעתיד.
טבוע בתהליך של דור iPSC הוא דיכוי של גנים ספציפיים שושלת והפעלה מחדש של גנים הקשורים pluripotency. רגולציה של ביטוי גנים מתרחשת במספר הרמות בתוך הגרעין, ובכלל זה שינויים ב- DNA והכרומטין כדי לאפשר גורמי שעתוק, רצפי דנ"א רגולציה, וגישה RNA פולימראז למקדגנים. עיצוב מחדש של הנוף ההתווצרותי באמצעות שינויי הכרומטין הגלובליים הוא מרכיב מרכזי מחדש ביטוי של התכנית הגנטית pluripotency. שינוי הכרומטין ספציפי שהוא חשוב בויסות של ביטוי גנים הוא acetylation של ההיסטונים בשאריות ליזין מסוימים, המאפשר גישה ליעד גנים באמצעות מתח נמוך יותר של סליל היסטון-DNA. מעכבי HDAC הם מולקולות קטנות אשר הוכחו כדי לשפר את תכנות מחדש iPSC וhESC התחדשות עצמית 9,10, ככל הנראה בשל תמיכה מדינת acetylated 11. הפרוטוקול המתואר להלן, שהותאם מפרסום קודם באמצעות lentiviruses שילוב 12, מספק שיטת צעד-אחר-צעד לדור iPSC מותאם מepisomes באמצעות דם היקפי ומעכבי HDAC. ריכוזי מעכב HDAC משמשים כאן הם חצי מאלה המתוארים על ידי ור, et al 9., והובלתי באופן שגרתי לעלייה של 2 לקפל במושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא על תקןפרוטוקולי תכנות מחדש episomal ללא מעכבי HDAC. רמה זו של תכנות מחדש היא באחידות עם היעילות שאנו רואים עם שיטות lentiviral. שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו ביעילות שנוצר iPSC מאנשים זקנים כמו 87 שנים של גיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כתב הסכמה מדעת, כפי שאושר על ידי ועדות הביקורת המוסדית של המרכז לחקר סרטן פרד האצ'ינסון והילדים "בית החולים של פילדלפיה של, התקבל מחולים לפני איסוף דגימות דם היקפיים. כל ההנחיות מוסדיות נצפו. כל הניסויים בבעלי החיים, כולל דור MEF ו היווצרות תפלצת אושרה על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים.
1. הפרדת Ficoll של PBMCs והרחבת Erythroblasts - יום 0
- לדלל דם היקפי 1: 1 עם בופר פוספט של Dulbecco (DPBS). בתוך צינור קלקר מסביב לתחתית 15 מיליליטר, שכבה בזהירות 7 מיליליטר של דם מדולל על 3 מיליליטר של בטמפרטורת חדר Ficoll-Hypaque.
- צנטריפוגה המדגם ב 400 XG למשך 30 דקות.
- PBMCs תהיה התיישבו לממשק בין הפלזמה וFicoll-Hypaque, נתפס כשכבת לבנה מעונן. בעזרת פיפטה העברת סטרילי, לאסוף את PBמנחים לתוך צינור חרוטי אחד 15 מיליליטר. תביא את הנפח ל 10 מיליליטר באמצעות DPBS.
- באמצעות hemacytometer, לספור את PBMCs.
- פיפטה 2 × 10 6 PBMCs לתוך צינור נפרד 15 מיליליטר חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. ספין למטה תאים וההקפאה נותרו בריכוז של 2 × 10 6 מיליליטר / PBMCs ב -90% בסרום שור העובר (FBS) sulfoxide דימתיל / 10% (DMSO).
- הכן הרחבה בינונית: מדיום חופשי QBSF-60 בסרום (להגן מפני אור) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + חומצה אסקורבית (50 ng / ml) + גזע גורם תא (SCF, 50 ng / ml) + interleukin 3 (אִי- גורם 3, 10 ng / ml) + אריתרופויאטין (EPO, 2 U / ml) + אינסולין כמו צמיחה 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + דקסמתזון (1 מיקרומטר; להגן מפני אור; להפשיר aliquot טרי בכל אמצעי תקשורת לשנות).
- Resuspend 2 × 10 6 PBMCs 2 מיליליטר של הרחבה בינונית טריה ומקום לתוך אחד היטב צלחת תרבות 12 רקמות היטב דגירה בחממה humidified 37 ° C עם אווירה של 5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2.
- ביום 3 ויום 6, להחליף תקשורת.
- לאסוף את התאים ולשטוף היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60 כדי לאסוף את כל תאים שנותרו.
- צנטריפוגה ההשעיה תא XG ב 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant.
- Resuspend התאים 2 מיליליטר של מדיום הרחבה החדש ולהחזיר אותם לאותה הצלחת גם 12.
2. תאי תכנות מחדש על ידי nucleofection - יום 9
- פיפטה פלסמידים תכנות מחדש לתוך צינור סטרילי 1.5 מיליליטר אפנדורף (טבלת 1).
- מערבבים את פתרון nucleofection עם תוספת (שסופק על ידי יצרן) וטפטפתי לתוך צינור אפנדורף 1.5 מיליליטר סטרילי.
- פיפטה 2 מיליליטר של הרחבה בינונית ולאחת מצלחת גם 12 ומקום בחממה 37 מעלות צלזיוס humidified (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) לאיזון לפני הוספת תאים.
- אסוףתאים בתרבית ולשטוף היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60 לאיסוף תאים שנותרו.
- צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant.
- לשטוף את התאים על ידי resuspending ב 5 מיליליטר של DPBS וצנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant.
- Resuspend התא גלולה בפתרון nucleofection + תוספת 100 μl, לטפל כדי למנוע בועות יצירה.
- פיפטה ההשעיה התא לתוך הצינור המכיל פלסמידים תכנות מחדש, פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת, ופיפטה המדגם לתוך החלק התחתון של קובט nucleofection.
- הנח את קובט לתוך מכשיר nucleofection ולהפעיל תכנית T-019.
- העברת הרחבת prewarmed בינונית (מצלחת equilibrating בשלב 2.3) 100 μl לקובט nucleofection.
- מייד לאסוף את כל מדגם והפקדה לתוך הבאר של הרחבה בינונית מחוממת מראש. הימנע מאיסוף הפסולת הלבנה, צף המתה התא. מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) לצמיחה.
3. תאי מזין ציפוי - יום 10 או 11
- ביום 10, תאים מזינים צלחת.
- צלחת מעיל אחד 6 גם תרבית רקמה עם ג'לטין.
- פיפטה 1 ג'לטין מ 'של 0.1% בנאגרו מלוח הפתרון של האנק (HBSS) לבאר כל הצלחת.
- מניחים את הצלחת 37 מעלות צלזיוס חממת humidified במשך לפחות 5 דקות.
- מייד לפני השימוש, לשאוב את פתרון ג'לטין מהצלחת.
- להפשיר בקבוקון אחד של 2 fibroblasts העוברי × 10 6 עכבר מוקרן ב3,000 cGy ל -10 מיליליטר של MEF מדיה prewarmed (הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%)).
- צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant. Resuspend התאים 12 מיליליטר של MEF מדיה ופיפטה 2 מיליליטר in כדי היטב בכל 6 הצלחת גם ג'לטין מצופה. מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) עד ליום 12.
- צלחת מעיל אחד 6 גם תרבית רקמה עם ג'לטין.
4. תאי ציפוי בתאים מזין ושינוי בינוני - יום 12
- לאסוף את תאי nucleofected לאחת צינור חרוטי 15 מ"ל ולאסוף את כל תאים שנותרו על ידי שטיפה היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60. צנטריפוגה המדגם XG ב 300 במשך 5 דקות.
- הכן תכנות מחדש בינוני: של Iscove השתנה בינוני של Dulbecco (IMDM) + FBS (10%) + L-גלוטמין שאינם בעלי חיים (1 מ"מ) + שאינו חיוני חומצות אמינו (NEAA, 1%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + β -mercaptoethanol (0.1 מ"מ) + גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, הוסיף טרי בהאכלה, 10 ng / ml) + חומצה אסקורבית (הוסיף טרי בהאכלה, 50 מיקרוגרם / מיליליטר).
- לשאוב supernatant וresuspend התאים 12 מיליליטר של תכנות מחדש בינוני. פיפטה 2 מיליליטר לכל טוב של ההשעיה התא לתוךצלחת 6 היטב של תאים מזינים (כפי שהוכן בסעיף 3). צנטריפוגה את הצלחת ב 50 XG למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) לצמיחה. לשנות את תכנות מחדש בינוני בכל יום אחר עד מושבות iPSC מתחילות להופיע (1-2 שבועות).
- הכן hESC בינוני: DMEM / F12 1: 1 + החלפת נוק סרום (20%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + NEAA (1%) + L-גלוטמין שאינם בעלי חיים (1 מ"מ) + פירובט נתרן (1%) + סודיום ביקרבונט (0.12%) + β-mercaptoethanol (0.1 מ"מ) + bFGF (הוסיף טרי בהאכלה, 10 ng / ml)
- הכן מעכבי HDAC: וטיראט נתרן (הוסיף טרי בהאכלה, 100 מיקרומטר), חומצת suberanilohydroxamic (סח"ה, הוסיפה טרי בהאכלה, 200 ננומטר). ברגע שמושבות iPSC מופיעות, להתחיל להאכיל את התאים עם מעכבי hESC בינוני + HDAC, שינוי בינוני בכל יום.
הערה: בוטיראט נתרן הוא מולקולה קטנה שנספחה לצינורות פלסטיק, therefore לאחסן אותו בצינור זכוכית בורוסיליקט על 4 מעלות צלזיוס.
5. משובט בידוד iPSC
- ברגע שמושבות iPSC הם גדולות מספיק כדי להיות מבודדים (20-25 תאים), לאסוף אותם עם טפטפת P20.
- הכן מעכבי HDAC: וטיראט נתרן (הוסיף טרי בהאכלה, 100 מיקרומטר), סח"ה (הוסיף טרי בהאכלה, 200 ננומטר)
- הנח את המושבות מבודדות על iMEFs ב -35 מנות מ"מ בודדות המכילות מעכבי hESC בינוני + HDAC + תוספת שיבוט ושחזור.
- היום לאחר קטיף המושבות, לשנות את המדיום למעכבי hESC בינוני + HDAC.
- לשנות את המדיום כל יום עד מושבות iPSC מוכנות לpassaging.
- הסר מעכבי HDAC מהמדיום פעם אחת מושבות יתייצבו במעבר 2-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלושה ימים לאחר nucleofection ולפני ציפוי תאי nucleofected על iMEFs, את היעילות של nucleofection המוצלח צריכה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לeGFP. איור 1 מציג ניסוי nucleofection טיפוסי עם כ 5-10% מאוכלוסיית התא הכוללת להביע eGFP.
מושבות iPSC תכנות מחדש יתחילו להופיע כשבועיים לאחר nucleofection. המושבות הן בדרך כלל עגולות עם גבולות מוגדרים היטב וניתן לזהות על ידי מורפולוגיה hESC אופיינית כוללים תאים (1) קטנים, צפופים עם יחס גרעיני cytoplasmic גבוה ו (2) nucleoli הגלוי (איור 2, שדה מואר). תאים לתכנות מחדש באופן חלקי יהיו גם להתדרדר או ליצור המוני תאים הטרוגנית שבקלות להבחין בין מושבות iPSC האמיתיות.
של קווי הנציג שבחרנו לאפיין לחלוטין, כולו מפורש שלסמני pluripotency tandard (איור 2), להפעיל מחדש את הגנים אנדוגני pluripotency (איור 2), וteratomas צורה כאשר הוזרקו לעכברי NOD-SCID.
תאי Nucleofected המאולץ PBMCs שלושה ימים לאחר nucleofection עם פלסמידים המכילים Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, EBNA1, p53 shRNA, וeGFP (סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר): איור 1..
איור 2:. IPSC אפיון IPSC נוצר באמצעות מורפולוגיה כמו hESC-תערוכה בשיטה זו כאשר גדל על iMEF (שדה מואר), בדיקה חיובית לפעילות phosphatase אלקליין (AP), והם חיובייםעל ידי אימונוהיסטוכימיה עבור סמני pluripotency TRA-1-60, TRA-1-81, וSSEA4. בנוסף, ביטוי אנדוגני של Oct4 גני pluripotency (O), Sox2 (S), Klf4 (K), וcMyc (M) ניתן לזהות על ידי RT-PCR. (כל הברים בקנה מידה הם 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| Episome | מסה לכל תגובה (ng) |
| pCXLE-hOct3 / 4-shp53-F | 830 |
| pCXLE-HSK | 830 |
| 830 | |
| pCXLE-EGFP | 500 |
| pCXWB-EBNA1 | 500 |
טבלה 1:. יחס אופטימלי של תכנות מחדש פלסמידים 6 פלסמידים אלה זמינים להזמנה דרך Addgene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבור דור iPSC מוצלח בעת שימוש בפרוטוקול זה, יש כמה אזהרות חשובות שיש לקחת בחשבון. בשלב התרחבות erythroblast, לוח הזמנים של שינוי התקשורת צריך להיות רק אחריו, כסטיות עלולות להוביל לגירוי לא יעיל של אוכלוסיית תא אב היעד ויעילות נמוכה יותר של דור iPSC. זה חשוב לעשות בינוני הרחבה חדשה עם dexamethasone הטרי עם כל שינוי תקשורת; ובינוני בסיס QBSF-60 ודקסמטזון צריכים להיות מוגן מפני אור במהלך האחסון. במהלך nucleofection, לשטוף DPBS הוא קריטי כדי להסיר מומסים עודף מהשעית התא שעלול לגרום לזרם החשמלי מNucleofector לקשת, וכתוצאה מכך המוות של תאים נפוצים. כ -10 ימים לאחר nucleofection, הצלחת יש לבחון יומית למראה iPSC מושבה. ברגע שכמה מושבות קטנות נמצאות, תכנות מחדש בינוני צריך להיות שונה כדי hESC בינוני (עם מעכבי HDAC) כprolongeחשיפת ד לסרום עלולה לגרום להתמיינות ספונטנית.
בהתאם להגדרת מעבדה ומשאבים זמינים, שינויים בפרוטוקול יכולים להיחשב. אנחנו מעדיפים O 2 חממה נמוכה משום שתנאי חוסר חמצן הוכחו להגביר את היעילות של דור iPSC 13; עם זאת, יש לנו הצלחת יצירת iPSCs מהדם היקפי באמצעות תנאי normoxic עם 5% CO 2. יכול לשמש גם CO 2 באינקובטור לכן, humidified סטנדרטי. MEFs שימוש בפרוטוקול זה ניתן לרכוש מספק בתחום מדעי חיים. עם זאת, בשל השתנות אצווה מסחריות, אנחנו מעדיפים ליצור iMEFs מעכברי CF-1 הבא פרוטוקול שפורסם לבידוד MEF, תרבות, והקרנת 14. ההכללה של מעכבי HDAC היא היבט חיובי של פרוטוקול זה עיצוב מחדש אפיגנטיים הוא היבט חיוני של 9,15 תכנות מחדש של תאים. מעכבי HDAC יכולים להיות מושמטים, אך מספר פולly תכנות מחדש מושבות iPSC תקטן. לבסוף, יש לנו נוצרו iPSCs שימוש בשיטה זו בדגימת מוח עצם ללא שינויים נוספים שנדרשו.
לסיכום, פרוטוקול זה משתמש במערכת תכנות מחדש פלסמיד המבוסס כי תמנע עם וקטורי שילוב, כוללים הוספות אקראיות לתוך הגנום המארח וחששות בטיחות לגבי הטיפול בוירוס רקומביננטי חלק מהחסרונות של דור iPSC. בנוסף, ייצור וירוס בקנה מידה קטן ואפיון הוא יחסית עבודה אינטנסיבי בהשוואה לדור פלסמיד. יעילות תכנות מחדש יכולה גם להשתנות באופן משמעותי כתוצאה מהשתנות אצווה טבועות ייצור וירוס, ואילו ייצור בקנה מידה גדול אחד של פלסמידים האיכותיים יכול להוביל לדור iPSC העקבי לאורך זמן. בשילוב עם מעכבי HDAC, פרוטוקול זה מציע שיטה יעילה ליצירת אינטגרציה חופשית וטביעת רגל iPSCs חינם למחקר בתאי גזע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות מענקי מ- NIH הבאים לתמיכה במחקר זה: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), וK12HL0806406 (SKS); וקרן JP מקארתי (AR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4 °C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4 °C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4 °C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4 °C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4 °C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4 °C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4 °C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4 °C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4 °C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4 °C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4 °C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000x stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μl pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).
- Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).
- Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).
- Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).
- Azuara, V., et al.
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
- Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).
