Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.
Abstract
Dit handschrift illustreert een protocol voor het efficiënt maken van-integratie vrij humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit perifeer bloed met behulp van episomale plasmiden en histondeacetylase (HDAC) -remmers. De voordelen van deze benadering zijn: (1) het gebruik van een minimale hoeveelheid perifeer bloed als grondstof; (2) nonintegrating herprogrammering vectoren; (3) een kosteneffectieve werkwijze voor het genereren vector gratis iPSCs; (4) een enkele transfectie; en (5) het gebruik van kleine moleculen epigenetische herprogrammering vergemakkelijken. Kort, perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) geïsoleerd uit routine flebotomie monsters en vervolgens gekweekt in gedefinieerde groeifactoren een zeer proliferatieve erythrocyten progenitor celpopulatie die opmerkelijk vatbaar herprogrammering leveren. Nonintegrating, nontransmissible episomale plasmiden die OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, en een p53 short hairpin (sh) RNA zijn Inleidiced in de afgeleide erytroblasten via één nucleofection. Cotransfectie van een episoom dat tot expressie versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) zorgt voor gemakkelijke identificatie van getransfecteerde cellen. Een aparte replicatie-deficiënte plasmide dat Epstein-Barr nucleair antigeen 1 (EBNA1) wordt ook toegevoegd aan het reactiemengsel verhoogde expressie van episomale eiwitten. Getransfecteerde cellen worden daarna uitgeplaat op een laag van bestraalde muis embryonale fibroblasten (iMEFs) voor verdere herprogrammering. Zodra iPSC-achtige kolonies verschijnen ongeveer twaalf dagen na nucleofection zijn HDAC inhibitoren toegevoegd aan het medium epigenetische remodeling vergemakkelijken. We hebben gevonden dat de opname van HDAC inhibitoren routinematig verhoogt de productie van volledig geherprogrammeerd iPSC kolonies van 2 maal. Zodra iPSC kolonies vertonen typisch menselijke embryonale stamcellen (hESC) morfologie, worden ze voorzichtig overgebracht naar individuele Imef-gecoate weefselkweek platen voor verdere groei en expansie.
Introduction
iPSCs zijn afgeleid van somatische weefsels via ectopische expressie van een minimale set van pluripotency genen. Deze techniek werd aanvankelijk aangetoond door retrovirale transductie van humane fibroblasten met OCT4, SOX2, KLF4 en cMYC die hoog tot expressie in de pluripotente toestand 1. Deze tijdelijk tot expressie "herprogrammering factoren" veranderen de doel cel epigenetische landschap en genexpressie profiel analoog aan menselijke embryonale stamcellen 2. Eens gemaakt, kan iPSCs potentieel worden onderscheiden in elk type weefsel voor verder onderzoek. Zo is zij in het bezit belofte voor gebruik in regeneratieve geneeskunde, ziekte modelleren, en gentherapie toepassingen. Echter, verstoren het genoom met integrerende virussen heeft de potentie om endogene genexpressie beïnvloeden cellulaire fenotype te veranderen, en uiteindelijk vertekenen wetenschappelijke resultaten. Bovendien kunnen willekeurige virale integraties leiden tot schadelijke cellulaire effects, met inbegrip van de mogelijkheid van een maligne transformatie 3 of re-expressie van de oncogene transgenen 4. Toekomstige klinische toepassingen zullen niet-integrerende iPSC generatie vereisen.
Episomen, die extra chromosomaal circulaire DNA moleculen zijn, bieden een strategie om kosteneffectieve, integratie gratis iPSCs 5 genereren. De combinatie van episomale vectoren in tabel 1 geven de herprogrammering factoren OCT4, SOX2, KLF4, MYCL en LIN28A. De pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F plasmide bevat ook een p53 shRNA tijdelijke onderdrukking van TP53 cellulaire herprogrammering 6 verbeteren. De replicatie deficiënte pCXWB-EBNA1 vector bevordert amplificatie van herprogrammering factoren en verhoogde efficiëntie herprogrammering door een tijdelijke toename EBNA1 expressie 7. De pCXLE_EGFP plasmide kan de nucleofectie mengsel worden toegevoegd met het doel van determining de transfectie-efficiëntie of voor celsortering toepassingen. Met uitzondering van p-CXWB EBNA1, het episomale plasmiden die in dit protocol bevat het Epstein-Barr virus oorsprong van virale replicatie en EBNA1 gen dat replicatie en verdeling van de episoom bemiddelen bij deling van de gastheercel 8. De episomen spontaan verloren opeenvolgende iPSC expansie 7. Subklonering en karakterisatie van iPSCs met episomale vector verlies, dat kan worden afgeleid uit het verlies van eGFP expressie kan leiden tot integratie volledig vrij iPSCs voor toekomstige klinische toepassingen.
Inherent aan het proces van iPSC generatie onderdrukking van lijnspecifieke genen en reactivering van pluripotentie-geassocieerde genen. Regulatie van genexpressie plaatsvindt op verschillende niveaus binnen de kern, waaronder wijzigingen van DNA en chromatine transcriptiefactoren mogelijk, regulerende DNA-elementen, en RNA polymerase toegang targetengenen. Herinrichting van de epigenetische landschap via wereldwijde chromatine modificaties is een belangrijk onderdeel om opnieuw uitdrukking van de pluripotency genetisch programma. Een specifieke chromatine modificatie dat belangrijk is bij de regulatie van genexpressie acetylering van histonen op bepaalde lysineresten, dat toegang tot genen richten door verminderde spanning van de histon-DNA coil. HDAC remmers zijn kleine moleculen die zijn aangetoond iPSC herprogrammering en hESC zelfvernieuwing 9,10 verbeteren, waarschijnlijk door het ondersteunen van de geacetyleerde toestand 11. De hieronder beschreven protocol, aangepast van een voorafgaande publicatie met integratie lentivirussen 12, wordt stap voor stap methode voor optimale iPSC generatie uit perifeer volbloed met behulp episomen en HDAC inhibitoren. De HDAC inhibitor concentraties die hier gebruikt zijn de helft van die beschreven door Ware et al. 9 en routinematig tot een 2-voudige toename in volledig geherprogrammeerd iPSC kolonies op standaardepisomale herprogrammering protocollen zonder HDAC inhibitoren. Dit niveau van herprogrammering is op gelijke voet met de efficiëntie die we waarnemen met lentivirale methoden. Met dit protocol, hebben we snel gemaakt iPSC van individuen zo oud als 87 jaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Informed consent, zoals goedgekeurd door de Institutional Review Boards van het Fred Hutchinson Cancer Research Center en het Children "s Hospital van Philadelphia, werd verkregen van patiënten voor het verzamelen van perifere bloedmonsters. Alle institutionele richtlijnen werden waargenomen. Alle dierlijke experimenten, inclusief MEF generatie en teratoma vorming werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Ficoll Scheiding van PBMC's en uitbreiding van erytroblasten - Dag 0
- Verdun perifeer bloed 1: 1 met Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). In een 15 ml ronde bodem polystyreen buis, zorgvuldig laag 7 ml verdunde bloed op 3 ml kamertemperatuur Ficoll- Hypaque-.
- Centrifugeer het monster bij 400 xg gedurende 30 min.
- De PBMCs zal geregeld tot de interface tussen het plasma en de Ficoll-Hypaque, beschouwd als een troebele witte laag. Met behulp van een steriele transferpipet, het verzamelen van de PBMCs in een 15 ml conische buis. Breng het volume op 10 ml met behulp van DPBS.
- Met behulp van een hemacytometer, tel de PBMCs.
- Pipetteer 2 x 10 6 PBMC in een afzonderlijke 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Spin de resterende cellen en bevriezen bij een concentratie van 2 x 10 6 PBMC / ml in 90% foetaal runderserum (FBS) / 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
- Bereid Uitbreiding Medium: QBSF-60 serumvrij medium (beschermd tegen licht) + penicilline / streptomycine (1%) + ascorbinezuur (50 ng / ml) + stamcelfactor (SCF, 50 ng / ml) + interleukine 3 (IL 3, 10 ng / ml) + erytropoëtine (EPO, 2 U / ml) + insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexamethasone (1 uM; bescherming tegen licht, ontdooien eenzelfde hoeveelheid elke media veranderen).
- Resuspendeer 2 x 10 6 PBMCs in 2 ml vers medium Expansie en plaats in een putje van een 12 well weefselkweek plaat en incuberen in een 37 ° C bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% O2, 5% CO2 en 90% N2.
- Op dag 3 en dag 6, vervang media.
- Verzamel de cellen en was het goed met 2 ml QBSF-60 om eventuele resterende cellen te verzamelen.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 2 ml van nieuwe Expansion Medium en hen terug te keren naar dezelfde 12 wells plaat.
2. herprogrammeren cellen door Nucleofection - Dag 9
- Pipetteer de herprogrammering plasmiden in een steriele 1,5 ml Eppendorf buis (Tabel 1).
- Meng de nucleofectie oplossing met Supplement (door de fabrikant meegeleverd) en pipet in een steriele 1,5 ml Eppendorf buis.
- Pipetteer 2 ml Uitbreiding Medium in een putje van een 12 putjesplaat en in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% O2, 5% CO2 en 90% N2) evenwichtstoestand voorafgaand aan het toevoegen cellen.
- Verzamel degekweekte cellen en was het goed met 2 ml QBSF-60 resterende cellen te verzamelen.
- Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min en zuig de supernatant.
- Was de cellen door resuspenderen in 5 ml DPBS en centrifugeren bij 300 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig de supernatant.
- Resuspendeer de cel pellet in 100 ul nucleofectie oplossing + Supplement, en zorg ervoor dat het genereren van luchtbellen te vermijden.
- Pipetteer de celsuspensie in de buis met het herprogrammeren plasmiden, pipet op en neer eenmaal, pipet en het monster in de bodem van de nucleofection cuvette.
- Plaats de cuvette in de nucleofectie machine en run Programma T-019.
- Breng 100 pi van het voorverwarmde Expansion Medium (equilibreren van de plaat in stap 2.3) in de nucleofection cuvette.
- Onmiddellijk verzamel de volledige steekproef en storting in de put van de voorverwarmde Expansion Medium. Vermijd het verzamelen van de witte, drijvende dode cel puin. Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% O2, 5% CO2 en 90% N2) voor groei.
3. Plating Feeder Cellen - Dag 10 of 11
- Op dag 10, plaat feeder cellen.
- Coat een 6 well weefselkweek plaat met gelatine.
- Pipetteer 1 m van 0,1% gelatine in Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) in elk putje van de plaat.
- Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator gedurende ten minste 5 min.
- Vlak voor het gebruik, zuig het gelatine-oplossing van de plaat.
- Ontdooien één flacon 2 x 10 6 muis embryonale fibroblasten bestraald 3000 cGy in 10 ml voorverwarmde MEF Media (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + penicilline / streptomycine (1%)).
- Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min en zuig de supernatant. Resuspendeer de cellen in 12 ml van MEF Media en pipet 2 ml into elk putje van de gelatine beklede plaat met 6 putjes. Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% O2, 5% CO2 en 90% N2) tot dag 12.
- Coat een 6 well weefselkweek plaat met gelatine.
4. Plating Cellen op Voeder Cellen en wijzigen Medium - Dag 12
- Verzamel de nucleofected cellen in een 15 ml conische buis en laat de resterende cellen door het behandelde goed met 2 ml QBSF-60. Centrifugeer het monster bij 300 xg gedurende 5 minuten.
- Bereid herprogrammeren Medium: Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) + FBS (10%) + niet-dierlijke L-glutamine (1 mM) + niet-essentiële aminozuren (NEAA, 1%) + penicilline / streptomycine (1%) + β mercaptoethanol (0,1 mM) + basische fibroblast groeifactor (bFGF toegevoegd aan verse voeding, 10 ng / ml) + ascorbinezuur (vers toegevoegd invoersysteem, 50 ug / ml).
- Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 12 ml Medium herprogrammeren. Pipetteer 2 ml per putje van de celsuspensie inde 6 wells plaat van feeder-cellen (zoals bereid in hoofdstuk 3). Centrifugeer de plaat bij 50 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat in een bevochtigde 37 ° C incubator (5% O2, 5% CO2 en 90% N2) voor groei. Verander het herprogrammeren Medium om de andere dag, totdat iPSC kolonies beginnen te zien zijn (1-2 weken).
- Bereid hESC Medium: DMEM / F12 1: 1 + Knockout Serum vervangen (20%) + penicilline / streptomycine (1%) + NEAA (1%) + niet-dierlijke L-glutamine (1 mM) + natriumpyruvaat (1%) + natriumbicarbonaat (0,12%) + β-mercaptoethanol (0,1 mM) + bFGF (vers toegevoegd invoersysteem, 10 ng / ml)
- Bereid HDAC-remmers: natriumbutyraat (verse toegevoegd bij het voeden, 100 uM), suberanilohydroxamic zuur (SAHA, toegevoegd fris bij het voeden, 200 nm). Zodra iPSC kolonies verschijnen beginnen voeden van de cellen met hESC Medium + HDAC remmers veranderen medium elke dag.
OPMERKING: Natrium butyraat is een klein molecuul dat is geadsorbeerd aan kunststof buizen, therefore opslaan in een borosilicaat glazen buis bij 4 ° C.
5. Isoleren iPSC Clones
- Zodra iPSC kolonies groot genoeg te isoleren (20-25 cellen), pak ze met een P20 pipet.
- Bereid HDAC-remmers: natriumbutyraat (verse bij voeding toegevoegd, 100 uM), SAHA (toegevoegd fris bij het voeden, 200 nm)
- Plaats de geïsoleerde kolonies op iMEFs in individuele 35 mm schalen met hESC Medium + HDAC-remmers + Klonen & Recovery Supplement.
- De dag na het plukken van de kolonies, verander de middellange tot hESC Medium + HDAC-remmers.
- Verander het medium elke dag tot iPSC kolonies zijn klaar voor passage.
- Verwijder HDAC-remmers uit het medium eenmaal kolonies stabiliseren op passage 2-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drie dagen na nucleofection en voor electroplating de nucleofected cellen op iMEFs, de efficiency van de succesvolle nucleofection worden geschat door fluorescentie microscopie eGFP. Figuur 1 toont een typische nucleofection experiment met ongeveer 5-10% van de totale celpopulatie EGFP.
Geherprogrammeerd iPSC kolonies zal beginnen om ongeveer twee weken verschijnen nadat nucleofectie. De kolonies zijn meestal rond met goed gedefinieerde grenzen en kunnen worden geïdentificeerd door karakteristieke hESC morfologie waaronder (1) kleine, dicht opeengepakte cellen met een hoge nucleaire-cytoplasma-ratio en (2) zichtbare nucleoli (Figuur 2, Bright veld). Onvolledig geherprogrammeerd cellen zal ofwel verslechteren of vormen heterogene cel massa die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van echte iPSC kolonies.
Van de vertegenwoordiger lijnen die we hebben gekozen om volledig te karakteriseren, al drukken de standaard pluripotentie markers (figuur 2), activeren pluripotentie endogene genen (figuur 2), en vormen teratomen bij injectie in NOD-SCID muizen.
Figuur 1: Nucleofected cellen gestimuleerd PBMCs drie dagen na nucleofectie met plasmiden die OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, EBNA1, p53 shRNA en eGFP (Schaal bar is 100 micrometer)..
Figuur 2:. IPSC Karakterisering IPSC gegenereerd met behulp van deze methode vertonen hESC-achtige morfologie wanneer gekweekt op Imef (Bright veld), testen positief voor alkalische fosfatase (AP), en zijn positiefdoor immunohistochemie voor pluripotency markers TRA-1-60, TRA-1-81, en SSEA4. Bovendien endogene expressie van de pluripotentie genen Oct4 (O), Sox2 (S), Klf4 (K) en cMyc (M) detecteerbaar met RT-PCR. (Alle schaal bars zijn 100 micrometer). Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Episoom | Massa per reactie (ng) |
| pCXLE-hOct3 / 4-shp53-F | 830 |
| pCXLE-hSK | 830 |
| 830 | |
| pCXLE-EGFP | 500 |
| pCXWB-EBNA1 | 500 |
Tabel 1:. Optimale verhouding van Reprogramming plasmiden 6 Deze plasmiden zijn beschikbaar om te bestellen via Addgene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor succesvolle iPSC genereren bij gebruik van dit protocol, zijn er verschillende belangrijke uitgangspunten dat moet worden overwogen. Tijdens de erythroblast uitbreidingsfase, moeten de media verandering schema strikt worden gevolgd, als afwijkingen kunnen leiden tot inefficiënte stimulatie van de doelgroep voorlopercellen cel populatie en een lagere efficiëntie van iPSC generatie. Het is belangrijk om nieuwe uitbreiding medium met verse dexamethason met elke media verandering te maken; en de QBSF-60 base medium en dexamethason dient te worden beschermd tegen licht tijdens de opslag. Tijdens nucleofectie, de DPBS wassen is cruciaal om het overtollige opgeloste stoffen uit de cel schorsing dat de elektrische stroom kunnen veroorzaken uit de Nucleofector ARC, dat resulteert in wijdverspreide celdood te verwijderen. Ongeveer 10 dagen na nucleofectie, moet de plaat dagelijks worden onderzocht op iPSC kolonie uiterlijk. Zodra meerdere kleine kolonies aanwezig zijn, moet het herprogrammeren Medium worden veranderd in hESC Medium (met HDAC-remmers) als PROLONGEd blootstelling aan serum kan spontane differentiatie induceren.
Afhankelijk van het laboratorium set-up en de beschikbare middelen, kunnen aanpassingen aan het protocol te worden beschouwd. Liever lage O2 incubator omdat hypoxische omstandigheden is aangetoond dat de doeltreffendheid van iPSC generatie 13 vergroten; echter, hebben we succesvol genereren iPSCs uit perifeer volbloed met behulp normoxie met 5% CO 2 hadden. Daarom is een standaard bevochtigde CO2 incubator kan ook worden gebruikt. De MEF gebruikt in dit protocol kan worden gekocht van een life science vendor. Vanwege commerciële batch variabiliteit we liever iMEFs genereren van CF-1 muizen na een gepubliceerd protocol voor isolatie MEF, cultuur, en 14 bestraling. De opname van HDAC-remmers is een positief aspect van dit protocol als epigenetische remodeling is een cruciaal aspect van cellulaire herprogrammering 9,15. HDAC-inhibitoren worden weggelaten, maar het aantal fully geprogrammeerd iPSC kolonies worden verminderd. Tenslotte hebben we iPSCs deze methode een beenmerg monster zonder extra aanpassingen nodig gegenereerd.
Kortom, dit protocol gebruikt een plasmide gebaseerd systeem dat herprogrammering sommige van de nadelen van iPSC generatie vermijdt met integrerende vectoren, waaronder willekeurig inserties in het gastheergenoom en veiligheidsmaatregelen voor het omgaan met recombinant virus. Bovendien kleinschalige virusproductie en karakterisatie arbeidsintensief vergelijking met plasmide generatie. Herprogrammering efficiëntie kan ook aanzienlijk variëren door batch variabiliteit inherent aan virusproductie, terwijl een grootschalige productie van kwaliteit plasmiden kan leiden tot consistente iPSC generatie tijd. Gecombineerd met HDAC-remmers, dit protocol biedt een efficiënte methode om de integratie vrij te genereren en voetafdruk gratis iPSCs voor stamcelonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen de volgende subsidies van de NIH erkennen voor de ondersteuning van dit onderzoek: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), en K12HL0806406 (SKS); en de JP McCarthy Foundation (AR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4 °C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4 °C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4 °C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4 °C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4 °C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4 °C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4 °C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4 °C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4 °C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4 °C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4 °C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000x stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μl pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).
- Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).
- Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).
- Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).
- Azuara, V., et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
- Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).
