Summary
Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.
Abstract
Bu yazıda verimli episomal plazmitlerini ve histon deasetilaz (HDAC) inhibitörleri kullanılarak periferik kandan entegrasyonu-özgür insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerini (iPSCs) oluşturmak için bir protokol göstermektedir. Bu yaklaşımın avantajı şunlardır: (1) bir kaynak malzeme olarak periferal kan minimal bir miktarda kullanımı; (2) yeniden programlama vektörleri nonintegrating; (3) vektörü bilgilerini iPSCs üretilmesi için ekonomik bir yöntem; (4) tek bir transfeksiyon; ve (5) küçük moleküllerin kullanımı epigenetik yeniden programlama kolaylaştırmak için. Tekrar programlanması için oldukça müsait bir yüksek proliferatif eritrosit projenitör hücre popülasyonu elde etmek için kısa bir süre, periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), rutin flebotomi örnekleri izole edilir ve tanımlanmamış başka büyüme faktörleri içinde kültürlenmiştir. Nonintegrating, Oct4, Sox2, Klf4 MYCL, LIN28A ve p53 kısa saç tokası (sh) RNA'yı ifade bulaşıcı olmayan epizomal plasmidleri introdu vardırTek nucleofection ile türetilmiş eritroblast içine ced. Yeşil floresan proteini gelişmiş sentezleyen bir epizom (eGFP) olarak kotransfeksiyon transfekte hücrelerin kolay tanımlama sağlar. Epstein-Barr çekirdek antijeni 1 (EBNA1) ifade eden ayrı bir replikasyon-eksikli Plazmid aynı zamanda epizomal proteinlerin artan ekspresyonu için, reaksiyon karışımına ilave edilir. Transfekte edilmiş hücreler daha sonra, sürekli tekrar programlanması için ışınlanan fare embriyonik fibroblastlar (iMEFs) bir tabaka üzerine kaplanır. En kısa iPSC gibi koloniler nucleofection sonra yaklaşık on iki gün sonra ortaya çıktıkça, HDAC inhibitörleri epigenetik yenileme kolaylaştırmak için ortama ilave edilir. Biz, HDAC inhibitörlerinin dahil rutin olarak 2 kat kadar tam olarak yeniden programlanması iPSC kolonilerin oluşturulmasına arttırdığını bulduk. IPSC koloniler tipik insan embriyonik kök hücre (HESC) morfoloji kez, yavaşça sürekli büyüme ve genişleme için bireysel Imef kaplı doku kültürü plakalarına aktarılır.
Introduction
iPSCs pluripotense genlerin en az sayıda ektopik ekspresyonu ile somatik dokularından elde edilmektedir. Bu teknik, ilk olarak yüksek bir pluripotent durumda 1 olarak ifade edilmiştir Oct4, Sox2, Klf4 ve c-myc insan fibroblastları, retroviral kalıt ile gösterilmiştir. Bu geçici ifade "yeniden programlama faktörleri" insan embriyonik kök hücreleri 2 hedef hücrenin epigenetik peyzaj ve gen ifadesi profili benzer değiştirebilir. Oluşturulan kez, iPSCs potansiyel ileri soruşturma için herhangi bir doku tipinin içine ayırt edilebilir. Böylece, rejeneratif tıpta, hastalık modelleme ve gen terapisi uygulamalarında kullanılmak için umut vermektedir. Ancak, entegre virüs ile genomu bozan endojen gen ifadesinin, etkisi hücresel fenotip değiştirme potansiyeline sahiptir, ve sonuçta bilimsel sonuçlarını taraflı. Ayrıca, rastgele viral entegrasyonlar zararlı hücresel e yol açabilirmalign transformasyon 3 veya onkojenik transgenlerin 4 yeniden ifade olasılığı dahil olmak üzere fektleri. Gelecekteki klinik uygulamalar, entegre iPSC nesil gerektirir.
Ekstra kromozomal dairesel DNA molekülleri epizomları, maliyet etkin, entegrasyon-ücretsiz iPSCs 5 üretmek için bir strateji sunar. Tablo 1 'de gösterilen epizomal vektörlerin kombinasyonu yeniden programlama Oct4, Sox2, Klf4 MYCL ve LIN28A faktörleri ifade eder. PCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F Plazmid aynı zamanda hücre yeniden programlama 6 geliştirmek için TP53 geçici bastırılması için bir p53 shRNA içerir. Çoğaltma eksik pCXWB-EBNA1 vektör EBNA1 ifade 7 geçici bir artışa sağlayarak yeniden programlama faktörleri büyütülmesine ve artan yeniden programlama verimliliğini teşvik. PCXLE_EGFP plazmid deterjanları amacıyla nucleofection karışımına ilave edilebilirhücre tasnif uygulamalar için transfeksiyon verimliliğinin veya rmining. P CXWB-EBNA1 dışında, bu protokolde kullanılan epizomal plasmidleri konakçı hücrenin, 8 bölünme sırasında replikasyonu ve epizom bölümü vasıta olan viral replikasyon ve EBNA1 gen, Epstein-Barr virüsü kopyalama kaynağını kullanır. Epizomları kendiliğinden ardışık iPSC genişleme 7 ile kaybolur. Alt-klonlama ve EGFP ifade kaybı anlaşılacağı epizomal vektör kaybı ile iPSCs karakterizasyonu, gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda tamamen entegrasyon bilgilerini iPSCs yol açabilir.
IPSC nesil işleminden dolayı soyundan bir genin bastırılması ve pluripotense ilişkili genlerin reaktivasyonu. Gen ekspresyonunun düzenlenmesi hedef transkripsiyon faktörleri için DNA'nın ve kromatin modifikasyon, düzenleyici DNA elemanları, RNA polimeraz erişimi, çekirdek içinde birden fazla seviyede gerçekleşirgenleri yer alır. Küresel kromatin modifikasyonları ile epigenetik manzara Tadilat yeniden ifade için önemli bir bileşeni Pluripotency genetik program olduğunu. Gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli olan bir özel kromatin modifikasyon histon-DNA bobinin azalma gerilim üzerinden hedef genlere erişim sağlar, özellikle lizin kalıntıları ile histonların asetilasyon, bir. HDAC inhibitörleri, bağlı asetillenmiş durumunu 11 desteklenmesi için muhtemelen iPSC yeniden programlama ve HESC kendini yenileme 9,10 artırmak için gösterilmiştir küçük moleküllerdir. Entegre lentivirüsler 12 kullanan önceki bir yayında uyarlanan Aşağıda tarif edilen protokol, periferal kan kullanılarak epizomlar ve HDAC inhibitörleri optimize iPSC üretimi için bir adım-adım bir yöntem sağlar. Burada kullanılan adı geçen HDAC inhibitörü konsantrasyonları Ware tarafından tarif edilenler yarısı olan, ve ark., 9 ve rutin standart üzerinde tam Yeniden programlanan iPSC kolonideki 2 kat artışa yol açmıştırHDAC inhibitörleri olmadan episomal yeniden programlama protokolleri. Yeniden programlama Bu düzeyde Lentiviral yöntemleri ile dikkat verimliliği ile eşit olduğunu. Bu protokolü kullanarak, verimli yaş 87 yıl gibi eski kişilerden iPSC yarattı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulları ve Çocuklar "ın Philadelphia Hastanesi tarafından onaylanan, yazılı izin, periferik kan örneği alınmadan önce hastalardan elde edilmiştir. Tüm kurumsal düzenlemeler gözlendi. MEF nesil dahil olmak üzere tüm hayvan deneyleri ve teratom oluşumu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
PBMC'lerin ve eritroblast Genişleme 1. Ficoll Ayırma - Gündüz 0
- Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile 1: Çevresel kan 1 seyreltin. Bir 15 ml'lik yuvarlak dipli bir polistiren bir tüpte, dikkatli bir şekilde oda sıcaklığında, Ficoll-Hypaque 3 ml'lik seyreltilmiş kan 7 ml katman.
- 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- PBMC'ler plazma ve bulanık beyaz bir tabaka halinde görülmektedir Ficoll-Hypaque arasındaki arayüz yerleşmiş olacaktır. Steril bir transfer pipet kullanarak, PB toplamakBir 15 ml konik tüp içine MH'si. DPBS kullanarak 10 ml ses getirmek.
- Hemasitometre, PBMC'Ierde saymak.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de ayrı 15 ml konik tüp ve santrifüj içine Pipet 2 × 10 6 PBMC'leri. % 90 fetal sığır serumu (FBS) /% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 2 x 10 6 PBMC / ml lik bir konsantrasyonda kalan hücrelerin ve dondurularak aşağı doğru dönerler.
- Genişletme maddesi hazırlayın: QBSF-60 serum barındırmayan ortam hücre faktörü (ışıktan koruma) + Penisilin / streptomisin (% 1) + askorbik asit (50 ng / ml) + kök (SCF, 50 ng / ml) + interlökin 3 (IL- 3, 10 ng / ml) + eritropoietin (EPO, 2 U / ml) +, insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + deksametazon (1 uM, ışıktan korumak, taze bir kısım çözülme her medya ) değiştirebilirsiniz.
- Taze genleşme maddesi, 2 ml içinde süspanse 2 x 10 6 PBMC 12 çukurlu bir doku kültür plakasının bir oyuğuna yerleştirmek ve 5 olan bir atmosfere sahip 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör% O2,% 5 CO2 ve% 90 N2.
- Gün 3 ve 6. günde, ortamı değiştirin.
- Hücreleri toplamak ve kalan hücrelerin toplanması için QBSF-60, 2 ml ile iyice yıkayın.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj ve süpernatant aspire.
- Yeni Genişleme Orta 2 ml hücreleri tekrar ve aynı 12 plaka onları geri.
Nucleofection tarafından 2. yeniden programlanması Hücreler - Gün 9
- Steril bir 1.5 mi Eppendorf tüpüne (Tablo 1) yeniden programlama plazmidleri Pipet.
- Steril 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içine Supplement (imalatçısı tarafından sağlanan) ve pipet ile nucleofection çözelti karıştırın.
- Pipet 2, bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içinde 12 oyuklu plaka ve yer arasında bir oyuğuna genişletme maddesi (% 5 O2,% 5 CO2 ve% 90 N2) önce hücreler ilave edilmeden dengeleme için mi.
- Toplamakkültürlenmiş hücreler kalan hücrelerin toplanması için QBSF-60, 2 ml ile iyice yıkayın ve.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Santrifüj ve süpernatant aspire.
- DPBS 5 ml yeniden süspansiyon haline getirilmesini ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler yıkayın.
- Süpernatant aspire.
- Üreten kabarcıkları önlemek için özen, nucleofection solüsyonu + Supplement 100 ul hücre pelletini.
- Aşağı bir kez yeniden programlama plazmidler, pipet ve içeren tüp içine hücre süspansiyonu pipetle ve nucleofection küvetinin dibine örnek pipetle.
- Nucleofection makinenin içine küvet ve çalıştırmak Programı T-019 yerleştirin.
- Nucleofection küvetin içine (Adım 2.3 dengelenmesi plaka) prewarmed Expansion Orta 100 ul aktarın.
- Hemen önceden ısıtılmış Genişleme Orta kuyuya tüm örnek ve mevduat toplamak. Beyaz, yüzen ölü hücre artıkları toplama kaçının. Büyüme için, nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 O2,% 5 CO2 ve% 90 N2) altında levhayı yerleştirin.
3. Kaplama Besleyici Hücreler - Gün 10 ya da 11
- 10. günde, levha besleyici hücreler.
- Jelatin ile kaplayın, bir 6 oyuklu doku kültürü plakası.
- Pipet, plakanın her oyuğuna Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 1 M,% 0.1 jelatin.
- En az 5 dakika süreyle, nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör plaka koyun.
- Kullanmadan hemen önce, plakadan jelatin solüsyonu aspire.
- Ön ısıtması yapılan MEF Media (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (% 10) + Penisilin / streptomisin (% 1)), 10 ml 3,000 cGy ile ışımaya 2 x 10 6 fare embriyonik fibroblastlar bir şişe çözülme.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Santrifüj ve süpernatant aspire. 12 MEF Medya ml ve pipet 2 ml hücreleri tekrar süspansiyon ijelatin kaplı 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna nGoogle'a. Ortalama 12 olana kadar, bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 O2,% 5 CO2 ve% 90 N2) altında levhayı yerleştirin.
- Jelatin ile kaplayın, bir 6 oyuklu doku kültürü plakası.
4. Besleyici Hücreleri Hücreler Kaplama ve Orta değiştirme - Gün 12
- Bir adet 15 ml konik tüp nucleofected hücreleri toplamak ve QBSF-60 kuyu ile 2 ml yıkayarak kalan hücreleri toplamak. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
- Hazırlama yeniden programlanması Orta: Iscove Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM) içinde + FBS (% 10) + hayvansal olmayan L-glutamin (1 mM) + esansiyel olmayan amino asitler (NEAA,% 1) + Penisilin / streptomisin (% 1) + β P-mersaptoetanol (0.1 mM) + temel fibroblast büyüme faktörü + Askorbik asit (bFGF besleme, 10 ng / ml taze ilave edilmiş) (50 ug / ml, besleme taze ilave edildi).
- Süpernatant aspire ve yeniden programlanması Orta 12 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonunun oyuk başına Pipet 2 ml 'si içerisinebesleyici hücreler 6 oyuklu plaka (ve Bölüm 3'te hazırlandı). Oda sıcaklığında 30 dakika için 50 x g'de plaka santrifüjleyin.
- Büyüme için, nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 O2,% 5 CO2 ve% 90 N2) altında levhayı yerleştirin. IPSC koloniler (1-2 hafta) görünmeye başlaması kadar yeniden programlanması Medium her gün değiştirin.
- HESC Orta hazırlayın: DMEM / F12 1: 1 + nakavt Serum Replacement (% 20) + penisilin / streptomisin (% 1) + MEM'dir (% 1) + hayvansal olmayan L-glutamin (1 mM) + sodyum piruvat (1%) + sodyum bikarbonat (% 0.12) + β-mersaptoetanol (0.1 mM) +, bFGF (besleme taze ilave edilmiş 10 ng / ml)
- HDAC inhibitörleri hazırlayın: (besleme taze eklendi, 100 iM) sodyum bütirat, suberanilohydroxamic asit (SAHA, 200 nM, beslenme taze eklendi). IPSC koloniler görünür kez, her gün değişen orta, HESC Orta + HDAC inhibitörleri ile hücrelerini besleyerek başlar.
Not: Sodyum butirat plastik borular üzerine adsorbe küçük bir molekül olduğu, t'ninherefore 4 ° C'de bir borosilikat cam tüp içinde saklayın.
5. Yalıtımlı iPSC Klonlar
- IPSC koloni (20-25 hücre) izole edilmesi için yeterince büyük olan bir kez, bir P20 pipet ile çekme.
- HDAC inhibitörleri hazırlayın: sodyum butirat (beslenme taze eklendi, 100 M), SAHA (200 nM, beslenme taze eklendi)
- HESC Orta + HDAC inhibitörleri + Klonlama ve Kurtarma eki içeren bireysel 35 mm yemekleri iMEFs üzerine izole koloniler yerleştirin.
- Gün koloniler toplandıktan sonra, HESC Orta + HDAC inhibitörleri orta değiştirmek.
- IPSC koloniler geçiş için hazır olana kadar her gün orta değiştirin.
- Koloniler pasajda 2-3 stabilize bir kez ortamdan HDAC inhibitörleri çıkarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üç gün nucleofection sonra iMEFs üzerine nucleofected hücreleri kaplama önce başarılı nucleofection etkinliği eGFP için floresan mikroskobu ile tahmin edilmelidir. 1 EGFP ifade toplam hücre nüfusunun yaklaşık% 5-10, tipik Nucleofection deneyi göstermektedir.
Yeniden programlanan iPSC koloniler nucleofection yaklaşık iki hafta sonra görünmeye başlayacaktır. Koloniler, iyi tanımlanmış sınırlara sahip, genel olarak dairesel olan ve yüksek çekirdek sitoplazma oranı ve (2) görülebilir nukleoli (Şekil 2, parlak saha) (1), küçük, sıkı bir şekilde istiflenmiş hücreler de dahil olmak üzere özellikleri HESC morfolojisi ile tanımlanabilir. Eksik yeniden programlanan hücreler bozulmaya veya kolayca gerçek iPSC koloniler ayırt heterojen hücre kitlelerini oluşturacak ya.
Biz tamamen karakterize seçtiniz temsilcisi hatları, tüm s ifadeNOD-SCID farelerine enjekte edildiğinde link sağlamaktadır pluripotense işaretleri (Şekil 2), endojen pluripotense genleri (Şekil 2), ve form teratomlar yeniden etkinleştirmek.
Şekil 1: Nucleofected Hücreler Uyarmalı PBMCler üç gün Oct4, Sox2, Klf4 MYCL, EBNA1, p53 shRNA ve eGFP (Ölçek çubuğu 100 mikron) içeren plazmid ile nucleofection sonra..
Şekil 2:. Imef (parlak saha) üzerinde yetiştirildiğinde IPSC karakterizasyonu IPSC alkalin fosfataz aktivitesi (AP) için pozitif test eder ve pozitif, bu yöntem, sergi HESC benzeri morfoloji kullanılarak oluşturulanPluripotency belirteçlerinin TRA-1-60, TRA-1-81 ve SSEA4 immünohistokimyasal olarak. Buna ek olarak, pluripotense genler Oct4 (O), Sox2, (S), Klf4 (K) ve c-myc (M) 'nın endojen ekspresyonunun RT-PCR ile tespit edilebilir. (Tüm ölçek bar 100 mikron vardır). Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Epizomu | Reaksiyon başına Kütle (ng) |
| pCXLE-hOct3 / 4-shp53-F | 830 |
| pCXLE-HSK | 830 |
| 830 | |
| pCXLE EGFP | 500 |
| pCXWB-EBNA1 | 500 |
Tablo 1:. Yeniden programlanması plasmidler 6 optimal oranı, bu plazmidler Addgene üzerinden sipariş için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolü kullanarak başarılı iPSC nesil için, dikkat edilmesi gereken birkaç önemli uyarılar vardır. Sapmalar hedef progenitör hücre popülasyonunun verimsiz stimülasyonu ve iPSC nesil daha düşük bir verimliliğe neden olabileceğinden erythroblast genişletme aşamasında, ortam değiştirme programı sıkı, takip edilmelidir. Her ortam değişimi ile taze deksametazon ile yeni genişleme orta yapmak önemlidir; ve QBSF-60 taban ortamı deksametazon ve depolama sırasında ışıktan korunmalıdır. Nucleofection boyunca DPBS yıkama yaygın hücre ölümü ile sonuçlanan, ark Nucleofector gelen elektrik akımının neden olabilir hücre süspansiyonundan fazla çözünmüş çıkarmak için çok önemlidir. Yaklaşık 10 gün nucleofection sonra plaka iPSC koloni görünüm için günlük olarak incelenmelidir. Birkaç küçük koloniler mevcut sonra yeniden programlanması Orta prolonge olarak (HDAC inhibitörleri ile) HESC Orta değiştirilmesi gerekirserumu d maruz kendiliğinden farklılaşma neden olabilir.
Laboratuvar set-up ve mevcut kaynaklara bağlı olarak, protokole değişiklikler düşünülebilir. Hipoksik koşullar iPSC nesil 13 verimliliğini artırmak için gösterilmiştir çünkü düşük O 2 kuvöz tercih; Ancak, başarı,% 5 CO2 ile normoksik koşullar kullanılarak periferal kandan iPSCs üretilmesi oldu. Bu nedenle, standart bir nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesi de kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan MEF'ler bir yaşam bilim satıcıdan satın alınabilir. Ancak, ticari toplu değişkenliği, biz MEF izolasyon, kültür, ve ışınlama 14 için yayınlanan protokolü takip CF-1 farelerin iMEFs oluşturmak için tercih. Epigenetik yeniden şekillenme hücresel yeniden programlama 9,15 çok önemli bir yönü olduğu gibi HDAC inhibitörleri dahil bu protokolün bir olumlu yönüdür. HDAC inhibitörleri, ful ancak sayısı atlanabilirly iPSC koloniler azalacaktır yeniden programlanır. Son olarak, biz gerekli hiçbir ek değişiklik ile bir kemik iliği örneği ile bu yöntemi kullanarak iPSCs yarattı.
Özetle, bu protokol rasgele konakçı genomuna girmeleri ve rekombinant virüs muameleleri ile ilgili olarak güvenlik kaygıları da dahil olmak üzere entegre vektörü ile iPSC kuşağının bazı sakıncaları önler bir plasmid göre yeniden programlama sistemlerini kullanır. Plazmid nesil ile karşılaştırıldığında Ayrıca, küçük ölçekli virüs üretimi ve karakterizasyonu nispeten emek yoğundur. Kalite plasmidlerin bir büyük ölçekli üretim süre boyunca sabit iPSC üretilmesine yol açabilmektedir ise yeniden programlanması verimi de, virüs üretimi için doğal yığın değişkenliğine göre önemli ölçüde değişebilir. HDAC inhibitörleri ile birlikte, bu protokol özgür entegrasyonu oluşturmak ve kök hücre araştırmaları için ücretsiz iPSCs ayak izini için etkili bir yöntem sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar, bu araştırmayı desteklemek için NIH aşağıdaki hibe kabul etmek istiyorum: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS) ve K12HL0806406 (SKS); ve JP McCarthy Vakfı (AR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4 °C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4 °C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4 °C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4 °C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4 °C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4 °C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4 °C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4 °C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4 °C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4 °C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4 °C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000x stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μl pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).
- Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).
- Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).
- Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).
- Azuara, V., et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
- Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).
