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Medicine

माउस फेफड़ों पर आतंच जेल का आरोपण फेफड़े विशिष्ट एंजियोजिनेसिस अध्ययन करने के लिए

Published: December 21, 2014 doi: 10.3791/52012
Automatic Translation
1, 1
1Vascular Biology Program, Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School

Abstract

स्टेम सेल अनुसंधान और बायोइन्जिनियरिंग तकनीक में हाल ही में उल्लेखनीय प्रगति पुनर्जन्म और आर्थोपेडिक और periodontal क्षेत्रों में साधारण ऊतकों में क्षति की मरम्मत के लिए biomaterials के उपयोग में काफी प्रगति की है। अंग उत्थान की जैविक प्रक्रियाओं को अच्छी तरह से पता लगाया नहीं किया गया है क्योंकि हालांकि, संरचनाओं और इस तरह के फेफड़ों के रूप में और अधिक जटिल तीन आयामी (3 डी) अंगों के कार्यों को पुनर्जीवित करने का प्रयास बहुत सफल नहीं किया गया है। यह एंजियोजिनेसिस, नई रक्त वाहिकाओं के गठन, अंग उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि स्पष्ट होता जा रहा है। नवनियुक्त vasculatures ऑक्सीजन, पोषक तत्वों और अंग उत्थान के लिए आवश्यक हैं कि विभिन्न सेल घटकों वितरित लेकिन यह भी regenerating स्थानीय ऊतकों को शिक्षाप्रद संकेतों प्रदान नहीं केवल गठन किया था। इसलिए, सफलतापूर्वक एक वयस्क में फेफड़ों को पुनर्जीवित करने के लिए, तो वह स्थानीय फेफड़ों के ऊतकों की ड्राइव उत्थान angiogenesis में जो फेफड़ों के विशिष्ट microenvironments पुनरावृत्ति करने के लिए आवश्यक है। सह यद्यपिnventional में विवो ऐसे हाइड्रोजेल (जैसे, आतंच या कोलेजन जैल या Matrigel - Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा कोशिकाओं द्वारा स्रावित ईसीएम प्रोटीन मिश्रण) अमीर बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के चमड़े के नीचे आरोपण के रूप में एंजियोजिनेसिस assays, बड़े पैमाने पर पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है फेफड़ों में biomaterials के Orthotopic आरोपण के लिए तरीकों अच्छी तरह से स्थापित नहीं किया गया है क्योंकि angiogenesis के सामान्य तंत्र, फेफड़ों-विशिष्ट एंजियोजिनेसिस अच्छी तरह विशेषता नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को जेल के अंदर मेजबान फेफड़ों व्युत्पन्न angiogenesis के सफल आवृत्ति के लिए अनुमति देता है, रहने वाले वयस्क माउस के फेफड़ों की सतह पर आतंच जेल प्रत्यारोपण के लिए एक अनूठा तरीका लागू है। यह दृष्टिकोण फेफड़ों-विशिष्ट microenvironment सामान्य और रोग की स्थिति में दोनों angiogenesis और वायुकोशीय उत्थान को नियंत्रित करता है जिसके द्वारा तंत्र का पता लगाने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम बनाता है। प्रत्यारोपित biomaterials के रिलीज के बाद से सटे एल के भौतिक और रासायनिक संकेतों की आपूर्ति औरUng ऊतकों, रोगग्रस्त फेफड़ों पर इन biomaterials के आरोपण संभावित फेफड़ों के रोगों के विभिन्न प्रकारों के लिए नई चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए शोधकर्ताओं, सक्रिय करने के लिए आसन्न रोगग्रस्त ऊतकों मानक के अनुसार कर सकते हैं।

Introduction

इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य के शोधकर्ताओं फेफड़ों संवहनी और वायुकोशीय विकास की आणविक तंत्र को चिह्नित करने के लिए अनुमति देता है जो वयस्क माउस, की फेफड़ों के सतह पर आतंच जेल प्रत्यारोपण के लिए एक विधि लागू करने के लिए, और सक्षम biomimetic सामग्री विकसित करने के लिए इस ज्ञान का लाभ उठाने के लिए है विभिन्न फेफड़ों के रोगों के इलाज के लिए शारीरिक फेफड़ों संवहनी और वायुकोशीय गठन recapitulating की।

35 लाख से अधिक अमेरिकियों क्रोनिक प्रतिरोधी फेफड़े के रोग और फेफड़े के तंतुमयता सहित पुरानी फेफड़ों के रोगों से ग्रस्त हैं। इन रोगियों को काफी उनके दैनिक जीवन 1-3 ख़राब है जो इस तरह की सांस की तकलीफ, सीने में जकड़न, सता खांसी, और थकान के रूप में लंबे समय तक चलने क्रोनिक श्वसन लक्षण है। इन फेफड़ों के रोगों के लिए प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए प्रयास की एक बड़ी राशि के बावजूद, वर्तमान में कोई इलाज नहीं है; इसलिए, इन रोगियों के लिए जीवन की गुणवत्ता में गरीब और आर्थिक है और मानव लागत हाय कर रहे हैंजीएच 4-7। वर्तमान में, फेफड़ों प्रत्यारोपण अंतिम चरण पुरानी फेफड़ों के रोगों के साथ रोगियों को बचाने के लिए एक ही रास्ता है। हालांकि, क्योंकि प्रत्यारोपण दाताओं, उच्च लागत, गंभीर जटिलताओं, और कम जीवित रहने की दर 8-11 की कमी की वजह से, प्रत्यारोपण के एक इष्टतम तरीका नहीं है। ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक में हाल ही में तेजी से प्रगति की मूल कोशिकाओं या प्रेरित स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं 12,13 के विभिन्न प्रकारों के साथ decellularized पूरे फेफड़ों repopulating द्वारा प्रत्यारोपण फेफड़ों bioengineer शोधकर्ताओं के लिए सक्षम है। हालांकि, इन bioengineered फेफड़ों केवल आरोपण 12,14,15 के बाद कई घंटे के लिए मेजबान पशुओं में कार्य कर रहे हैं। फेफड़ों की जटिल संरचना और कार्यों को पुनर्जीवित करने के लिए biomaterials के उपयोग भी काफी असफल रहा है। वयस्क फेफड़ों के उत्थान है कि सरकार कुंजी जैविक प्रक्रियाओं को अच्छी तरह से पता लगाया नहीं किया गया है क्योंकि यह हो सकता है। फेफड़ों में, नाड़ी तंत्र के गठन जल्द से जल्द और सबसे महत्वपूर्ण घटनाओं में से एक duri हैएनजी के विकास और उत्थान 16-21। हाल में ही ऑक्सीजन, पोषक तत्वों और अंग गठन के लिए आवश्यक विभिन्न सेल घटकों देने, बल्कि आसपास की कोशिकाओं को 22-25 के लिए शिक्षाप्रद विनियामक संकेतों प्रदान नहीं फेफड़ों में vasculatures का गठन किया। इस प्रकार, एंजियोजिनेसिस वयस्क फेफड़ों 24,26,27 में पुनर्योजी alveolarization में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, अविनियमित एंजियोजिनेसिस ऐसे क्रोनिक प्रतिरोधी फेफड़े के रोग (सीओपीडी) 28, bronchopulmonary डिस्प्लासिया (बीपीडी) 21-23, और फेफड़े फाइब्रोसिस 29 के रूप में पुरानी फेफड़ों के रोगों के लिए योगदान देता है। इस प्रकार, फेफड़ों इंजीनियरिंग या पुरानी फेफड़ों के रोगों के इलाज के लिए और अधिक कुशल रणनीति विकसित करने के लिए, यह फेफड़ों-विशिष्ट angiogenesis के मौलिक तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है।

प्रत्येक अंग शारीरिक और रोग की स्थिति 30-33 के बीच भिन्न हो सकती है, जो अद्वितीय यांत्रिक और रासायनिक गुणों, प्रदर्शित करता है। ये अंग विशेष microenvironबयान endothelial सेल व्यवहार को विनियमित करने और एक अंग विशेष तरीके 24,34-36 में संवहनी नेटवर्क के गठन आर्केस्ट्रा। इस प्रकार, फेफड़ों के उत्थान के लिए और अधिक कुशल रणनीति विकसित करने, फेफड़ों-विशिष्ट angiogenesis के अंतर्निहित तंत्र समझ में आ जाना चाहिए। इस तरह के चमड़े के नीचे हाइड्रोजेल आरोपण के रूप में विवो पारंपरिक एंजियोजिनेसिस assays के angiogenesis अनुसंधान 37-39 के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, उन तरीकों अंग विशेष एंजियोजिनेसिस पुनरावृत्ति नहीं है। हाल ही में, माउस फेफड़ों पर एक इलास्टिक सांचे में Matrigel प्रत्यारोपण के लिए एक उपन्यास विधि विकसित की है और सफलतापूर्वक जैल 22 में रक्त वाहिकाओं और फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं की भर्ती के लिए दिखाया गया है। यह अनूठा तरीका शोधकर्ताओं शारीरिक और रोग की स्थिति में रक्त वाहिकाओं और गैर-संवहनी फेफड़ों की कोशिकाओं के बीच फेफड़ों-विशिष्ट angiogenesis के तंत्र के रूप में अच्छी तरह से बातचीत का पता लगाने के लिए अनुमति देगा। 1) Matrigel नैदानिक ​​आवेदन के लिए उपयुक्त नहीं है; 2) ईएक और अधिक नैदानिक ​​प्रासंगिक दृष्टिकोण के रूप में, हाइड्रोजेल और मेजबान फेफड़े के ऊतकों और 3) फेफड़ों पर लोचदार ढालना संभावित श्वसन के दौरान फेफड़ों की कार्यक्षमता और दर्द की हानि का कारण बनता है के बीच बातचीत प्रभावित कर सकता है जेल कास्ट करने के लिए इस्तेमाल किया lastic मिट्टी, एक 3 डी आतंच मैट्रिक्स वाहिकाजनक कारकों से युक्त (संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) / बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF)) लोचदार सांचे में कास्टिंग बिना माउस फेफड़ों पर प्रत्यारोपित कर दिया गया है, और सफलतापूर्वक मेजबान फेफड़ों व्युत्पन्न एंजियोजिनेसिस recapitulated गया है। आतंच जेल, थ्रोम्बिन-cleaved फाइब्रिनोजेन से उत्पन्न बहुलक तंतुओं, फंसाने के लिए विवो 40,41 में angiogenesis में तेजी लाने के लिए इस तरह के bFGF और वीईजीएफ़ रूप वाहिकाजनक कारकों की एक किस्म में जाना जाता है। क्योंकि इसके पुनर्योजी क्षमता और biodegradable प्रकृति 42 की, आतंच जेल व्यापक रूप से ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है।

इस अनुच्छेद के रहने वाले Adul के फेफड़ों की सतह पर आतंच जेल प्रत्यारोपण के लिए एक उपन्यास और अद्वितीय दृष्टिकोण का परिचयटी माउस और मेजबान फेफड़ों व्युत्पन्न एंजियोजिनेसिस विवो में जैल अंदर recapitulated है कि यह दर्शाता है। फेफड़ों के विशिष्ट एंजियोजिनेसिस अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं जो इस विधि की संभावना फेफड़ों के रोगों के विभिन्न प्रकारों के लिए नई चिकित्सकीय दृष्टिकोण के विकास के लिए नेतृत्व और काफी सफलतापूर्वक वयस्क फेफड़ों को पुनर्जीवित करने के प्रयासों को अग्रिम जाएगा।

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Protocol

नोट: इन विवो पशु अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार बाहर किया गया था। प्रोटोकॉल की समीक्षा की और बोस्टन बच्चों के अस्पताल के पशु की देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल नंबर: 13-10-2526R, 14-02-2568R) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी दवाओं दवा ग्रेड रहे हैं और इन दवाओं बाँझ शर्तों के तहत तैयार किए जाते हैं।

1. आतंच जेल तैयारी

  1. वीईजीएफ़ और bFGF जिसमें आतंच जेल तैयार करें।
    1. कमरे के तापमान को -80 डिग्री सेल्सियस (25 डिग्री सेल्सियस) पर जमा हो जाती है कि फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन का पिघलना शेयर समाधान।
    2. फाइब्रिनोजेन के लिए: (0-100 एनजी / एमएल अंतिम एकाग्रता), 2 CaCl (अंतिम एकाग्रता: 45 मिमी), वीईजीएफ़ (अंतिम एकाग्रता 0-100 एनजी / एमएल) और bFGF: थ्रोम्बिन (2.5 यू / एमएल अंतिम एकाग्रता) जोड़ें समाधान (अंतिम एकाग्रता: 0.9% sodiu में 12.5 मिलीग्राम / मिलीलीटरएम 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में क्लोराइड समाधान 43-45)।
    3. Pipetting द्वारा धीरे मिलाएं।
    4. धीरे P200 विंदुक टिप का उपयोग कर एक बूंद के लिहाज से फैशन में एक बाँझ प्लास्टिक पकवान पर मिश्रण के 200 μl विंदुक।
    5. वे जमना जब तक 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बूंदों को सेते हैं।
      नोट: जम जेल आरोपण (चित्रा 1 ए) से पहले कई घंटे के लिए कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर मोहरबंद प्लास्टिक डिश में रखा जा सकता है।
  2. आरोपण से पहले छोटे शल्य कैंची का उपयोग लगभग 3 एक्स 3 एक्स 3 मिमी cubes में आतंच जेल ट्रिम।

2. माउस तैयारी

  1. Intraperitoneal द्वारा ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के इंजेक्शन (आईपी) वयस्क माउस (8-12 सप्ताह) anesthetize और माउस को पर्याप्त रूप से माउस के पैर की अंगुली pinching द्वारा anesthetized है कि इस बात की पुष्टि।
    1. प्रयोग के दौरान सूखापन को रोकने के लिए माउस की आँखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
  2. शेव फूमाउस के रिब पिंजरे के बाएं किनारे पर आर।
  3. माउस के अंतःश्वासनलीय इंटुबैषेण प्रदर्शन करते हैं।
  4. इंटुबैषेण पर माउस 70 डिग्री पर angled खड़ा है और स्टैंड के शीर्ष पर स्थित एक छोटे से रबर बैंड पर अपने ऊपरी incisors hooking द्वारा जगह में माउस पकड़ रखें।
  5. धीरे कुंद संदंश का उपयोग कर एक तरफ जीभ वापस लेना।
  6. एक फाइबर ऑप्टिक gooseneck माइक्रोस्कोप प्रकाशक की सहायता से गला कल्पना।
  7. श्वासनली में अंतःश्वासनलीय लोचदार कैथेटर (21 जी) डालें।
  8. माउस अनायास (नियमित 100-150 साँस / मिनट, कोई उलटी या उथले श्वसन) एक चिकनी तरीके से साँस ले रहा है कि पुष्टि करें।
  9. विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे प्रवण स्थिति में माउस रखें।
  10. यंत्रवत् एक कृंतक वेंटीलेटर का उपयोग कर माउस हवादार (150 साँस / मिनट और 7 मिलीग्राम / ज्वार की मात्रा किग्रा)।
  11. 4 वें और 5 वें पसली के बीच पसलियों के बीच अंतरिक्ष का पता लगाने की पसलियों गणना।
  12. क्षेत्र ख पर एक बाँझ क्षेत्र बनाएँY अच्छी तरह से शराब और povidone आयोडीन के साथ नीचे पोंछते। एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा के साथ पर्याप्त रूप से शल्य चिकित्सा क्षेत्र को कवर किया।

3. माउस सर्जरी

  1. त्वचा में 0.25% Bupivacaine (200 μl) के स्थानीय इंजेक्शन के बाद, विदारक कैंची का उपयोग पसलियों के बीच अंतरिक्ष के ऊपर एक अनुप्रस्थ त्वचा चीरा (लगभग 1 सेमी लंबाई) बनाते हैं।
  2. पसलियों के बीच मांसपेशियों में 0.25% Bupivacaine (200 μl) के इंजेक्शन के बाद, ठीक छोटी कैंची का उपयोग 4 वें और 5 वें पसली के बीच एक मांसपेशी चीरा बनाते हैं।
  3. पूरी तरह से बाएं फेफड़े कल्पना करने के लिए पसलियों के बीच एक विदारक प्रतिकर्षक डालें।
    1. ठीक संदंश का उपयोग करते हुए बाएं फेफड़े के केंद्र की आंत का फुस्फुस का आवरण के एक छोटे से क्षेत्र (1 x 1 मिमी वर्ग) परिमार्जन।
    2. खून बह रहा है और हवा लीक पूरी तरह से नियंत्रित कर रहे हैं जब तक एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग कर क्षेत्र पर कोमल दबाव लागू करें।
    3. फाइब्रिनोजेन / थ्रोम्बिन (आतंच गोंद) की ताजा मिश्रण (कदम 1.1.2। 20 & # की छोटी राशि डाल181; P200 विंदुक टिप का उपयोग क्षेत्र के ऊपर एल)।
  4. धीरे क्षेत्र (चित्रा 1 बी) पर छोटे संदंश का उपयोग कर एक आतंच जेल (1.2 चरण) रखें।
    1. जेल में अच्छी तरह से फेफड़ों की सांस आंदोलनों के दौरान क्षेत्र पर तय हो गई है कि पुष्टि करें।
  5. न तो बड़े पैमाने पर हवा लीक न ही फेफड़ों से खून बह रहा है कि वहाँ सुनिश्चित करें।
  6. जो नहीं है absorbable सीवन के साथ बंद चीरों (मांसपेशियों और त्वचा की परतों), हटाया जाना है।
  7. वातिलवक्ष को रोकने के लिए 27 जी सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग वक्ष गुहा aspirate।
  8. यांत्रिक वेंटीलेशन बर्खास्त।

4. माउस रिकवरी

  1. माउस अनायास एक आसान तरीका (नियमित 100-150 साँस / मिनट, कोई उलटी या उथले श्वसन) में साँस ले रहा है सुनिश्चित करें।
  2. आईपी ​​के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन निर्जलीकरण को रोकने के लिए सोडियम क्लोराइड 0.9% पूर्व गर्म।
  3. माउस परिसंचारी गर्म पानी पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति दें।
  4. Endotrache निकालेंमाउस स्थिर साँस लेने की है कि इस बात की पुष्टि के बाद अल ट्यूब।
  5. पश्चात एनाल्जेसिक के रूप में तीन दिनों के लिए, Meloxicam (5 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे इंजेक्शन (अनुसूचित जाति) इंजेक्षन।
  6. यह (अपने पेट पर रोल करने के लिए सक्षम और ईमानदार रहना) sternal है और होश में जब तक ध्यान से 15 मिनट के अंतराल की एक न्यूनतम पर माउस की गतिविधियों पर नजर रखने।
  7. वसूली के बाद, सर्जरी के बिना चूहों से अलग एक नए पिंजरे करने के लिए माउस वापसी।
  8. दैनिक निम्नलिखित संक्रमण के लक्षण (लालिमा, सूजन, मुक्ति), पशु की बुनियादी जीवविज्ञान का कार्य (भोजन और पानी का सेवन, पेशाब, शौच, शरीर के वजन) के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक ​​लक्षण संकट के लिए शल्य साइट (piloerection, कम हरकत) की निगरानी शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया।

5. फसल काटने फेफड़े

  1. 7 से 30 दिनों के आरोपण के बाद, संकुचित गैस के स्रोत के माध्यम से सीओ 2 का उपयोग माउस euthanize।
  2. Xyphoid प्रक्रिया की नोक और sternal के बीच एक चीरानिशान (मंझला sternotomy) और ट्रेकिआ काटने और हृदय, फेफड़े, और श्वासनली के लिए सभी कनेक्शनों विदारक द्वारा ऊतकीय और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए प्रत्यारोपित जेल के साथ फसल पूरी फेफड़ों।
  3. रातोंरात अक्टूबर परिसर में एम्बेड 4 डिग्री सेल्सियस, पर 4% paraformaldehyde समाधान के साथ फेफड़ों के साथ प्रत्यारोपित जेल फिक्स, और 30 माइक्रोन मोटाई के धारावाहिक कदम वर्गों ले।
  4. ऊतकीय (hematoxylin और eosin धुंधला) और immunohistochemical विश्लेषण प्रदर्शन (endothelial मार्कर: CD31, उपकला मार्कर: aquaporin (AQP) 5 और surfactant प्रोटीन (सपा) बी) confocal खुर्दबीन 22,37,40 के प्रयोग से।
  5. 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 37 का उपयोग कर फेफड़ों endothelial के तीन आयामी चित्र और उपकला कोशिकाओं के लिए फार्म ऑप्टिकल वर्गों (मोटी 30 माइक्रोन) के ढेर संकलित करें।
  6. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 46 का उपयोग करते हुए नवगठित रक्त वाहिकाओं का अनुमान क्षेत्रों यों।

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Representative Results

मेजबान फेफड़ों व्युत्पन्न संवहनी गठन के फेफड़ों पर प्रत्यारोपित biomaterials के अंदर recapitulated है कि क्या जांच करने के लिए, आतंच जैल प्रमुख वाहिकाजनक कारकों वीईजीएफ़ और bFGF के साथ पूरक (0, 10 और 100 एनजी / एमएल प्रत्येक) के रूप में रहने माउस फेफड़ों की सतह पर प्रत्यारोपित किया गया Matrigel 22 का उपयोग कर सूचना दी। चित्रा 1 ए में दिखाया गया के रूप में इन वाहिकाजनक वृद्धि कारक होते हैं कि आतंच जैल 47 गढ़े गए थे। Thoracotomy के बाद, बाएं फेफड़े सतह के एक छोटे से क्षेत्र संदंश का उपयोग scraped किया गया था और गढ़े आतंच जेल एफडीए को मंजूरी दे दी है और व्यापक रूप से रोकने के लिए एक प्रभावी सीलेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है जो आतंच गोंद की एक छोटी राशि का उपयोग कर वयस्क माउस के फेफड़े, पर प्रत्यारोपित किया गया था हवा लीक और फेफड़ों की सर्जरी में 48,49 (चित्रा 1 बी) खून बह रहा कम। ज्यादातर चूहों गंभीर श्वसन लक्षण (जैसे, वातिलवक्ष, श्वसन संकट) के बिना बरामद किया। सात दिनों के आरोपण के बाद, चूहों euthanized और फेफड़ों harve थेsted। प्रत्यारोपित आतंच जेल 7 दिनों के आरोपण (चित्रा -1 सी) के बाद मेजबान फेफड़ों में शामिल किया गया था। Confocal प्रतिदीप्ति छवियों के 3 डी पुनर्निर्माण एक वीईजीएफ़ / bFGF के खुराक पर निर्भर रास्ते में 7 दिनों के आरोपण के बाद जैल अंदर संवहनी नेटवर्क का गठन किया कि मेजबान व्युत्पन्न CD31 पॉजिटिव endothelial कोशिकाओं से पता चला है (चित्रा 2A, ग)। प्रकार मैं (AQP5 सकारात्मक) और प्रकार द्वितीय (सपा-बी सकारात्मक) फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं को भी वीईजीएफ़ और bFGF (प्रत्येक 100 एनजी / एमएल) (2A चित्रा) के उच्च सांद्रता के साथ पूरक थे कि जैल के अंदर नवगठित रक्त वाहिकाओं के साथ भर्ती किया गया । ऊतकीय वर्गों के एच एंड ई धुंधला मेजबान कोशिकाओं के अन्य प्रकार के भी आरोपण (चित्रा 2 बी) के बाद जेल में 7 दिन में चले कि पता चला। इन निष्कर्षों को मेजबान फेफड़ों व्युत्पन्न पुनर्योजी संवहनी नेटवर्क सफलतापूर्वक वाहिकाजनक कारकों के साथ पूरक और वयस्क एमओयू की सतह पर प्रत्यारोपित कर रहे हैं कि आतंच जैल के अंदर निर्माण कर रहे हैं सुझाव है किएसई फेफड़ों।

चित्रा 1
चित्रा 1:। बाएं फेफड़े (तीर) के scraped आंत फुस्फुस से अधिक प्रत्यारोपित आरोपण से पहले तैयार (क) आतंच जेल (ख) आतंच जेल (ग) प्रत्यारोपित आतंच जेल (तीर) 7 दिनों के आरोपण के बाद मेजबान फेफड़ों में शामिल किया।। स्केल सलाखों 1 मिमी।

चित्रा 2
चित्रा 2: (क) संवहनी नेटवर्क के गठन दिखा प्रतिदीप्ति micrographs (CD31 सकारात्मक, हरा) और भर्ती प्रकार मैं (AQP5 पॉजिटिव; मैजंटा) या प्रकार द्वितीय (सपा-बी सकारात्मक; मैजंटा) आतंच जेल के अंदर फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं के साथ पूरक वीईजीएफ़ और bFGF के विभिन्न सांद्रता (7 दिनों के आरोपण के बाद / मिलीलीटर प्रत्येक) एनजी 0, 10 और 100। धराशायी लाइनों प्रत्यारोपित आतंच जेल और मेजबान फेफड़ों के बीच इंटरफेस संकेत मिलता है। स्केल बार:। 20 माइक्रोन (ख) 7 दिनों के आरोपण के बाद आतंच जेल में मेजबान कोशिकाओं की घुसपैठ दिखा एच एंड ई धुंधला की हल्की माइक्रोग्राफ। तीर जेल और मेजबान फेफड़ों के बीच इंटरफेस संकेत मिलता है। स्केल बार: 20 माइक्रोन वीईजीएफ़ और bFGF के विभिन्न सांद्रता के साथ पूरक हैं कि आतंच जैल में नवगठित रक्त वाहिकाओं का अनुमान क्षेत्रों दिखा रहा है (सी) ग्राफ़ 7 दिनों के आरोपण के बाद (0, 10 और 100 प्रत्येक / मिलीलीटर एनजी)।।

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Discussion

यह लेख वयस्क माउस रहने के फेफड़ों की सतह पर biomaterials के प्रत्यारोपण के लिए एक नई विधि का परिचय। इस प्रणाली के साथ, मेजबान फेफड़ों व्युत्पन्न एंजियोजिनेसिस सफलतापूर्वक सामग्री के अंदर recapitulated है। इस प्रणाली के शोधकर्ताओं endothelial कोशिकाओं के बीच crosstalk पता लगाने के लिए अनुमति देता है, अन्य कोशिकाओं (जैसे, उपकला कोशिकाओं, mesenchymal कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं) स्थानीय एंजियोजिनेसिस 50-53 और वायुकोशीय उत्थान 24,54 के लिए आवश्यक हैं कि और विभिन्न ईसीएम घटकों। पारंपरिक vivo में चमड़े के नीचे हाइड्रोजेल आरोपण angiogenesis अनुसंधान 37-39 के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, उन तरीकों अंग विशेष एंजियोजिनेसिस पुनरावृत्ति नहीं है। हाइड्रोजेल फेफड़ों की सतह पर सीधे प्रत्यारोपित किया जाता है जो इस प्रणाली में, वयस्क माउस फेफड़ों में angiogenesis और वायुकोशीय उत्थान में फेफड़ों के विशिष्ट microenvironment की भूमिका का पता लगाने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम हो जाएगा। ये जैल विभिन्न ईसीएम अमीर biomate से निर्मित किया जा सकता हैविभिन्न रासायनिक कारकों (जैसे, वाहिकाजनक कारकों, वृद्धि कारकों) 55,56, पूर्वज कोशिकाओं और / या आईपीएस कोशिकाओं के साथ पूरक किया जा सकता है कि rials (जैसे, कोलेजन, fibrins)। रासायनिक कारकों के अलावा, यांत्रिक बलों को भी एंजियोजिनेसिस 23,37 नियंत्रित करते हैं। एक फाइब्रिनोजेन एकाग्रता पर निर्भर तरीके से 57 और रासायनिक संकेतों के माध्यम से बल्कि शारीरिक संकेतों 58,59 के माध्यम से न केवल एंजियोजिनेसिस को प्रभावित कर सकता फाइब्रिनोजेन एकाग्रता जोड़ तोड़ में आतंच जेल में परिवर्तन की कठोरता। इसलिए, आतंच जैल के भौतिक गुणों भविष्य में शारीरिक अंग विशेष एंजियोजिनेसिस पुनरावृत्ति को ध्यान से अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। आंत का फुस्फुस scraping के बाद घाव भरने में भी मेजबान कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार भी शामिल है और घाव भरने की प्रक्रिया और ऊतक पुनर्जनन को बढ़ावा देता है जो एक अंतर्जात आतंच थक्का, पैदा करता है। यह प्राकृतिक थक्का angio को नियंत्रित इसलिए exogenously प्रत्यारोपित आतंच जेल के साथ बातचीत कर सकते हैं औरप्रत्यारोपित जेल में उत्पत्ति। Fluorescently लेबल फाइब्रिनोजेन प्राकृतिक आतंच थक्का और प्रत्यारोपित आतंच जेल के बीच भेद और इन तंत्र का पता लगाने के लिए शोधकर्ताओं सक्षम हो सकता है। इस नवजात चूहों होगा संभावना मौजूद तकनीकी चुनौतियों में फेफड़ों के विकास और बीमारियों के अध्ययन के लिए वयस्क माउस फेफड़ों में angiogenesis, आवेदन चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है यद्यपि।

इस अध्ययन का अंतिम लक्ष्य रोगग्रस्त फेफड़ों पर प्रत्यारोपित आतंच जैल में कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं को भर्ती करने और कार्यात्मक फेफड़ों संरचनाओं को बहाल करने के लिए एक चिकित्सा उपकरण के रूप में मैट्रिक्स का उपयोग करने के लिए है। संभव जैल अंदर मेजबान कोशिकाओं और नाड़ी और वायुकोशीय संरचनाओं के बीच संचार के रूप में अच्छी तरह से इन संरचनाओं की कार्यक्षमता भविष्य प्रयोगों में पता लगाया जाना चाहिए। फेफड़ों में वीईजीएफ़ स्तरों बीपीडी 60 और वातस्फीति 61 के साथ रोगियों में कम कर रहे हैं के बाद से, मैट्रिक्स को वीईजीएफ़ जोड़ने मैट्रिक्स impl में रक्त वाहिकाओं की भर्ती में सुधार हो सकताइन रोगग्रस्त फेफड़ों पर anted। यांत्रिक गुणों को भी स्वस्थ और रोगग्रस्त फेफड़ों 23,62 के बीच मतभेद है। उदाहरण के लिए, गिरावट और कोलेजन के crosslinking जो नियंत्रण मैट्रिक्स metalloproteinases और lysyl ओक्सीडेस, की अभिव्यक्ति, क्रमशः, सीओपीडी और फेफड़े के तंतुमयता 63-67 सहित विभिन्न फेफड़ों के रोगों में बदल रहे हैं। रोगग्रस्त फेफड़ों में, फेफड़ों endothelial और उपकला कोशिकाओं के लिए progenitors के कुछ प्रजातियों 68 समाप्त हो रहे हैं। इस प्रकार, पूर्वज कोशिकाओं के साथ पूरक आतंच जैल इन कारकों (वाहिकाजनक कारकों, ECMs, ईसीएम कठोरता) से छेड़छाड़ या दाखिल 69 संभावना मैट्रिक्स और विभिन्न रोग की स्थिति में फेफड़ों के समारोह की वसूली के अंदर कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं के गठन के लिए नेतृत्व करेंगे। रासायनिक कारकों स्थानीय एंजियोजिनेसिस मिलाना आतंच जैल के अंदर पूरक हो सकता है, इस प्रणाली को भी पुरानी फेफड़ों के रोगों में रोगग्रस्त फेफड़ों मानक के अनुसार हो सकता है कि विशिष्ट पर्यावरण संकेतों का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है। सारांश में, इस लेख विवो में फेफड़ों के विशिष्ट एंजियोजिनेसिस चिह्नित करने के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं जो रहने वाले माउस, की फेफड़ों के सतह पर आतंच हाइड्रोजेल प्रत्यारोपण के लिए एक विधि का परिचय। विभिन्न कारकों में संशोधन (जैसे, समय बेशक, सांद्रता और वाहिकाजनक कारकों का संयोजन, हाइड्रोजेल के विभिन्न प्रकार, हाइड्रोजेल के भौतिक गुणों) इस प्रणाली में, फेफड़ों में angiogenesis और उत्थान के तंत्र का अनावरण करेंगे। इस प्रकार, इस प्रणाली काफी बुनियादी संवहनी जीव विज्ञान, ऊतक इंजीनियरिंग के वैज्ञानिक ज्ञान है, साथ ही फेफड़े दवा अग्रिम जाएगा।

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Acknowledgments

इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (एएम), अमेरिका के रक्षा विभाग (BC074986), और बोस्टन बच्चों के अस्पताल संकाय कैरियर विकास फैलोशिप (टीएम, एएम) से धन के द्वारा समर्थित किया गया। लेखकों तकनीकी सहायता के लिए अमांडा जियांग और एलिसाबेथ जियांग धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen from human placenta Sigma F4883 For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma Sigma T9549 For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164 R&D 493-MV For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF R&D 3139-FB For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific INC RIS 100 For intubation
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-565-35 For intubation
21 G Elastic catheter B.Braun 4251652-02 For intubation
MiniVent Ventilator Harvard Apparatus CGS-8009 For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope Fisher Scientific 12-070-515 For surgey
Absobable suture Ethicon PDP304 Surgical suture
Antibody against CD31 BD Biosciences 553370 Immunohistochemistry
Antibody against AQP5 Abcam AB78486 Immunohistochemistry
Antibody against SP-B Abcam AB40876 Immunohistochemistry

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बेसिक प्रोटोकॉल अंक 94 फेफड़े एंजियोजिनेसिस उत्थान आतंच जेल आरोपण microenvironment
माउस फेफड़ों पर आतंच जेल का आरोपण फेफड़े विशिष्ट एंजियोजिनेसिस अध्ययन करने के लिए
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Mammoto, T., Mammoto, A.… More

Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012, doi:10.3791/52012 (2014).

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