DNA och proteiner sekvens specifikt märkt med affinitet eller fluorescerande reportergrupper som använder DNA- eller protein metyltransferaser och syntetiska kofaktor analoger. Beroende på kofaktor specificiteten av enzymer, aziridin eller dubbla aktiverade kofaktor analoger används för en eller två steg märkning.
S -Adenosyl-l-metionin (AdoMet eller SAM) -beroende metyltransferaser (MTAse) katalyserar överföringen av den aktiverade metylgrupp från AdoMet till särskilda positioner i DNA, RNA, proteiner och små biomolekyler. Denna naturliga metyleringsreaktion kan expanderas till en bred variation av alkyleringsreaktioner som använder syntetiska kofaktor analoger. Ersättning av det reaktiva sulfonium centrum AdoMet med en aziridinring leder till kofaktorer som kan kopplas med DNA genom olika DNA MTases. Dessa aziridin kofaktorer kan utrustas med reportergrupper vid olika positioner av adenin molekyldel och användas för S equence specifik M ethyltransferase- jag nduced L abel ning av DNA (ler-DNA). Som ett typiskt exempel ger vi ett protokoll för biotinylering av pBR322 plasmid-DNA vid 5'-ATCG En T-3 'sekvensen med DNA MTAse M.BseCI och aziridin cofaktor 6BAz iett steg. Förlängning av den aktiverade metylgruppen med omättade alkylgrupper resulterar i en annan klass av AdoMet-analoger, vilka används för m ethyltransferase riktad T verföring av A ctivated G roups (mtag). Eftersom de förlängda sidokedjor aktiveras av sulfonium centrum och den omättade bindningen, dessa kofaktorer kallas dubbel aktiverade AdoMet analoger. Dessa analoger inte bara funktion som kofaktorer för DNA MTases, som aziridinen kofaktorer, utan också för RNA, protein och småmolekylära MTases. De används vanligtvis för enzymatisk modifiering av MTAse substrat med unika funktionella grupper som är märkta med reportergrupper i ett andra kemiskt steg. Detta exemplifieras i ett protokoll för fluorescensmärkning av histon H3 protein. En liten propargylgrupp överförs från kofaktorn analoga SeAdoYn till proteinet av histon H3 lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 följt av klick märkning avalkynylated histon H3 med TAMRA azid. MTAse-medierad märkning med kofaktor analoger är en möjliggörande teknik för många spännande tillämpningar inklusive identifiering och funktionell studie av MTAse substrat samt DNA genotypning och metylering upptäckt.
Specifik märkning av nukleinsyror 1,2 och proteiner 3,4 är av stort intresse för funktionella karakteriseringar, medicinsk diagnos och (nano) bioteknik. Här presenterar vi en enzymatisk märkningsmetod för dessa biopolymerer som är baserad på S -adenosyl-l-metionin (AdoMet eller SAM) -beroende metyltransferaser (MTases). Denna klass av enzymer (EG 2.1.1.) Riktar enskilda nukleofila positioner (kväve, syre, svavel och kolatomer) inom specifika rester av nukleinsyror och proteiner och naturligt överför den aktiverade metylgruppen i kofaktorn AdoMet (Figur 1A) 5. Dessutom kan MTases använda syntetiska kofaktor analoger för särskild märkning med affinitetstaggar, fluoroforer eller andra etiketter (Figur 1B) 6. Två klasser av AdoMet analoger har utvecklats: Aziridine kofaktorer för S equence specifika M ethyltransferase- I </strong> Nduced L abel ing (ler) 7 och dubbla aktiverade AdoMet analoger för m ethyltransferase styrd T verföring av A ctivated G roups (mtag) 8.
Figur 1: Reaktioner som katalyseras av metyltransferaser (MTases) A. Metyl gruppöverföring från den naturliga kofaktorn AdoMet (SAM) till olika substrat inklusive DNA, RNA, proteiner och små biomolekyler B. Märkning / funktionalisering av nukleinsyror och proteiner (NNNNN =.. baspar för DNA, nukleotider för RNA och aminosyror för proteiner; XXXXX = igenkänningssekvensen för MTAse med målresten i grönt) med syntetiska kofaktor analoger. Aziridinen kofaktorer som innehåller en reportergrupp (blå sfär)fäst till adeninringen är sekvens specifikt kopplad med målresten (vänster) och dubbels aktiverad AdoMet analoger leder till överföring av utökade alkylkedjor som bär en kemisk reporter Y (till höger), som kan märkas genom bioorthogonal klick reaktion i ett andra steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Aziridin kofaktorer fungerar bäst med DNA MTases. De innehåller en tre-ledad ring med en kväveatom 9 (eller en N -mustard 10,11) i stället för den sulfonium mitten som reaktiv grupp. Protonering av denna kväveatom aktiverar aziridinringen för nukleofil attack av målnukleotidsekvensen som leder till kovalent koppling av hela kofaktorn med DNA. Genom att fästa reportergrupper till adeninringen aziridinen kofaktorer kan användas i kombination med DNA MTases att märka DNA i ett steg ( <stron g> Figur 1B, vänster) 7,12. Detta visas i detalj för biotinylering av DNA med 6BAz 13-15 (aziridin kofaktor med biotin fäst till 6-positionen av adeninringen) och adenin-specifika DNA MTAse från Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (figur 2, se protokollet avsnitt 2: Ett steg märkning av DNA via aziridin kofaktorer). Förutom M.BseCI (5'-ATCG A T-3 'igenkänningssekvens), DNA MTases från Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG A -3'), från Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 "-G C GC-3 ') och från Spiro (M.SssI, 5'C G-3') har med framgång använts för att biotinylera DNA med 6BAz 17. Dessutom kan aziridin kofaktorer användas för ett steg fluorescens DNA märkning 18,19.
INNEHÅLL "fo: keep-together.within-page =" always ">Dubbla aktiverade AdoMet analoger innehåller förlängt omättade sidokedjor i stället för en metylgrupp vid sulfonium centret (Figur 1B </strong>, höger) 20. Den omättade dubbel- eller trippelbindning i β-position till sulfoniumsalt centret kompenserar elektroniskt ogynnsamma steriska effekter inom övergångstillståndet genom konjugativ stabilisering. Eftersom både sulfonium centrum och den omättade bindningen aktiverar sidokedjan för enzymatisk överföring, var dessa kofaktorer som heter dubbel aktiverade AdoMet analoger. Vanligtvis används de för att överföra sidokedjor med unika kemiska grupper (kemiska reportrar), som amino, alkyn- och azid grupper, för kemo-selektiv märkning i ett andra steg 8,21. I allmänhet, dubbel aktiverade AdoMet analoger kan inte bara fungera som kofaktorer för DNA MTases 8,20,21 utan också för RNA MTases 22,23 och protein MTases 24-28 möjliggör ytterligare märkning av RNA och proteiner. Men de förlängda sidokedjor är steriskt mer krävande än en metylgrupp och utvidga de MTAse aktiva webbplatser genom proteinteknik är oftsv krävs för att få effektiva överföringshastigheter. En annan lösning på detta problem är att använda en AdoMet analog med en liten propargylgrupp (tre kolatomer) där den terminala alkynen tjänar två funktioner: 1. Stabilisering av övergångstillståndet under enzymatisk överföring och 2. reaktivt handtag för följande kemiska modifikationer av koppar- katalyserad azid-alkyn cykloaddition (CuAAC) klicka kemi. Det visade sig att den resulte propargylic AdoMet analog 29 är ganska instabil under neutrala eller svagt basiska förhållanden och endast begränsad användning. Denna nackdel kan åtgärdas genom att ersätta svavelatomen med selen. Den resulte cofaktor 5 '- [(Se) [(3S) -3-amino-3-karboxipropyl] prop-2-ynylselenonio] -5'-deoxiadenosin (SeAdoYn, fig 3) accepteras av vildtyp-DNA, RNA och protein MTases 30-32 vilka upphäva behovet av proteinkonstruktion i många fall. Detta exemplifieras genom fluorescens pro protein märkning med histon H3 lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 33 (Figur 3, se protokoll avsnitt 3: Två-stegs proteinmärkning via dubbla aktiverade kofaktorer).
Figur 3:. Sekvensspecifik två-steg fluorescens märkning av histon H3 med Set7 / 9, SeAdoYn och TAMRA azid Proteinet MTAse Set7 / 9 metylerar naturligt aminogruppen hos lysin 4 i histon H3 (H3K4, grön) använder AdoMet. Med dubbel aktiverade kofaktor SeAdoYn den MTAse överför en liten propargylgrupp (röd) till lysinrest. Den bifogade terminalen trippelbindning sedan selektivt modifieras i ett bioorthogonal klick reaktion (kopparkatalyse azid-alkyn cykloaddition, CuAAC) med azid-derivatiserat TAMRA (tetrametylrodamin, blå) fluoroforen.belastning / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ett steg märkning av DNA med DNA MTases och aziridin kofaktorer (ler DNA) är en robust metod men vissa aspekter bör beaktas vid planeringen av experimentet.
Aziridin kofaktör: The 6BAz koncentration för DNA-märkning med M.BseCI var 60 pM. Vid användning av andra DNA MTases cofaktorn koncentrationen bör optimeras, t.ex. om koncentrationerna så lite som 20 ^ M har använts med DNA MTAse M.TaqI 19. Låga 6BAz koncentrationer har den fördelen att en fyrfald…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
Boric acid | Gerbu | 1115 | |
Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
MOPS | Gerbu | 1081 | |
Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
TAMRA-azide | |||
TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |