Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

تقنيات التجريبية والتصوير لدراسة الهياكل الليفين الجلطة في السليمة والمصابة الولايات

doi: 10.3791/52019 Published: April 1, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم إصلاح إصابة البطانية بطانة الأوعية الدموية من خلال الاستجابة مرقئ، أو تشكيل لتجلط الدم. عندما يتخلل الدم في المصفوفة خارج الخلية، والعوامل الأنسجة تنشيط الصفائح الدموية في مجرى الدم التي تسهل الشروع في شلال التخثر. المكون الميكانيكي الرئيسي من هذه العملية هو شفاء المصفوفة الليفين، وتتألف من ألياف الفيبرين التي هي مرنة للغاية، ويمكن الحفاظ قوات كبيرة 1-4. لقد درس كثير من الباحثين بنية تشكيل وظيفة الفيبرين على نطاق واسع في العقود الماضية 5-13.

المرضى الذين يعانون من أمراض مثل داء السكري وفقر الدم المنجلي لديهم خطر متزايد لتطوير مضاعفات الجلطات مثل احتشاء عضلة القلب وأمراض نقص تروية القلب، والسكتات الدماغية 14-19. يتم تشخيص أكثر من 2 مليون شخص حديثا مع داء السكري كل عام في الولايات المتحدة. هناك نوعان من مرض السكري: النوع الأول، حيثفشل الجسم على إنتاج كميات كافية من الأنسولين، والنوع الثاني، حيث يصبح الجسم مقاوما للأنسولين. بين مرضى السكري، وأمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب ل80٪ من المراضة والوفيات المرتبطة بهذا المرض 20،21.

مرض فقر الدم المنجلي (SCD) هو اضطراب وراثي في الدم يؤثر على أكثر من 100،000 شخص في الولايات المتحدة (22). SCD هو مرض نقاط الطفرة التي تسبب خلايا الدم الحمراء لتصبح على شكل هلال، مما يجعل من الصعب على الخلايا لتمر عبر الأوعية الدموية في الدم 23. كل من هذه الحالات المرضية تزيد من فرص تطوير الظروف atherothrombotic في الجسم. واحدة من أسباب ذلك هو نتيجة لهيكل الفيبرين تغيير وظيفة في الدول المريضة 14،24-26.

في كل من السكري ومرض فقر الدم المنجلي، وهناك hypercoagulation والنشاط hypofibrinolysis أن يدفع atherothrombosis وأمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) بالمقارنة مع المرضى الأصحاء 17،27،28. ومن المعروف أن hypofibrinolysis يشجع تصلب الشرايين التقدم ويولد الأحداث الدماغية المتكررة للمرضى الذين يعانون من السابق لأوانه مرض الشريان التاجي (29). في المخطوطة الحالية، ونحن التحقيق في دور الخصائص الفيزيائية الليفين في هذا الإعداد معين. وتتكون الهياكل جلطة الفيبرين في المرضى غير المريضة من ألياف رقيقة، والمسام الكبيرة، وعموما أقل كثافة 14،24. تم العثور على زيادة المسامية وجلطات الفيبرين أقل كثافة في المرضى الأصحاء لتسهيل انحلال الفيبرين 16. في ظروف hyperthrombotic مثل مرض الخلية المنجلية ومرض السكري، وهناك زيادة في الإنتاج الفيبرينوجين، مما تسبب في تركيز الفيبرينوجين إلى زيادة من المستويات العادية من 2.5 ملغ / مل في المرضى الأصحاء 30-33. تم العثور على تجلط الليفين التي تشكلت في مرضى السكري إلى أن تكون أقل مسامية، أكثر جمودا، على المزيد من النقاط فرع، وأكثر كثافة بالمقارنة مع الأصحاء، وعدم ديا-المرضى betic 14،24،33-35. هيكل الفيبرين تغيير هو نتيجة لآليات غلكأيشن التي تحدث في البروتينات المشاركة في تشكيل الجلطة. يحدث غير إنزيمي (لا رجعة فيه) غلكأيشن عندما ربط جزيئات الجلوكوز إلى بقايا يسين على جزيء الفيبرينوجين، الذي يثبط عامل XIIIa البشري (FXIIIa) من الجلوتامين ويسين المخلفات بشكل صحيح عبر ربط 33،36،37.

وقد تمت دراسة التحليل الهيكلي للشبكات الفيبرين على نطاق واسع في الآونة الأخيرة. على وجه الخصوص، واستخدمت الباحثين المجهر الإلكتروني وإعادة الإعمار 3D شبكات الفيبرين 38، التحقيق في الكيفية التي تؤثر بها على حد سواء داخل الأوعية الدموية (البطانية) الخلايا وخارج الأوعية (الخلايا الليفية والعضلات الملساء) خلايا هيكل الفيبرين 39، اللزجة المستخدمة والتحليل الطيفي لتحليل الهياكل الفيبرين 40، و الارتباطات المتقدمة بين هيكل الفيبرين والخواص الميكانيكية باستخدام التجريبية والنهج الحاسوبية 41 في المختبر الفيبرينوجين غلكأيشن. لمحاكاة الظروف تخثر مرض الخلية المنجلية، كانت مختلطة زيادة تركيز الفيبرينوجين مع الهيماتوكريت المنجلي تم جمعها من المرضى كما فعلت سابقا من قبل لدينا مجموعة 42. وقد استخدمت هذه الأساليب لدراسة هيكل ووظائف المشاركة في تشكيل جلطة الفيبرين وانحلال الفيبرين في ظل ظروف المريضة، فضلا عن الآليات التي تحفز الأمراض القلبية الوعائية. وبناء على المعلومات الحالية حول هذه الأمراض، كانت الهياكل الفيبرين جلطة السكري أكثر كثافة مع عدد أقل منالثانية المسام أصغر. وكانت جلطات الفيبرين مع خلايا الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي (كرات الدم الحمراء) أيضا أكثر كثافة وعرضها التجميع من كرات الدم الحمراء ومجموعات الفيبرين مكتل. وهذه ظاهرة راسخة الذي تم تحديده سابقا 43. وقد افترض أيضا أن معدل انحلال الفيبرين سيكون أقل من ذلك بكثير في تجلط الليفين السكري مع وبدون تخفيض بلازمين مقارنة صحي، الفيبرين العادي. وأظهرت النتائج أن للجلطات الفيبرين السكري، ولوحظت نتائج معدل تحلل مختلفة إلى حد كبير إلا في ظل ظروف انخفاض تركيز بلازمين. هذه التقنية التجريبية من استخدام متحد البؤر المجهري تقدم مزايا هامة على طرق التصوير الأخرى لأن الخلايا والبروتينات لا تزال في دولتهم الأم، والتي تمكن من التقاط الفيديو في الوقت الحقيقي لنشاط التخثر. هذا الأسلوب من تخثر حمل صناعي هو أيضا أرخص وأكثر كفاءة من الوقت الحصول على عينات من المرضى وتصفية فردالبروتينات والانزيمات. وعلاوة على ذلك، عن طريق استخدام البروتينات والانزيمات فصل لتجميع الجلطات، وموحدة للجلطات بحيث لم يكن هناك التباين بين العينات نتيجة لبروتينات أخرى في البلازما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: بروتوكول التالية تلتزم المبادئ التوجيهية التي وضعها مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في معهد جورجيا للتكنولوجيا.

1. جمع الدم والدم الحمراء إجراء عزل خلية

  1. جمع 40-120 مل من الدم من المتبرعين في 10 مل أنابيب vacutainer heparinized. بدء PBMC (الطرفية خلية mononucleated الدم) العزلة داخل 4 ساعات من جمع. خلال هذا الوقت، والحفاظ على الدم في RT.
    ملاحظة: O / N تخزين الدم في RT أو في 4 ° C لا ينصح لأن هذا سيؤدي إلى انخفاض العائد PBMC.
  2. تمييع الدم الكامل 1: 1 في الجليد الباردة (4 ° C) PBS العقيمة.
  3. ماصة 10 مل من الجليد الباردة السكاريد ماء في علبة فارغة، معقم 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. بلطف نقل الدم الكامل المخفف على رأس السكاريد ماء.
  4. استخدام ماصة 25 مل في وضع بطيئة وماصة الدم على طول الجانب من الأنبوب ببطء شديد. تأكد من أن الدم لا مختلطة مع السكريد قبل centrifugation لأن السكاريد ماء غير سامة للخلايا وإلا فإن العائد PBMC يكون أقل.
  5. عينات الدم أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 400 x ج في 4 درجات مئوية. إذا كان متوفرا، والحد من سرعة الفرامل من أجهزة الطرد المركزي إلى نصف الحد الأقصى للأفضل الانفصال بعد الطرد المركزي.
  6. نضح قبالة جزء بلازما / الصفائح الدموية من عينة من الدم طرد. نضح بعناية قبالة طبقة السكاريد ماء مباشرة فوق طبقة RBC معبأة.
  7. جمع 8-10 مل من كرات الدم الحمراء معبأة وتمييع 1: 1 مع غير معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم المالحة.

2. متحد البؤر المجهر تقييم السكري الهياكل الجلطة (مقلد السكري الجلطات)

  1. تذويب الفيبرينوجين البشري وfluorescently المسمى المكورات الفيبرينوجين البشري عند 37 درجة مئوية.
  2. ماصة ما يلي إلى 0.5 مل تخرج أنبوب microcentrifuge.
    1. لصحية، وجلطات الفيزيولوجية الطبيعية، ومزيج الفيبرينوجين البشري مع 10٪ fluorescently المسمى الفيبرينوجين البشريالمكورات في 50 ملي تريس / 100 مم كلوريد الصوديوم عازلة بتركيز 5 ملغ / مل.
    2. لالفيبرينوجين السكري بشكل مصطنع (لمحاكاة الجلطات لمرضى السكري)، واحتضان الفيبرينوجين البشري و 10٪ fluorescently المسمى الفيبرينوجين المترافقة في محلول 5 ملم من الجلوكوز المذاب في 50 ملي تريس / 100 مم كلوريد الصوديوم لتركيز الناتجة من 6.8 ملغ / مل.
  3. تغطية أنابيب الطرد المركزي الجزئي باستخدام مادة مبهمة لتجنب التعرض للضوء. احتضان الأنابيب في 37 ° C حمام الماء لمدة 48 ساعة.
  4. جعل الغرفة على المجهر شريحة زجاجية عن طريق لصق لاصقة رقيقة في 2 الجانبين من الشرائح.
  5. بعد فترة الحضانة 48 ساعة، وإعداد الكواشف لتكوين الفيبرين التي كتبها إزالة الجليد FXIIIa والثرومبين ألفا البشري في RT.
  6. تمييع FXIIIa إلى 80 U / مل في 5 ملي CaCl 2 العازلة.
  7. تمييع الثرومبين إلى 4 U / مل في 5 ملي CaCl 2 العازلة.
    1. لجلطات العادية، وضمان أن تركيزات النهائية من الفيبرينوجين، FXIIIa، والثرومبين هي 2.5 مترز / مل، 20 U / مل، و 1 U / مل على التوالي في حجم 50 ميكرولتر.
    2. لجلطات السكري، وضمان أن تركيزات النهائية من الفيبرينوجين، FXIIIa، والثرومبين هي 3.4 ملغ / مل، 20 U / مل، و 1 U / مل على التوالي في حجم 50 ميكرولتر.
  8. ماصة على الفور 30 ​​ميكرولتر من حل الليفين في غرفة شكلتها لاصقة.
  9. وضع 22 مم × 22 مم الغطاء الزجاجي الانزلاق بسمك 0.15 مم على أعلى من 2 طبقات من مادة لاصقة. ختم الجانبين مفتوحة مع لاصق واضحة لمنع تجلط الليفين من الجفاف. تأكد من أن لاصق لا تتفاعل مع جلطة الفيبرين.
  10. السماح للجلطات الليفين إلى تتبلمر في 21-23 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل التصوير متحد البؤر.
  11. التقاط صور المجهري مبائر من الجلطات باستخدام مجهر متحد البؤر مع 40X / 1.30 النفط M27 عدسة مع 488 نانومتر الأرجون ليزر.

3. متحد البؤر المجهر تقييم الليفين الجلطات التي تحتوي على كرات الدم الحمراء المنجلية المرضى من خلية

  1. تذويب الفيبرينوجين البشري وfluorescently المسمى المكورات الفيبرينوجين البشري عند 37 درجة مئوية.
  2. ماصة ما يلي إلى 0.5 مل تخرج أنبوب microcentrifuge.
    1. لصحية، طبيعية جلطة الفيبرين، مزيج الفيبرينوجين البشري مع 10٪ fluorescently المسمى المكورات الفيزيولوجية البشرية في 50 ملي تريس / 100 مم كلوريد الصوديوم عازلة بتركيز 5 ملغ / مل.
    2. لجلطات تحتوي على SCD كرات الدم الحمراء، ومزيج الفيبرينوجين البشري و 10٪ fluorescently المسمى المكورات الفيزيولوجية البشرية في 50 ملي تريس / 100 مم كلوريد الصوديوم مثل أن تركيز الناتجة من الفيبرينوجين هو 10 ملغ / مل.
  3. تسمية كرات الدم الحمراء المعزولة (سواء العادية وتلك من مرضى فقر الدم المنجلي تم الحصول عليها من بروتوكول العزلة RBC) باستخدام حل الخلية وضع العلامات.
    1. تعليق الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 في مل في أي اختيار المصل خالية مستنبت.
    2. إضافة 5 ميكرولتر / مل من تعليق الخلية إلى حل الخلية وضع العلامات. تخلط جيدا من قبل pipetting لطيف بلطف.
    3. الطرد المركزي أنابيب تعليق صفت في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    4. إزالة طاف وبلطف اعادة تعليق الخلايا في 37 ° C المتوسطة.
    5. كرر الإجراء غسل (3.3.4 و3.3.5) مرتين أخريين.
  4. تمييع FXIIIa إلى 80 U / مل في 5 ملي CaCl 2 العازلة.
  5. تمييع الثرومبين إلى 4 U / مل في 5 ملي CaCl 2 العازلة.
    1. لجلطات العادية، وضمان أن تركيزات النهائية من الفيبرينوجين، FXIIIa، والثرومبين هي 2.5 ملغ / مل، 20 U / مل، و 1 U / مل على التوالي في حجم 50 ميكرولتر.
    2. لجلطات تحتوي على SCD كرات الدم الحمراء، وضمان أن تركيزات النهائية من الفيبرينوجين، FXIIIa، والثرومبين هي 5 ملغ / مل، 20 U / مل، و 1 U / مل على التوالي في حجم 50 ميكرولتر.
  6. ماصة 10 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء وصفت في حل الفيبرين. ماصة 30 ميكرولتر من الفيبرين مع كرات الدم الحمراء على الزجاج المجهر (يرجى الرجوع إلى الشريحة استعدادا لGLجلطات ycated).
  7. السماح للالليفين إلى تتبلمر في 21-23 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل التصوير متحد البؤر.
  8. التقاط صور مبائر من الجلطات باستخدام المجهر متحد البؤر، واستخدام أشعة الليزر الإثارة مع موجات من 488 نانومتر و 633 نانومتر لإثارة الفيبرين fluorescently المسمى وكرات الدم الحمراء.

4. متحد البؤر المجهر تقييم انحلال الفبرين الأسعار السكري الهياكل الجلطة

  1. كرر بروتوكول المجهري متحد البؤر جلطات السكري (بروتوكول الخطوة 2) لتقييم معدل انحلال الفيبرين في جلطات السكري.
  2. لا ختم ينتهي من غرفة بمادة لاصقة واضح. السماح للجلطات الليفين إلى تتبلمر لمدة 1.5 ساعة عند 21-23 ° C في الضميمة مغلقة تحتوي على 250 مل من الماء لمنع الجفاف.
  3. بعد البلمرة، الحصول على صور من الجلطات باستخدام المجهر متحد البؤر.
  4. ماصة بلازمين في نهاية مفتوحة من الغرفة وتفريق بلازمين من خلال الجلطة عن طريق عمل شعري.
    1. إلىالتجارب انحلال الفيبرين العادية والسكري مع تركيزات العادية، ماصة 25 ميكرولتر في 200 ميكروغرام / مل من بلازمين في افتتاح القاعة.
    2. لجلطات السكري مع انخفاض تركيزات، ماصة 25 ميكرولتر في 50 ميكروغرام / مل في افتتاح القاعة.
  5. استخدام ميزة السلاسل الزمنية (انظر الشكل 1) في البرنامج المجهر متحد البؤر لالتقاط الوقت الحقيقي لقطات فيديو للبلازمين الناشر الجلطة.
    1. انقر فوق وضع اقتناء وثم حدد "السلاسل الزمنية". حدد عدد من الدورات والفاصل الزمني التسجيل.

5. حساب انحلال الفبرين أسعار

  1. تحديد معدل تحلل عن طريق تحديد مساحة (2،500 ميكرون 2) وحساب الوقت المنقضي اللازمة لإذابة منطقة محددة من الجلطة. حساب معدل تحلل باستخدام المعادلة التالية (الشكل 2):
    المعادلة 1

6. التحليل الإحصائي للانحلال الفبرين أسعار

  1. تحليل البيانات تحلل باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. إجراء ANOVA في اتجاه واحد وآخر خاص توكي-كرامر اختبار 44،45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

متحد البؤر تحليل المجهر من السكري الليفين الهياكل الجلطة

وتعرض الصور المجهري مبائر جلطات العادية والسكري في الشكل (3). ويكشف تحليل متحد البؤر المجهري للجلطات العادية والسكري أن جلطات السكري هي أكثر كثافة مع المسام أصغر من جلطات طبيعية مع وبدون إضافة FXIIIa خلال البلمرة الجلطة على حد سواء. في الشكل 3A و 3B، هناك تركيز أقل الليفين الذي خلق بنية أقل كثافة من جلطات السكري مع ارتفاع تركيز الفيبرين (أرقام 3C و 3D).

كثافة أكبر احظ (عدد الألياف في وحدة المساحة) في جلطات السكري هو نتيجة لزيادة تركيز الفيبرينوجين الذي يحدث في الأشخاص الذين يعانون من مرض السكري. في جلطات العادية، كانت ألياف الفيبرين أكثر الخطية وشكلت الألياف الأطول على البلمرة مع FXIIIa، التيمن المحتمل أن يكون نتيجة لFXIIIa تشكيل الروابط المتبادلة بين الألياف. في حالة جلطات السكري، ظهرت الألياف إلى أن تكون أقصر، حتى مع إضافة FXIIIa. هذا هو على الأرجح نتيجة لعملية البلمرة التي تم تغيير بسبب وجود مناطق السكري على جزيء الفيبرينوجين. وبالإضافة إلى ذلك، من تحليل الشكل (3)، فمن المرجح هو أن سمك الألياف انخفض أيضا نتيجة لغلكأيشن، وهو ما يرجح السبب في مضان من الألياف السكري تظهر أن يكون أقل كثافة.

متحد البؤر تحليل المجهر الليفين الجلطات التي تحتوي على كرات الدم الحمراء المنجلية المرضى من خلية

وتعرض الصور المجهر مبائر للهيكل جلطة الفيبرين من الجلطات مع طبيعتها وكرات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي في الشكل (4). وكما كان متوقعا، وكانت الصور مبائر من جلطات الفيبرين التي تحتوي على كرات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي هياكل أكثر كثافة من تلك التي صحية الفيبرين جالكثير. ويبين الشكل 4A توزيع متجانس من الفيبرين وكرات الدم الحمراء العادية. ومع ذلك، في الشكل 4B هناك كتل من الفيبرين والفراغات حيث شكلت جود شبكة الفيبرين. لم تفرق متجانس من كرات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي، ولكن كانت جزءا لا يتجزأ بالأحرى في كتل الفيبرين. وكانت الكثافة زيادة (عدد الألياف في وحدة المساحة) نتيجة لزيادة تركيز الفيبرينوجين الذي يحدث نتيجة لhypercoagulation في المرضى الذين SCD. وعلاوة على ذلك، فإن الميل الطبيعي للكرات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي لتشكيل المجاميع لدت كتل من كرات الدم الحمراء التي أصبحت متشابكة في شبكة الفيبرين. وأدى ذلك إلى تشكيل الهياكل تجلط الشاذة التي تختلف بشكل ملحوظ في التشكل من تلك الموجودة في مرضى العادي. من الشكل 4B، لوحظ أن كرات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي تسبب المزيد من عدم التجانس في العينة الفيبرين وتسببت أيضا التوزيع المكاني أوسع من كرات الدم الحمراء في عينة الليفين، عندما كومقلص إلى جلطات الفيبرين صحية مع كرات الدم الحمراء العادية. في المقابل، فإن جلطات الفيبرين صحية مع كرات الدم الحمراء العادية المعروضة تشتت أكثر تجانسا من الخلايا في جميع أنحاء شبكة الفيبرين.

ومن غير المعروف كيف تم بلمرة الكثير من مسح ميزانية الأسرة (المنجل الهيموجلوبين) في كريات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي ويرد في العينات. ما هو معروف، ومع ذلك، هو أن وجود أي مبلغ من HBS يسبب المزيد من تجميع الخلايا في عدد من جزيئات HBS لكل وحدة حجم الجزيئات مقابل HBA العادية. وقد أثبتت عموم وآخرون. 46 هذه الظاهرة في دراسة حيث مقارنة آثار التجميع / تجميع ديوكسي-HBS، وعلى سبيل المقارنة، من أوكسي HBS وأوكسي العادي الهيموجلوبين الكبار، HBA. ظلت مجموعات شكلت في غضون ثوان قليلة بعد إعداد الحل وأحجامها وأرقام ثابتة نسبيا لمدة تصل إلى 3 ساعات. كان واحدا من الاستنتاجات من الدراسة أن كلا أوكسي HBS وديوكسي-HBS الجزيئات تتجمع في عدد دن العاليSITY من أوكسي HBA (العادية) جزيئات بوصفها وظيفة من درجة الحرارة. تتعلق الدراسة الحالية، وهذا يعني أن كرات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي من المرجح أن المجموعة معا، والمحاصرين الليفين كما كان يجري بلمرة من مقدمة الفيبرينوجين.

متحد البؤر المجهري تحلل تحليل أسعار عادي والسكري الجلطات

تم الافتراض بأن معدلات انحلال الفيبرين سيكون أكبر للجلطات الفيبرين العادية مقارنة جلطات الفيبرين السكري مع انخفاض تركيز بلازمين. لاختبار هذه الفرضية، تم استخدام المجهر متحد البؤر لتقييم معدلات تحلل الجلطات الفيبرين مع إضافة بلازمين. وكان معدل تحلل الفيبرين من الطبيعي مع إضافة 200 ميكروغرام / مل من بلازمين المتوسط ​​(متوسط) 43.2 ± 26.5 ميكرون كانت 2 / ثانية ومتوسط ​​(متوسط) معدلات تحلل الفيبرين من السكري مع إضافة 200 ميكروغرام / مل من بلازمين 29.7 ± 11.2 ميكرون 2 / ثانية. لجلطة الفيبرين السكري هي lysed مع50 ميكروغرام / مل من بلازمين، كان متوسط ​​معدل تحلل 12.8 ± 3.1 ميكرون 2 / حد ذاتها. وقد تم استخدام ما مجموعه 10 عينات كل (30 عينة) لتحديد القيم الانحراف المتوسط ​​والقياسية. يتم عرض هذه القيم في الشكل (5). واستخدم ف قيمة 0.05 لتحديد أهمية بين المجموعات التجريبية مستقلة. أظهر تحليل لمعدلات انحلال الفيبرين أن قيمة للجلطات العادية مقارنة مع السكري (محاكاة السكري) جلطات مع انخفاض بلازمين كانت مختلفة إلى حد كبير.

الشكل (1)
الرقم قطة شاشة 1. عينة من البرمجيات المجهر متحد البؤر بالتفصيل طريقة للحصول على الوقت الحقيقي، والتصوير المستمر لجلطة الفيبرين تحلل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من ثيالصورة الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. مثال صورة مبائر مع منطقة محددة تستخدم لحساب معدل تحلل العينة الفيبرين تجلط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3). الصور متحد البؤر من (السكري) جلطات الفيبرين صحية والسكري. ويمثل مضان الأخضر شبكة الفيبرين. الليفين unglycated يمثل الجلطات التي شكلت في المرضى الأصحاء، في حين الليفين السكري يمثل الجلطات التي شكلت في مرضى السكري. (A) الفيبرين Unglycated بدون إضافة FXIIIa. (B) الفيبرين Unglycated مع FXIIIa. (C (D) الفيبرين السكري مع FXIIIa. يشير شريط أحمر على نطاق و50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. الصور متحد البؤر جلطات الفيبرين صحية مع كرات الدم الحمراء العادية وجلطات الفيبرين مع كرات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي. يمثل مضان الأخضر شبكة الليفين والبنفسجي يمثل المسمى صحية وكرات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي. (A) كرات الدم الحمراء الصحية في تركيز الفيبرين العادي مع FXIIIa و (ب) زيادة الفيبرين مع FXIIIa وكرات الدم الحمراء من مريض فقر الدم المنجلي. يشير شريط نطاق والأبيض 50 ميكرون. دوائر بيضاء في الصورة (B) تشير إلى كرات الدم الحمراء المنجلية بجدران المعروفة.

الرقم 5
تم تحديد الشكل 5. معدلات انحلال الفبرين جلطات الفيبرين العادية مقارنة السكري جلطات (السكري) الفيبرين وجلطات السكري مع انخفاض تركيز بلازمين. أهمية الإحصائية على أساس في اتجاه واحد ANOVA واللاحق توكي-كرامر التجارب المقارنة متعددة. وأظهر تحليل ANOVA أن هناك فرق كبير بين الوسائل معدل تحلل. أظهر اختبار توكي-كرامر أن هناك اختلاف كبير في وسائل بين جلطات العادية وجلطات مع انخفاض بلازمين مع ا ف ب <0.05. و* يشير إلى وجود فرق كبير من جلطات العادية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

للحصول على بيانات ذات مغزى حول بنية آليات التخثر في الحالات المرضية، من المهم لعزل العوامل التي تدخل في تخثر لتحديد الآثار المترتبة على البروتينات والخلايا في هذه الظروف. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأغراض التحقيق في هيكل جلطة الفيبرين في الدول السكري وSCD في المختبر.

فمن الضروري لفهم الآليات التي تشارك في تكوين الفيبرين وانحلال الفيبرين في الحالات المرضية منذ الظروف المتغيرة تسبب hypercoagulation، atherothrombosis، والأمراض القلبية الوعائية. من الصور مبائر الحصول عليها في هذه التجربة، فمن الواضح أن النشاط hypercoagulation يحدث في الدول السكري وSCD، والذي يسبب زيادة تركيز الفيبرينوجين. وزيادة تركيز الفيبرينوجين النتائج في شبكة الليفين أكثر كثافة مع المزيد من النقاط فرع والمسام الصغيرة في جميع أنحاء الشبكة. في شبكات الفيبرين من المرضى SCD، وليس هناك سوى المزيد من الفيبرين الحاضر، بور طبيعة تجميع من الكريات الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي أيضا إلى تغيير بنية الشبكة حيث يحاصر الليفين في مجموعات. والتكتل من كرات الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي أيضا يقلل من مسامية مجموعات الليفين في الشبكة، ولكن يبدو أن زيادة تركيز باطلا في الشبكة العامة. نتائج تحليل انحلال الفيبرين من الجلطات السكري دعمت فرضية معدل تحلل في جلطات السكري كانت أقل مع انخفاض بلازمين من ذلك من صحية، وجلطات العادية. ومع ذلك، فإن النتائج لا توفر أدلة قاطعة حول معدلات تحلل الجلطات السكري مع تركيزات عادية من بلازمين. وبالتالي فإنه يمكن استنتاج أن لمرضى السكري مع التركيز بلازمين الطبيعي، قد يكون هناك نشاط انحلال الفيبرين كاف للحط من جلطات الفيبرين بطريقة فعالة.

لتجارب أجريت في هذه الدراسة البحثية، واستخدمت البروتينات المعزولة وكرات الدم الحمراء، بدلا من الدم الكامل والبلازما. باستخدامالبروتينات فصل لتجميع جلطات الليفين، ويمكن تحديد الأسباب لهياكل المتغيرة بين وضعها الطبيعي مقابل جلطات المريضة. هذا انخفاض كبير في إمكانية وجود بروتينات البلازما أخرى تتداخل مع هيكل والتشكل من جلطات الفيبرين. ومع ذلك، باستخدام بروتينات معزولة، من الأهمية بمكان لتخزين ومعالجة الخلايا والبروتينات بشكل صحيح، كما أنهم أكثر عرضة للموت الخلايا وتدهور البروتين.

كان من المقرر أن القدرة على الحصول على الصور من الهياكل الفيبرين تجلط مع الحفاظ على خصائص الجلطات الطبيعية من الخلايا والبروتينات ومبائر تقنية التصوير المجهري الذي تم اختياره لهذه الدراسة. وقد تبين أيضا المجهري متحد البؤر لإعطاء تحسين التباين ودقة بصرية للعينة مع انخفاض الضوضاء بالمقارنة مع ضوء microcopy التقليدي. يتم توجيه ضوء الليزر إلى الثقب الذي يمنع ضوء غير مركزة من الدخول. استخدام المجهر متحد البؤر أدى إلى تجنب الحاجة لإضافة مواد كيميائية تثبيتي. وبالتالي فإن الخلايا والبروتينات قادرة على الحفاظ على نشاطهم بروتين طبيعي تشكيل جلطات الفيبرين. ونتيجة لذلك تعمل بها الخلايا، والبروتينات، والإنزيمات في دولتهم الأم، مما يتيح استخدام المجهر متحد البؤر لالتقاط الصور والفيديو من النشاط في الوقت الحقيقي. مع المجهر متحد البؤر، تم القبض على الصور 3D من جلطات الفيبرين وتم الحصول على أشرطة الفيديو من بلازمين الهضم جلطات الليفين في الوقت الحقيقي. عند إضافة بلازمين للتجلط لالتقاط الفيديو سلسلة زمنية من عملية تحلل الجلطة، كان من المهم استخدام العمل الشعري عبر بلازمين لتفريق متجانس الإنزيم من خلال مصفوفة الفيبرين. وقد تم ذلك لضمان أن تركيز بلازمين أضاف أنه دقيق وسمح الإنزيم إلى ليز الجلطة بأكملها، على النقيض من المنطقة المحلية أن بلازمين أضيف.

كانت الطريقة والنتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة مشابهة لدراسة قامت بها دن وآخرون، الذين وجدوا أن تحلل الجلطةوكانت معدلات أقل من ذلك بكثير في مواضيع السكري من الضابطة 25. في كلتا الدراستين، كانت هناك اختلافات كبيرة في معدلات تحلل من السكري (السكري) جلطات. ومع ذلك، فإن البروتوكول الحالي قد تمثل بدقة الدول السكري بسبب المستويات بلازمين مخفضة. بالإضافة إلى ذلك، في هذه الدراسة البحثية انحلال الفيبرين اعتقل بشكل مستمر في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر متحد البؤر، على النقيض من تحليل أقسام منفصلة على فترات زمنية مختلفة. Wooton وآخرون. 47 وقد حققت الفيبرين تجلط تحلل ويعمل على سرعة تحلل الجبهة (سم / ث) للتحقيق في معدل تحلل للجلطات. واستخدم الباحثون تحليل الصور متحد البؤر في دراستهم لتحديد السرعة الأمامية. في الدراسة الحالية، بدلا من سرعة تحلل الجبهة، وكان يستخدم منطقة تحلل سرعة (بسبب الطريقة التي تم تحليل الصورة على مبائر). لمزيد من التحقق من صحة طريقة تم تطويرها في دراستنا، ووصف الكتاب في 48 نموذج رياضي ل الفيبرين تجلط تحلل بواسطة بلازمين، التي تنص على سرعة تحلل الجبهة بوصفها وظيفة من ثابت معدل الفعال للانحلال الفيبرين. وبالنظر إلى المعادلة على النحو التالي:
المعادلة 2

هنا، المعادلة 3 يمثل ثابت معدل الفعال للانحلال الفيبرين، K a غير ثابت الامتزاز، C مساء هو تركيز بلازمين، وρ الجبهة الوطنية هو كثافة الفيبرين. إذا كانت كمية تقاس المعادلة 4 (تقاس من التحليل متحد البؤر في الدراسة الحالية) ويستخدم ويعمل فيها قاعدة السلسلة، وهذا يؤدي إلى:
المعادلة 5

ر "> وعلى افتراض البعد واحد فقط هو تغيير لكل وحدة يؤدي مع الوقت إلى:

المعادلة 6

المعادلة 7

وهكذا ثابت معدل الفعال للانحلال الفيبرين للتجربة يؤدي إلى:
المعادلة 8

هذه العلاقة تستدل على أن ثابت معدل الفعال للانحلال الفيبرين ( المعادلة 9 ) هي وظيفة من تركيز بلازمين (C مساء)، و سعر تحلل المنطقة المعادلة 10 .

هذا الأسلوب هو أيضا مهم لدراسة تخثر فيالمرضى SCD، لأن هناك لا يعرف الا القليل عن الفيبرين وآليات التخثر فيما يتعلق بهذا المرض. كان هناك عدد قليل جدا من الدراسات التي أجريت على آثار SCD على هيكل جلطات الفيبرين. وبالتالي فإن الصور مبائر جمعها من هذه الدراسة توفر التصور نادر من هيكل تجلط كرات الدم الحمراء المنجلية بجدران مع يدمج.

لمقارنة الاختلافات في وسائل بين المجموعات، استخدم ANOVA في اتجاه واحد وآخر خاص توكي-كرامر الاختبار. A-اتجاه واحد ANOVA هو اختبار إحصائي يستخدم لتحديد فروق ذات دلالة إحصائية في وسائل بين جماعات مستقلة. يتم استخدام ما بعد اختبار توكي-كرامر لمقارنة الوسائل من كل مجموعة مستقلة وتحديد وسائل الجماعات تختلف إحصائيا عن بعضها البعض. قبل إجراء في اتجاه واحد ANOVA، وهناك ستة الافتراضات التي يجب الوفاء بها لضمان أن تكون النتائج صحيحة. الافتراضات ستة هي: يعتمد متغير (معدل تحلل) المستمر، وهي فاريا مستقلةبليه تتكون من اثنين أو أكثر من مجموعات مستقلة الفئوية (عادي، السكري، والسكري مع انخفاض بلازمين)، وبشكل مستقل لاحظ البيانات في كل مجموعة بحيث حدث واحد يحدث لا يؤثر حدث آخر (وهذا يؤكد أنه لا يوجد تداخل في البيانات.) ، مجموعة البيانات التي لا تحتوي على أي القيم المتطرفة كبيرة، توزع عادة بيانات التحقق من قبل الاختبار الإحصائي شابيرو-ويلك، وتجانس الفروق في بيانات التحقق من قبل الاختبار الإحصائي ليفين. مرة واحدة تم استيفاء هذه الافتراضات، أجريت على ANOVA في اتجاه واحد وآخر خاص توكي-كرامر اختبار مع القيمة p من 0.05 كما عتبة لتحديد الدلالة الإحصائية. للتفصيل دقيق لفي اتجاه واحد ANOVA وخاصة في مرحلة ما بعد توكي-كرامر الاختبار، والرجوع إلى 44،45.

وعموما، هذا الأسلوب يسمح للتصوير جلطات الفيبرين العادية وغير العادية (بسبب الدول المريضة) في ولاياتهم الأصلية. يوفر طريقة أيضا تفاصيل عن الوقت الحقيقي التصوير من جلطة تحلل فضلاكما التحليل الإحصائي لمعدلات تحلل. السهولة التي يمكن أن تنتج من الجلطة وتصويرها في المختبر هي مفيدة لمجموعة واسعة من التطبيقات في الهندسة الخلوية والأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2, (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13, (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45 (1998).
تقنيات التجريبية والتصوير لدراسة الهياكل الليفين الجلطة في السليمة والمصابة الولايات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. O., Averett, R. D. Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States. J. Vis. Exp. (98), e52019, doi:10.3791/52019 (2015).More

Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. O., Averett, R. D. Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States. J. Vis. Exp. (98), e52019, doi:10.3791/52019 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter