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Tecniche sperimentali e di imaging per l'esame Strutture coagulo di fibrina in normali e patologiche Uniti

Published: April 1, 2015 doi: 10.3791/52019
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 2,3
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

Introduction

Lesioni a rivestimento endoteliale di un vaso sanguigno viene riparato attraverso la risposta emostatico, o la formazione di un coagulo di sangue. Quando il sangue permea nella matrice extracellulare, fattori tissutali attivano piastrine nel sangue che facilitano l'iniziazione della cascata coagulativa. Il componente chiave meccanica di questo processo di guarigione è la matrice di fibrina, composto da fibre di fibrina che sono altamente elastica, e può sostenere le grandi forze 1-4. Molti ricercatori hanno studiato la struttura di formazione, e la funzione di fibrina ampiamente negli ultimi decenni 5-13.

I pazienti con malattie come il diabete mellito e falciforme hanno un aumentato rischio di sviluppare complicanze trombotiche, come infarto miocardico, cardiopatia ischemica, e colpi 14-19. Oltre 2 milioni di persone sono di nuova diagnosi di diabete mellito ogni anno negli Stati Uniti. Esistono due tipi di diabete: tipo I, dove lacorpo non riesce a produrre quantità sufficienti di insulina, e tipo II, dove il corpo diventa resistente all'insulina. Tra i pazienti diabetici, malattie cardiovascolari (CVD) è la causa per l'80% della morbilità e la mortalità associate con la malattia 20,21.

Anemia falciforme (SCD) è una malattia genetica del sangue che colpisce più di 100.000 persone negli Stati Uniti 22. SCD è una malattia mutazioni puntiformi che induce le cellule rosse del sangue per diventare a forma di mezzaluna, il che rende difficile per le cellule di passare attraverso il sistema vascolare del sangue 23. Entrambi questi stati di malattia aumentano le probabilità di sviluppare condizioni aterotrombotici nel corpo. Uno dei motivi per questo è il risultato di strutture di fibrina alterata e funzione negli stati malati 14,24-26.

In entrambi diabete e anemia falciforme, c'è ipercoagulazione e l'attività hypofibrinolysis che induce aterotrombosi e malattie cardiovascolari (CVD) rispetto ai pazienti sani 17,27,28. E 'noto che hypofibrinolysis promuove la progressione dell'aterosclerosi e genera eventi ischemici ricorrenti per i pazienti con malattia coronarica precoce 29. Nel manoscritto attuale, abbiamo studiato il ruolo di fibrina proprietà fisiche in questo ambiente particolare. Strutture coagulo di fibrina nei pazienti non malati sono composti da fibre sottili, pori più grandi, e in genere meno densa 14,24. La maggiore porosità e coaguli di fibrina meno fitta in pazienti sani sono stati trovati per facilitare fibrinolisi 16. In condizioni hyperthrombotic quali malattia a cellule falciformi diabetica e, vi è un aumento della produzione di fibrinogeno, causando la concentrazione di fibrinogeno aumentare da livelli normali di 2,5 mg / ml in pazienti sani 30-33. Coaguli di fibrina formata in pazienti diabetici sono stati trovati per essere meno porosa, più rigida, avere più punti di ramificazione, e più densa rispetto a sano, non diapazienti Betica 14,24,33-35. La struttura di fibrina alterata è il risultato di meccanismi di glicazione che si verificano nelle proteine ​​coinvolte nella formazione del coagulo. Non enzimatica (irreversibile) glicazione si verifica quando le molecole di glucosio si legano a residui di lisina sulla molecola fibrinogeno, che inibisce il fattore XIIIa umana (FXIIIa) da glutamina e lisina residui opportunamente incrociati collegano 33,36,37.

L'analisi strutturale delle reti di fibrina è stato ampiamente studiato di recente. In particolare, i ricercatori hanno utilizzato la microscopia elettronica e la ricostruzione 3D delle reti di fibrina, 38 indagati come sia intravascolari (endoteliali) cellule e extravascolari (fibroblasti e muscolari lisce) cellule influenzano la struttura di fibrina 39, viscoelastico utilizzati e l'analisi spettrale per analizzare le strutture di fibrina 40, e correlazioni sviluppati tra struttura di fibrina e le proprietà meccaniche utilizzando approcci sperimentali e computazionali 41 in vitro fibrinogeno glicazione. Per simulare malattie cella condizioni coagulazione falce, un aumento delle concentrazioni di fibrinogeno sono stati mescolati con ematocrito falciforme raccolti da pazienti, come fatto in precedenza dal nostro gruppo 42. Questi metodi sono stati usati per esaminare la struttura e le funzioni coinvolte nella formazione di coaguli di fibrina fibrinolisi e in condizioni malate, nonché i meccanismi che inducono CVD. Sulla base delle informazioni attuali su queste malattie, le strutture di coagulo di fibrina glicata erano più denso con meno di unnd piccoli pori. I coaguli di fibrina con globuli rossi di pazienti con anemia falciforme (RBC) erano anche più denso e visualizzati aggregazione dei globuli rossi e di cluster di fibrina agglomerati. Questo è un fenomeno ben noto che è stato determinato in precedenza 43. E 'stato anche ipotizzato che il tasso di fibrinolisi sarebbe significativamente più bassa nel coaguli di fibrina glicata con e senza riduzione plasmina rispetto ai sani, di fibrina normale. I risultati hanno mostrato che per coaguli di fibrina glicate, risultati molto diversi tassi lisi stati osservati solo in condizioni di concentrazione di plasmina ridotta. Questa tecnica sperimentale mediante microscopia confocale offre vantaggi significativi rispetto ad altri metodi di imaging perché le cellule e proteine ​​rimangono nel loro stato nativo, che permette la cattura di video in tempo reale dell'attività coagulazione. Questo metodo di coagulazione sinteticamente Induzione è anche più economico e più tempo efficiente di ottenere campioni di pazienti e filtrando individualeproteine ​​ed enzimi. Inoltre, utilizzando proteine ​​ed enzimi separati per sintetizzare coaguli, i coaguli sono stati standardizzati in modo che non ci fosse la variabilità tra i campioni a causa di altre proteine ​​del plasma.

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Protocol

NOTA: Il seguente protocollo aderisce alle linee guida stabilite dal Institutional Review Board (IRB) presso la Georgia Tech.

1. Raccolta di sangue e Blood Red isolamento delle cellule Procedura

  1. Raccogliere 40-120 ml di sangue da donatori in 10 ml vacutainer eparina. Inizia PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) isolamento entro 4 ore di raccolta. Durante questo tempo, mantenere il sangue a RT.
    NOTA: O / N stoccaggio di sangue in RT o 4 ° C non è raccomandato in quanto questo si tradurrà in minori rendimenti PBMC.
  2. Diluire sangue intero 1: 1 in ghiaccio freddo (4 ° C) PBS sterile.
  3. Pipettare 10 ml di ghiacciata polisaccaride idrofila in un sterile 50 ml tubetto vuoto, conico. Trasferire delicatamente sangue intero diluito in cima al polisaccaride idrofila.
  4. Utilizzare una pipetta 25 ml in presa lenta e sangue pipetta lungo il lato del tubo molto lentamente. Assicurarsi che il sangue non viene miscelato con il saccaride prima Centrifugation perché il polisaccaride idrofila è tossico per le cellule e non, la resa PBMC sarà inferiore.
  5. Centrifugare i campioni di sangue per 30 min a 400 xg a 4 ° C. Se disponibile, ridurre la velocità del freno della centrifuga alla metà del massimo per una migliore separazione dopo centrifugazione.
  6. Aspirare off la frazione di plasma / piastrine del campione di sangue centrifugato. Aspirare accuratamente lo strato polisaccaride idrofila direttamente sopra il livello RBC imballato.
  7. Raccogliere 8-10 ml di eritrociti concentrati e diluire 1: 1 con il non sterile 0,9% NaCl soluzione salina.

2. Microscopia confocale Valutazione di glicata Strutture Clot (simulati Diabetici Clots)

  1. Scongelare fibrinogeno umano e fluorescente coniugato fibrinogeno umano a 37 ° C.
  2. Pipettare il seguente in un 0,5 ml graduato provetta.
    1. Per i sani, normali coaguli fibrinogeno, mescolare fibrinogeno umano con il 10% fluorescente fibrinogeno umanoconiugato in tampone 50 mM Tris / 100 mM NaCl ad una concentrazione di 5 mg / ml.
    2. Per fibrinogeno artificialmente glicata (per simulare coaguli diabetici), incubare fibrinogeno umano e il 10% fluorescente fibrinogeno coniugato in una soluzione 5 mM di glucosio sciolto in 50 mM Tris / NaCl 100 mM per una concentrazione risultante di 6,8 mg / ml.
  3. Coprire le provette micro-centrifuga con un materiale opaco per evitare l'esposizione alla luce. Incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 ° per 48 ore.
  4. Fare una camera su un vetrino da microscopio in vetro apponendo un adesivo sottile su 2 lati della diapositiva.
  5. Dopo il periodo di incubazione 48 ore, preparare i reagenti per la formazione di fibrina da sbrinamento FXIIIa e trombina alfa umano RT.
  6. Diluire FXIIIa a 80 U / ml in 5 CaCl mM tampone 2.
  7. Diluire trombina a 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 tampone.
    1. Per coaguli normali, assicurarsi che le concentrazioni finali di fibrinogeno, FXIIIa, e trombina sono 2,5 mg / ml, 20 U / ml e 1 U / ml, rispettivamente, in un volume di 50 microlitri.
    2. Per i coaguli glicata, accertarsi che le concentrazioni finali di fibrinogeno, FXIIIa, e trombina sono 3,4 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, rispettivamente, ad un volume di 50 ml.
  8. Subito pipettare 30 microlitri della soluzione di fibrina nella camera formata dal collante.
  9. Inserire un x 22 mm vetrino di vetro 22 mm con spessore di 0,15 mm su cima alle 2 strati di adesivo. Sigillare i lati aperti con adesivo trasparente per evitare che il coagulo di fibrina si secchi. Assicurarsi che l'adesivo non interagisce con il coagulo di fibrina.
  10. Lasciare i coaguli di fibrina polimerizzare a 21-23 ° C per 2 ore prima di imaging confocale.
  11. Prendere immagini di microscopia confocale dei coaguli utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 40X / 1.30 Olio M27 con 488 nm Argon laser.

3. Microscopia confocale Valutazione della fibrina Clots contenenti globuli rossi di pazienti Sickle Cellulari

  1. Scongelare fibrinogeno umano e fluorescente coniugato fibrinogeno umano a 37 ° C.
  2. Pipettare il seguente in un 0,5 ml graduato provetta.
    1. Per il sano, normale coagulo di fibrina, fibrinogeno umano miscelare con il 10% fluorescente coniugato fibrinogeno umano in tampone 50 mM Tris / 100 mM NaCl ad una concentrazione di 5 mg / ml.
    2. Per i coaguli contenenti SCD eritrociti, mescolare fibrinogeno umano e il 10% fluorescente coniugato fibrinogeno umano in 50 mM Tris / NaCl 100 mM tale che la concentrazione risultante del fibrinogeno è di 10 mg / ml.
  3. Etichettare i globuli rossi isolati (sia normali e quelli di pazienti con anemia falciforme ottenuti dal protocollo di isolamento RBC) utilizzando una soluzione di cellule di etichettatura.
    1. Sospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 6 per ml in qualsiasi mezzo di coltura privo di siero prescelto.
    2. Aggiungere 5 microlitri / ml di sospensione cellulare alla soluzione cellulare etichettatura. Mescolare bene delicatamente pipettando delicatamente.
    3. Centrifugare le provette etichettate sospensione a 1500 rpm per 5 min a 37 ° C.
    4. Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere le cellule in 37 ° C di media.
    5. Ripetere la procedura di lavaggio (3.3.4 e 3.3.5) altre due volte.
  4. Diluire FXIIIa a 80 U / ml in 5 CaCl mM tampone 2.
  5. Diluire trombina a 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 tampone.
    1. Per coaguli normali, assicurarsi che le concentrazioni finali di fibrinogeno, FXIIIa, e trombina sono 2,5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, rispettivamente, ad un volume di 50 ml.
    2. Per i coaguli contenenti SCD globuli rossi, accertarsi che le concentrazioni finali di fibrinogeno, FXIIIa, e trombina sono 5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, rispettivamente, ad un volume di 50 ml.
  6. Pipettare 10 ml di globuli rossi etichettati nella soluzione di fibrina. Pipettare 30 ml di fibrina con globuli rossi sul vetro del microscopio (vedere scorrere la preparazione per glcoaguli ycated).
  7. Lasciare fibrina polimerizzare a 21-23 ° C per 2 ore prima di imaging confocale.
  8. Prendere immagini confocale dei coaguli utilizzando il microscopio confocale, e utilizzare laser con lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e 633 nm per eccitare fibrina fluorescente e globuli rossi.

4. Microscopia confocale Valutazione della fibrinolisi tariffe in glicata Strutture Clot

  1. Ripetere il protocollo di microscopia confocale di coaguli glicata (Protocollo Fase 2) per la valutazione del tasso di fibrinolisi in grumi glicata.
  2. Non sigillare le estremità della camera con adesivo trasparente. Lasciare i coaguli di fibrina a polimerizzare per 1,5 ore a 21-23 ° C in un contenitore sigillato contenente 250 ml di acqua per evitare la disidratazione.
  3. Dopo la polimerizzazione, ottenere immagini dei coaguli utilizzando il microscopio confocale.
  4. Pipettare plasmina nell'estremità aperta della camera e disperdere la plasmina attraverso il coagulo tramite azione capillare.
    1. Pernormali e glicata esperimenti fibrinolisi con concentrazioni normali, pipette 25 ml a 200 mg / ml di plasmin nella apertura della camera.
    2. Per i coaguli glicata con concentrazioni ridotte, pipetta 25 microlitri a 50 ug / ml nella apertura della camera.
  5. Utilizzare la funzione serie temporale (vedi Figura 1) nel software microscopio confocale a catturare sequenze video in tempo reale della plasmina lisi del coagulo.
    1. Fare clic su modalità di acquisizione e quindi selezionare "Serie Time." Seleziona il numero di cicli e l'intervallo di tempo di registrazione.

5. Calcolo fibrinolisi Tariffe

  1. Determinare il tasso lisi impostando un'area (2,500 micron 2) e calcolando il tempo trascorso necessario per sciogliere la superficie fissa del coagulo. Calcolare il tasso di lisi utilizzando la seguente equazione (figura 2):
    Equazione 1

6. Analisi statistica della fibrinolisi Tariffe

  1. Analizzare i dati di lisi utilizzando software di analisi statistica. Eseguire un ANOVA a senso unico e un post hoc test di Tukey-Kramer 44,45.

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Representative Results

Microscopia confocale Analisi di glicata fibrina Strutture Clot

Le immagini microscopia confocale di coaguli normali e glicate sono presentati in Figura 3. Microscopia confocale dei coaguli normali e glicate rivela che coaguli glicate sono più densi con pori inferiori ai coaguli normali con e senza l'aggiunta di FXIIIa durante la polimerizzazione coagulo. Nella Figura 3A e 3B, vi è una concentrazione di fibrina inferiore che crea una struttura meno densa coaguli di fibrina glicata con concentrazione più alta (Figure 3C e 3D).

La maggiore densità osservata (numero di fibre per unità di area) nei coaguli glicata è il risultato della maggiore concentrazione di fibrinogeno che si verifica nelle persone con diabete. Nelle normali coaguli, le fibre di fibrina erano più lineare e formano fibre più lunghe su polimerizzazione con FXIIIa, cheè probabilmente il risultato della FXIIIa formando legami incrociati tra le fibre. Nel caso dei coaguli glicate, le fibre sembravano essere più breve, anche con aggiunta di FXIIIa. Questo è probabilmente il risultato del processo di polimerizzazione che è stato modificato per la presenza di regioni glicate sulla molecola di fibrinogeno. Inoltre, dall'analisi figura 3, è probabile è che lo spessore della fibra è stato ridotto a seguito di glicazione, che è probabilmente il motivo la fluorescenza dalle fibre glicate sembrano avere una minore intensità.

Microscopia confocale Analisi di fibrina Clots contenenti globuli rossi di pazienti Sickle Cellulari

Le immagini al microscopio confocale della struttura coagulo di fibrina di coaguli con normale e globuli rossi di pazienti con anemia falciforme sono presentati in Figura 4. Come previsto, le immagini confocale dei coaguli di fibrina contenenti globuli rossi di pazienti con anemia falciforme avevano strutture più dense di quelle di un sano di fibrina clotti. La Figura 4A mostra una distribuzione omogenea di fibrina e globuli rossi normali. Tuttavia, in Figura 4B ci sono grumi di fibrina e vuoti dove nessuna rete di fibrina formata. I globuli rossi di pazienti con anemia falciforme, non sono stati omogeneamente disperse, ma piuttosto sono stati incorporati nei grumi di fibrina. La maggiore densità (numero di fibre per unità di superficie) era un risultato della maggiore concentrazione di fibrinogeno che si verifica come risultato della ipercoagulazione in pazienti SCD. Inoltre, la tendenza naturale dei globuli rossi di pazienti con anemia falciforme a formare aggregati generato ciuffi di globuli rossi che si intrecciò nella rete di fibrina. Questo ha portato alla formazione di strutture coagulo aberranti che sono marcatamente differente morfologia da quelle in pazienti normali. Dalla figura 4B, si osserva che i globuli rossi da pazienti con anemia falciforme causati maggiore eterogeneità nel campione fibrina e anche causato una più ampia distribuzione spaziale dei globuli rossi nel campione di fibrina, quando comconfrontato ai coaguli di fibrina sani con globuli rossi normali. Al contrario, i coaguli di fibrina sani con eritrociti normali visualizzate una dispersione più omogenea di cellule in tutta la rete di fibrina.

E si sa quanto HbS (falce emoglobina) è stato polimerizzato in eritrociti di pazienti con anemia falciforme ed è contenuto nei campioni. Ciò che è noto, tuttavia, è che la presenza di qualsiasi quantità dell'HbS provoca una maggiore aggregazione delle cellule in numero di molecole HbS per unità di volume vs normali molecole HbA. Pan et al. 46 hanno dimostrato questo fenomeno in uno studio in cui hanno confrontato gli effetti di aggregazione / di clustering di deossi-HbS, e, per il confronto, di ossi-HbS e ossi-adulto normale emoglobina, HbA. I grappoli si formano in pochi secondi dopo la preparazione della soluzione e le loro dimensioni ei numeri sono rimasti relativamente stabile per un massimo di 3 ore. Una delle conclusioni dello studio è che entrambe le molecole ossi-HBs e deossi-HBs raggruppati in un numero maggiore density di ossi-HbA molecole (normale) in funzione della temperatura. Appartenente allo studio attuale, questo significa che i globuli rossi di pazienti con anemia falciforme sono stati probabilmente a raggrupparsi insieme, e intrappolati fibrina mentre veniva polimerizzato dal precursore fibrinogeno.

Microscopia confocale Lysis analisi di tasso di normali e glicata Clots

E 'stato ipotizzato che i tassi di fibrinolisi sarebbe maggiore per le normali coaguli di fibrina rispetto a coaguli di fibrina glicata con una minore concentrazione di plasmina. Per verificare questa ipotesi, la microscopia confocale stato utilizzato per valutare i tassi di lisi di coaguli di fibrina con l'aggiunta di plasmina. La media (media) tassi di lisi di fibrina normale con l'aggiunta di 200 mg / ml di plasmin era 43,2 ± 26,5 micron 2 / sec e le (media) tassi medi di lisi di fibrina glicata con l'aggiunta di 200 ug / ml di plasmin stato 29.7 ± 11.2 micron 2 / sec. Per il coagulo di fibrina glicata lisato con50 ug / ml di plasmina, il tasso medio era del 12,8 ± lisi 3.1 micron 2 / se. Un totale di 10 campioni ciascuna (30 campioni) sono stati utilizzati per determinare i valori medi e deviazione standard. Questi valori sono riportati in Figura 5. Un valore p di 0,05 è stata utilizzata per determinare significatività tra i gruppi sperimentali indipendenti. Analisi dei tassi fibrinolisi dimostrato che il valore per i coaguli normali rispetto agli glicata (diabetici simulati) coaguli con diminuita plasmina erano significativamente differenti.

Figura 1
Figura 1. Esempio di schermata dal software microscopio confocale metodo per ottenere in tempo reale dettaglio, l'imaging continuo di coagulo di fibrina lisi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di This figura.

Figura 2
Figura 2. Esempio immagine confocale con area fissa utilizzata per calcolare la lisi del campione di coagulo di fibrina. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Immagini confocale di (diabetici) coaguli di fibrina sani e glicata. Fluorescenza verde rappresenta la rete di fibrina. La fibrina unglycated rappresenta formata coaguli in pazienti sani, mentre la fibrina glicata rappresenta formata coaguli nei pazienti diabetici. (A) fibrina Unglycated senza aggiunta di FXIIIa. (B) di fibrina Unglycated con FXIIIa. (C (D) la fibrina glicata con FXIIIa. La barra di scala rossa indica 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. immagini confocale di coaguli di fibrina sani con globuli rossi normali e coaguli di fibrina con globuli rossi di pazienti con anemia falciforme. Fluorescenza verde rappresenta la rete di fibrina e magenta rappresenta etichettati sano e globuli rossi da pazienti con anemia falciforme. (A) globuli rossi sani in concentrazione di fibrina normale con FXIIIa e (B) Aumento di fibrina con FXIIIa e globuli rossi da un paziente falciforme. La barra di scala bianca indica 50 micron. I cerchi bianchi in immagine (B) indicano globuli rossi a falce riconoscibili.

Figura 5
Figura 5. tassi fibrinolisi di normali coaguli di fibrina rispetto al glicata coaguli (diabetica) di fibrina e coaguli glicata con concentrazione plasmin ridotta. La significatività statistica è stato determinato sulla base di una ANOVA e post hoc Tukey-Kramer test di confronto multiplo. L'analisi ANOVA ha mostrato che vi era una differenza significativa tra i mezzi a tasso lisi. Il test di Tukey-Kramer ha dimostrato che non vi era una differenza significativa in mezzo tra i coaguli normali e coaguli con diminuzione plasmin con p <0.05. Il simbolo * indica una differenza significativa di grumi normali.

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Discussion

Per ottenere dati significativi sulla struttura dei meccanismi di coagulazione in stati di malattia, è importante isolare i fattori coinvolti nella coagulazione per determinare gli effetti delle proteine ​​e cellule in queste condizioni. Questo protocollo è stato sviluppato per i fini della valutazione della struttura del coagulo di fibrina in stati diabetici e SCD in vitro.

E 'necessario comprendere i meccanismi coinvolti nella formazione di fibrina e fibrinolisi in stati patologici in quanto le condizioni alterate causano ipercoagulazione, aterotrombosi, e CVD. Dalle immagini confocali ottenuti in questo esperimento, è evidente che l'attività ipercoagulazione si verifica negli stati diabetici e SCD, che provoca un aumento della concentrazione di fibrinogeno. Un aumento risultati concentrazione fibrinogeno in una rete di fibrina più densa con più punti di ramificazione e pori più piccoli di tutta la rete. Nelle reti di fibrina di pazienti SCD, non solo non c'è più di fibrina presenti, but natura aggregazione degli eritrociti da pazienti con anemia falciforme cambia anche la struttura della rete come intrappola fibrina in cluster. L'agglomerato di globuli rossi di pazienti con anemia falciforme riduce anche la porosità dei cluster fibrina nella rete, ma sembra aumentare la concentrazione vuoto nella rete globale. I risultati dell'analisi fibrinolisi dei coaguli glicate sostenuto l'ipotesi del tasso lisi in grumi glicate essendo inferiore con plasmina ridotta rispetto a quella dei normali sani, coaguli. Tuttavia, i risultati non hanno fornito prove conclusive circa i tassi di lisi di coaguli glicata con normali concentrazioni di plasmina. Così si può concludere che per i pazienti diabetici con normale concentrazione plasmina, ci può essere un'attività fibrinolisi sufficiente a degradare coaguli di fibrina in modo efficiente.

Per gli esperimenti condotti in questo studio di ricerca, sono stati usati proteine ​​isolate e globuli rossi, invece di sangue intero e plasma. Utilizzandoproteine ​​separate per sintetizzare i coaguli di fibrina, le cause per le strutture alterate tra il normale vs. coaguli malate possono essere determinati. Ciò riduce notevolmente la possibilità di avere altre proteine ​​plasmatiche interferiscono con la struttura e la morfologia dei coaguli di fibrina. Tuttavia, utilizzando proteine ​​isolate, è fondamentale per immagazzinare e manipolare le cellule e proteine ​​correttamente, in quanto sono più vulnerabili alla morte cellulare e la degradazione delle proteine.

La tecnica di imaging microscopia confocale scelto per questo studio fosse dovuto alla possibilità di ottenere immagini delle strutture coagulo di fibrina, pur mantenendo le proprietà naturali trombotiche delle cellule e proteine. La microscopia confocale è stato anche dimostrato di dare un maggior contrasto e risoluzione ottica del campione con rumore ridotto rispetto a microcopy luce tradizionale. La luce laser è diretto in un foro stenopeico che blocca la luce sfocata di entrare. Utilizzo della microscopia confocale ovviato la necessitàaggiunta di sostanze chimiche fissativo; così le cellule e le proteine ​​sono riusciti a mantenere la loro attività proteina naturale di formazione di coaguli di fibrina. Come risultato le cellule, proteine, enzimi e funzionavano nel loro stato nativo, permettendo l'uso di microscopia confocale per catturare immagini e video di attività in tempo reale. Con la microscopia confocale, immagini 3D dei coaguli di fibrina furono catturati e video di plasmin digestione di coaguli di fibrina sono stati ottenuti in tempo reale. Quando si aggiunge plasmina per il coagulo di catturare un video serie temporale del processo di lisi del coagulo, era importante utilizzare tramite azione capillare plasmina per disperdere omogeneamente l'enzima attraverso la matrice di fibrina. Questo è stato fatto per assicurare che la concentrazione plasmina aggiunto era preciso e permesso l'enzima per lisare il coagulo di intera, in contrasto con la zona che è stata aggiunta la plasmina.

Il metodo ed i risultati ottenuti in questo studio erano simili a uno studio svolto da Dunn et al, che ha trovato che lisi del coagulotassi erano significativamente più bassi nei soggetti diabetici rispetto ai soggetti di controllo 25. In entrambi gli studi, vi erano differenze significative nei tassi di lisi di diabetici (glicata), coaguli; Tuttavia, l'attuale protocollo può rappresentare accuratamente stati diabetici a causa dei livelli di plasmina ridotti. Inoltre, in questo fibrinolisi studio di ricerca è stato catturato continuamente in tempo reale utilizzando il microscopio confocale, contrariamente all'analisi sezioni discrete a intervalli di tempo differenti. Wooton et al. 47 hanno studiato coagulo di fibrina lisi e impiegato una velocità di lisi anteriore (cm / s) per indagare il tasso di lisi di coaguli. Hanno usato analisi di immagine confocale nel loro studio per determinare la velocità del fronte. In questo studio, invece di una velocità lisi anteriore, una velocità zona lisi è stato usato (a causa del modo in cui l'immagine è stata analizzata sul confocale). Per convalidare ulteriormente il metodo sviluppato nel nostro studio, in 48 gli autori hanno descritto un modello matematico di coagulo di fibrina lisi da plasmina, in cui prescrivono la velocità lisi anteriore in funzione della costante di velocità effettiva della fibrinolisi. L'equazione è data come:
Equazione 2

Qui, Equazione 3 rappresenta la costante di velocità effettiva di fibrinolisi, un K è la costante di adsorbimento, C è la concentrazione pm plasmina, e ρ Fn è la densità di fibrina. Se la quantità misurata Equazione 4 (Misurata dall'analisi confocale in corso di studio) è utilizzato ed è impiegata la regola della catena, questo porta a:
Equazione 5

t "> Supponendo una sola dimensione cambia per unità di tempo porta a:

Equazione 6

Equazione 7

Così la costante di velocità effettiva della fibrinolisi per l'esperimento porta a:
Equazione 8

Questa relazione ne deduce che la costante di velocità effettiva della fibrinolisi ( Equazione 9 ) È una funzione della concentrazione di plasmina (C pm) e il tasso di lisi zona Equazione 10 .

Questa tecnica è anche importante per lo studio della trombosi inSCD pazienti, poiché non vi è poco conosciuto circa fibrina e meccanismi di coagulazione rispetto a questa malattia. Ci sono stati pochi studi condotti sugli effetti di SCD sulla struttura di coaguli di fibrina; così le immagini confocale raccolti da questo studio fornisce rara visualizzazione della struttura coagulo con globuli rossi a falce incorporati.

Per confrontare le differenze di mezzo tra i due gruppi, utilizzare una ANOVA a senso unico e un test Tukey-Kramer post hoc. Un one-way ANOVA è un test statistico utilizzato per determinare una differenza statisticamente significativa nei mezzi tra gruppi indipendenti. Il post-test di Tukey-Kramer è utilizzato per confrontare il mezzo da ciascun gruppo indipendente e definire i mezzi gruppi 'sono statisticamente diversi tra loro. Prima di eseguire una ANOVA, ci sono sei presupposti che devono essere soddisfatti per garantire che i risultati sono validi. I sei ipotesi sono: una variabile (tasso di lisi) dipendente continua, una varia indipendenteBLE costituito da due o più gruppi indipendenti categoriali (normali, glicata, e glicata con ridotta plasmina), e indipendentemente i dati osservati in ogni gruppo in modo tale che un evento si verifichi non influenza un altro evento (Questo assicura che non vi è sovrapposizione di dati.) , il set di dati non contiene tutti i valori aberranti significativi, normalmente distribuito dati verificati dal test statistico Shapiro-Wilk, e l'omogeneità delle varianze dei dati verificati dal test statistico Levene. Una volta che sono state soddisfatte queste ipotesi, una ANOVA a senso unico e un test Tukey-Kramer post hoc sono state effettuate con un p-value di 0,05 come soglia per determinare la significatività statistica. Per un dettaglio rigorosa del ANOVA e-hoc dopo la prova Tukey-Kramer, fare riferimento a 44,45.

In generale, questo metodo consente per l'imaging di coaguli normali e anormali (a causa di stati di malati) fibrina nei loro stati d'origine. Il metodo prevede anche informazioni in tempo reale di immagini di coagulo lisi purel'analisi statistica dei tassi di lisi. La facilità con cui il trombo può essere prodotto e ripreso in vitro è utile per un'ampia gamma di applicazioni in ingegneria cellulare e tissutale.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

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References

  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45 (1998).

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Tecniche sperimentali e di imaging per l&#39;esame Strutture coagulo di fibrina in normali e patologiche Uniti
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