Introduction
פגיעה ברירית האנדותל של כלי דם לתיקון דרך התגובה לעצרת הדם, או היווצרות של קריש דם. כאשר דם מחלחל לתוך מטריצת החוץ תאית, גורמי רקמה להפעיל טסיות דם בזרם הדם המאפשרים חניכה של מפל הקרישה. המרכיב המכני המפתח של תהליך ריפוי זה הוא מטריצת הפיברין, מורכבת מסיבי הפיברין שאלסטיות גבוהה, ויכול לקיים כוחות גדולים 1-4. חוקרים רבים חקרו את מבנה המערך, ותפקוד של הפיברין בהרחבה בעשורים האחרונים 5-13.
יש חולים במחלות כגון סוכרת וחרמשית סיכון מוגבר לפתח סיבוכים טרומבוטיים כגון אוטם שריר לב, מחלת לב איסכמית, ומלטף 14-19. מעל 2 מיליון אנשים שאובחנו לאחרונה עם סוכרת בכל שנה בארצות הברית. ישנם שני סוגים של סוכרת: הסוג I, שבוגוף לא מצליח לייצר כמות מספקת של אינסולין, וסוג השני, שבו הגוף הופך עמיד לאינסולין. בקרב חולי סוכרת, מחלות לב וכלי דם (CVD) היא הסיבה ל- 80% מהתחלואה והתמותה הקשורים במחלה 20,21.
מחלה מגל תא (SCD) היא הפרעה גנטית המשפיעה על דם יותר מ -100,000 אנשים בארצות הברית 22. SCD הוא מחלה נקודה-מוטציה שגורמת לתאי דם אדומים להפוך בצורה חצי סהר, מה שהקשה על התאים לעבור בכלי דם הדם 23. שתי מדינות מחלה אלה מגבירים את הסיכוי לפתח תנאי atherothrombotic בגוף. אחת הסיבות לכך היא תוצאה של מבנה הפיברין שינה ותפקוד במצבים חולים 14,24-26.
בשתי הסוכרת ומחלות חרמשית, יש hypercoagulation ופעילות hypofibrinolysis שגורמת atherothrombosis ומחלות לב וכלי דם (CVD), בהשוואה למטופלים בריאים 17,27,28. זה ידוע שhypofibrinolysis מקדם התקדמות טרשת עורקים ומולידה אירועים איסכמיים חוזרים בחולים עם מחלת לב כלילית מוקדמת 29. בכתב היד הנוכחית, החוקרים בחנו את התפקיד של תכונות פיזיות הפיברין בהגדרה המסוימת הזה. מבני קריש הפיברין בחולים שאינם חולים מורכבים מסיבים דקים, נקבוביות גדול, ו14,24 בדרך כלל פחות צפופים. הנקבוביות המוגברת וקרישי פיברין פחות צפופים בנבדקים בריאים נמצאו כדי להקל על פירוק פיברין 16. בתנאי hyperthrombotic כגון מחלת סוכרת תא ומגל, יש עלייה בייצור פיברינוגן, גורמת לריכוז פיברינוגן להגדיל מהרמות נורמליות של 2.5 מ"ג / מיליליטר בחולים בריאים 30-33. קרישי פיברין נוצרו בחולי סוכרת נמצאו להיות פחות נקבובי, נוקשה יותר, יש יותר נקודות סניף, וצפוף יותר בהשוואה למי שאינו dia הבריא,חולי betic 14,24,33-35. מבנה הפיברין שינה הוא תוצאה של מנגנוני glycation המתרחשים בחלבונים מעורבים בהיווצרות קריש דם. glycation Nonenzymatic (בלתי הפיך) מתרחש כאשר מולקולות גלוקוז להיקשר לשאריות ליזין על מולקולת פיברינוגן, אשר מעכבת XIIIa האנושי גורם (FXIIIa) משאריות גלוטמין וליזין cross-linking כראוי 33,36,37.
הניתוח המבני של רשתות הפיברין נחקר בהרחבה לאחרונה. בפרט, חוקרים נצלו את מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזור 3D של רשתות הפיברין 38, חקרו כיצד תאים שני תאי intravascular (אנדותל) וextravascular (fibroblasts ושריר חלק) משפיעים על מבנה הפיברין 39, viscoelastic מנוצלת וניתוח ספקטרלי לנתח מבני הפיברין 40, ו מתאמים מפותחים בין מבנה ליפין ותכונות מכאניות באמצעות ניסוי וחישובי גישות 41 במבחנת glycation פיברינוגן. כדי לדמות תנאי קרישת מחלה חרמשית, ריכוזי פיברינוגן מוגברים היו מעורבים עם המטוקריט חרמשית שנאסף מחולים כפי שנעשה בעבר על ידי הקבוצה שלנו 42. שיטות אלה שמשו לבדיקת המבנה והפונקציות מעורבות בהיווצרות קריש הפיברין ופירוק פיברין בתנאים חולים, כמו גם את המנגנונים שגורמים לCVD. בהתבסס על מידע נוכחי על מחלות אלו, מבני קריש הפיברין Glycated היו צפופים יותר עם פחותnd נקבוביות קטן יותר. קרישי פיברין עם תאי דם אדומים של חולי אנמיה חרמשית (RBCs) היו גם צפופים ומוצגים אגרגציה של תאי הדם האדומים ואשכולות הפיברין מגובבים. זוהי תופעה מבוססת היטב כי כבר נקבעה בעבר 43. כמו כן, החוקרים שיערו כי שיעור הפירוק פיברין יהיה נמוך באופן משמעותי בקרישי פיברין Glycated עם ובלי פלסמין המופחת בהשוואה ליפין בריא, נורמלי. התוצאות הראו כי לקרישי פיברין Glycated, תוצאות שיעור תמוגה שונות באופן משמעותי נצפו רק בתנאים של ריכוז פלסמין מופחת. טכניקה ניסויית זו של שימוש במיקרוסקופ confocal מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות הדמיה אחרות, כי התאים והחלבונים להישאר במדינה האם שלהם, המאפשרת הלכידה וידאו של פעילות הקרישה בזמן אמת. שיטה זו של קרישה סינטטי התרמה היא גם זולה יותר ויעילה יותר זמן מאשר קבלת דגימות מטופל וסינון בודדחלבונים ואנזימים. יתר על כן, על ידי שימוש בחלבונים ואנזימים מופרדים לסנתז קרישים, קרישים היו סטנדרטיים, כך שלא היה שונות בין דגימות כתוצאה מחלבונים אחרים בפלזמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול הבא פועל לפי ההנחיות שנקבעו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) בג'ורג'יה טק.
איסוף דם 1. והליך בידוד תאי דם אדום
- לאסוף 40-120 מיליליטר של דם מתורמים ב 10 מיליליטר צינורות Vacutainer heparinized. התחל PBMC בידוד (תאי דם היקפיים mononucleated) בתוך 4 שעות של אוסף. במהלך תקופה זו, לשמור על דם בRT.
הערה: O / אחסון N של דם בRT או ב 4 ° C אינה מומלץ כזה יגרום לתשואת PBMC נמוכה יותר. - לדלל דם כל 1: 1 בPBS סטרילי קר כקרח (4 ° C).
- פיפטה 10 מיליליטר של פוליסכריד הידרופילי קר כקרח לתוך צינור ריק, סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. בעדינות להעביר כל דם מדולל על גבי פוליסכריד הידרופילי.
- השתמש פיפטה 25 מיליליטר בהגדרה איטית ודם טפטפת לאורך הצד של הצינור באיטיות רבה. ודא שהדם אינו מעורבב עם saccharide לפני centrifugation כי פוליסכריד הידרופילי הוא רעיל לתאים ואחרת, תשואת PBMC תהיה נמוכה יותר.
- דגימות דם צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 400 XG ב 4 מעלות צלזיוס. אם זמין, להפחית את מהירות הבלם של צנטריפוגות למחצית המרבית להפרדה טובה יותר לאחר צנטריפוגה.
- לשאוב את חלק פלזמה / טסיות דם של דגימת דם centrifuged. בזהירות לשאוב את שכבת פוליסכריד הידרופילי ישירות מעל שכבת RBC ארוזה.
- לאסוף 8-10 מיליליטר של תאי דם אדומים ארוזים ולדלל 1: 1 עם 0.9% מלוחים NaCl לא סטרילי.
2. מבני קריש Confocal מיקרוסקופית הערכת Glycated (קרישי סוכרתיים סימולציה)
- להפשיר פיברינוגן האדם והמצומד פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescently על 37 מעלות צלזיוס.
- פיפטה הבאה ל0.5 מיליליטר סיים צינור microcentrifuge.
- לקרישי פיברינוגן הבריאים, נורמלים, לערבב פיברינוגן אדם עם 10% פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescentlyהמצומד בחיץ 50 מ"מ טריס / 100 מ"מ NaCl בריכוז של 5 מ"ג / מיליליטר.
- לפיברינוגן Glycated באופן מלאכותי (כדי לדמות קרישים סוכרתיים), דגירה פיברינוגן אדם ו -10% המצומד פיברינוגן fluorescently שכותרתו בפתרון 5 מ"מ של גלוקוז מומס ב-50 מ"מ טריס / 100 מ"מ NaCl לריכוז של 6.8 מ"ג / מיליליטר וכתוצאה מכך.
- לכסות את צינורות מיקרו צנטריפוגות באמצעות חומר אטום כדי להימנע מחשיפה לאור. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
- הפוך תא בשקופית מיקרוסקופ זכוכית על ידי ההדבקה בדבק דק על 2 צדדים של השקופית.
- לאחר תקופת הדגירה 48 שעות, להכין חומרים כימיים להיווצרות הפיברין ידי הפשרת FXIIIa ותרומבין אלפא האנושי בRT.
- לדלל FXIIIa 80 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2.
- לדלל תרומבין 4 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2.
- לקרישים רגילים, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 2.5 מ 'g / ml, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl.
- לקרישים Glycated, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 3.4 מ"ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl.
- מייד פיפטה 30 μl של פתרון הפיברין לתוך התא שהוקם על ידי הדבק.
- מניחים 22 מ"מ כיסוי הזכוכית להחליק x 22 מ"מ עם עובי של 0.15 מ"מ על גבי 2 שכבות של דבק. חותם את הצדדים הפתוחים עם דבק ברור כדי למנוע קריש הפיברין מהתייבשות. ודא שהדבק אינו אינטראקציה עם קריש הפיברין.
- לאפשר לקרישי פיברין לפלמר ב21-23 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לפני ההדמיה confocal.
- קח תמונות מיקרוסקופיה confocal של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal עם עדשת השמן M27 40X / 1.30 עם לייזר ארגון 488 ננומטר.
3. Confocal מיקרוסקופית הערכת קרישי פיברין מכילים RBCs מחולי אנמיה חרמשית
- להפשיר פיברינוגן האדם והמצומד פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescently על 37 מעלות צלזיוס.
- פיפטה הבאה ל0.5 מיליליטר סיים צינור microcentrifuge.
- לקריש הפיברין הבריא, נורמלי, לערבב פיברינוגן אדם עם 10% המצומד פיברינוגן האדם שכותרתו fluorescently בחיץ mM NaCl 50 מ"מ טריס / 100 בריכוז של 5 מ"ג / מיליליטר.
- לקרישים המכילים SCD RBCs, לערבב פיברינוגן אדם ו -10% המצומד פיברינוגן האדם שכותרתו fluorescently ב-50 מ"מ טריס / 100 מ"מ NaCl כך שהריכוז של פיברינוגן וכתוצאה מכך הוא 10 מ"ג / מיליליטר.
- תווית RBCs המבודד (הן נורמליות ואלה מחולי אנמיה חרמשית שהתקבלו מפרוטוקול בידוד RBC) באמצעות פתרון תא תיוג.
- להשעות תאים בצפיפות של 1 x 10 6 לכל מיליליטר בכל מדיום תרבות סרום ללא בחר.
- הוסף 5 μl / מיליליטר של ההשעיה התא לפתרון תא תיוג. מערבבים היטב על ידי pipetting העדין בעדינות.
- צנטריפוגה צינורות השעיה שכותרתו ב 1500 סל"ד במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את supernatant ועדינות מחדש להשעות את התאים 37 ° C בינוני.
- חזור על תהליך השטיפה (3.3.4 ו3.3.5) עוד פעמיים.
- לדלל FXIIIa 80 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2.
- לדלל תרומבין 4 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2.
- לקרישים רגילים, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 2.5 מ"ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl.
- לקרישים המכילים SCD RBCs, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 5 מ"ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl.
- פיפטה 10 μl של RBCs שכותרתו לפתרון הפיברין. פיפטה 30 μl של הפיברין עם RBCs על משטח הזכוכית מיקרוסקופ (ראה להחליק הכנה לGLקרישי ycated).
- לאפשר ליפין לפלמר ב21-23 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לפני ההדמיה confocal.
- קח תמונות confocal של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal, ולנצל לייזרי עירור עם אורכי גל של 488 ננומטר 633 ננומטר ולהלהיב את הפיברין שכותרתו fluorescently וRBCs.
4. Confocal מיקרוסקופית הערכת הפירוק פיברין המחירים במבני קריש Glycated
- חזור על פרוטוקול מיקרוסקופיה confocal של קרישי Glycated (פרוטוקול שלב 2) להערכת שיעור הפירוק פיברין בקרישי Glycated.
- לא לאטום את הקצוות של החדר עם דבק ברור. לאפשר לקרישי פיברין לפלמר עבור 1.5 שעות ב21-23 מעלות צלזיוס במארז אטום המכיל 250 מיליליטר של מים על מנת למנוע התייבשות.
- לאחר פילמור, להשיג תמונות של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal.
- פלסמין פיפטה לקצה הפתוח של החדר ולפזר את פלסמין דרך הקריש באמצעות פעולת נימים.
- לניסויי פירוק פיברין נורמלים וGlycated עם ריכוזים נורמלים, פיפטה 25 μl ב 200 מיקרוגרם / מיליליטר של פלסמין לתוך הפתח של החדר.
- לקרישים Glycated עם ריכוזים מופחתים, פיפטה 25 μl ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר לתוך הפתח של החדר.
- השתמש בתכונת זמן הסדרה (ראה איור 1) בתוכנת מיקרוסקופ confocal ללכוד צילומי וידאו של פלסמין lysing הקריש בזמן אמת.
- לחץ מצב רכישה ולאחר מכן בחר "סדרות עתיות." בחר את מספר המחזורים ואת מרווח זמן הקלטה.
5. חישוב המחירים הפירוק פיברין
- לקבוע את שיעור תמוגה ידי הגדרת אזור (2,500 מיקרומטר 2) וחישוב הזמן שחלף נדרש לפזר אזור קבוע של הקריש. לחשב את שיעור תמוגה באמצעות המשוואה הבאה (איור 2):
6. ניתוח סטטיסטי של המחירים הפירוק פיברין
- לנתח את נתוני תמוגה באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית. לבצע ניתוח שונה חד-כיווני ופוסט הוק מבחן Tukey-Kramer 44,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Confocal ניתוח מיקרוסקופית של מבני קריש פיברין Glycated
תמונות מיקרוסקופיה confocal של קרישים נורמלים וGlycated מוצגות באיור 3. ניתוח מיקרוסקופיה Confocal של קרישים נורמלים וGlycated מגלה כי קרישי Glycated הם צפופים עם נקבוביות קטנות יותר מהקרישים נורמלים עם או בלי התוספת של FXIIIa במהלך פילמור קריש. באיור 3 א ו3B, יש ריכוז נמוך הפיברין שיצר מבנה פחות צפוף מאשר קרישי Glycated עם ריכוז גבוה יותר הפיברין (3C דמויות ו3D).
הצפיפות הגדולה יותר שנצפתה (מספר הסיבים ליחידת שטח) בקרישי Glycated היא תוצאה של ריכוז פיברינוגן המוגבר שמתרחש אצל אנשים עם סוכרת. בקרישים נורמלים, סיבי הפיברין היו יותר ליניארי ויצרו סיבים ארוכים יותר על פילמור עם FXIIIa, שסביר להניח תוצאה מFXIIIa יוצרת צלב קישורים בין הסיבים. במקרה של קרישי Glycated, הסיבים נראים קצר יותר, אפילו עם תוספת של FXIIIa. זה עשוי התוצאה של תהליך פילמור ששונה בשל נוכחותם של אזורי Glycated על מולקולת פיברינוגן. בנוסף, מניתוח איור 3, סביר להניח הוא שעובי הסיבים הופחת גם כתוצאה מglycation, אשר צפוי מדוע הקרינה מסיבי Glycated נראה שיש לי עוצמה נמוכה יותר.
Confocal ניתוח מיקרוסקופית של קרישי פיברין מכילים RBCs מחולי אנמיה חרמשית
תמונות מיקרוסקופ confocal של מבנה קריש הפיברין קרישים עם נורמלי וRBCs מחולי אנמיה חרמשית מוצגות באיור 4. כצפוי, תמונות confocal של קרישי פיברין המכילים RBCs מחולי אנמיה חרמשית היו מבנים צפופים יותר מאלה של בריא ג הפיבריןהמון. איור 4 א מציג התפלגות אחידה של הפיברין וRBCs הנורמלי. עם זאת, באיור 4 יש גושים של הפיברין וחללים שבו אין רשת הפיברין נוצרה. RBCs מחולי אנמיה חרמשית לא homogenously התפזר, אלא היו משובץ בגושי הפיברין. הצפיפות המוגברת (מספר הסיבים ליחידת שטח) הייתה תוצאה של ריכוז פיברינוגן המוגבר המתרחש כתוצאה מhypercoagulation בחולי SCD. יתר על כן, הנטייה הטבעית של RBCs מחולי אנמיה חרמשית כדי ליצור אגרגטים הולידה גושים של RBCs שהפך שזורה לרשת הפיברין. זה הביא להיווצרות של קריש מבנים חריגים, כי הם שונים במידה ניכרת מאלה במורפולוגיה בחולים רגילים. מאיור 4, הוא ציין כי RBCs מחולי אנמיה חרמשית שנגרם הטרוגניות רבה יותר במדגם הפיברין וגם גרם לפריסה המרחבית רחבה יותר של RBCs במדגם הפיברין, כאשר compared לקרישי פיברין הבריאים עם RBCs הנורמלי. בניגוד לכך, קרישי פיברין הבריאים עם RBCs הרגיל מוצג פיזור הומוגני יותר של תאים בכל רשת הפיברין.
לא ידוע כמה HBS (המוגלובין מגל) היה polymerized באריתרוציטים מחולי אנמיה חרמשית וכלול בדגימות. מה ידוע, עם זאת, הוא שהנוכחות של כל כמות של HBS גורמת צבירה גדולה יותר של תאים במספר מולקולות HBS ליחידת נפח לעומת מולקולות HbA נורמליות. פאן et al. 46 הראו את התופעה הזאת במחקר שבו הם השוו את השפעות צבירה / אשכולות של deoxy-HBS, ו, לשם השוואה, של אצטילן-HBS והמוגלובין הבוגר אצטילן-נורמלי, HBA. האשכולות נוצרו תוך מספר שניות לאחר הכנת פתרון והגדלים ומספרם נשארו יציבים יחסית לתקופה של עד 3 שעות. אחת המסקנות מהמחקר היה ששני מולקולות אצטילן-HBS וdeoxy-HBS התקבצו בחדר עבודה של מספר גבוה יותרsity מ אצטילן HbA-מולקולות (רגילות) כפונקציה של טמפרטורה. הנוגע למחקר הנוכחי, זה אומר שRBCs מחולי אנמיה חרמשית היה סביר להתקבץ יחדיו, ונלכד הפיברין כפי שהיה להיות polymerized ממבשר פיברינוגן.
Confocal מיקרוסקופית תמוגה ניתוח שערי קרישי רגיל וGlycated
עלינו השערה כי שיעורי פירוק פיברין יהיו גדולים יותר לקרישי פיברין נורמלים בהשוואה לקרישי פיברין Glycated עם ירידה בריכוז פלסמין. כדי לבדוק השערה זו, מיקרוסקופיה confocal שימשה כדי להעריך את שיעורי תמוגה קרישי פיברין עם התוספת של פלסמין. הממוצע (הממוצע) שיעורי תמוגה של הפיברין הרגיל עם התוספת של 200 מיקרוגרם / מיליליטר של פלסמין היו 43.2 ± 26.5 מיקרומטר 2 / sec והממוצע (ממוצעת) שיעורי תמוגה של הפיברין Glycated עם התוספת של 200 מיקרוגרם / מיליליטר של פלסמין היה 29.7 ± 11.2 מיקרומטר 2 / sec. לקריש הפיברין Glycated lysed עם50 מיקרוגרם / מיליליטר של פלסמין, השיעור הממוצע היה 12.8 תמוגה ± 3.1 מיקרומטר 2 / se. סך של 10 דגימות כל אחת (30 דגימות) שימש לקביעת ערכי הסטייה הממוצעת וסטנדרטיים. ערכים אלה מוצגים באיור 5. p-ערך של 0.05 שימש לקביעת משמעות בין קבוצות ניסוי עצמאיות. ניתוח של שיעורי הפירוק פיברין הוכיח כי הערך עבור קרישים נורמלים בהשוואה לקרישי Glycated (המדומה הסוכרתי) עם הירידה בפלסמין היה שונה באופן משמעותי.
איור 1. צילום מסך לדוגמא מתוכנה מיקרוסקופ confocal מפרטת שיטה לקבלת בזמן אמת, הדמיה רציפה של תמוגה קריש הפיברין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של thiדמות של.
תמונת confocal 2. דוגמא איור עם אזור קבוע המשמש לחישוב שיעור תמוגה של מדגם קריש הפיברין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תמונות Confocal של קרישי פיברין בריאים וGlycated (סוכרת). הקרינה ירוקה מייצגת את רשת הפיברין. הפיברין unglycated מייצג קרישים נוצרו בחולים בריאים, ואילו הפיברין Glycated מייצג קרישים נוצרו בחולי סוכרת. הפיברין Unglycated ללא תוספת FXIIIa (). הפיברין Unglycated עם FXIIIa (B). (C D). סרגל קנה המידה האדום מציין 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תמונות Confocal של קרישי פיברין בריאים עם RBCs הנורמלי וקרישי פיברין עם RBCs מחולי אנמיה חרמשית. הקרינה ירוקה מייצגת את רשת הפיברין ומגנט מייצג כותרתו בריא וRBCs מחולי אנמיה חרמשית. () RBCs בריא בריכוז נורמלי הפיברין עם FXIIIa והפיברין (B) מוגבר עם FXIIIa וRBCs ממטופל חרמשית. סרגל קנה המידה לבן מציין 50 מיקרומטר. העיגולים הלבנים בתמונה (B) מצביעים RBCs sickled לזיהוי. 
איור 5. שיעורי פירוק פיברין קרישי פיברין נורמלים בהשוואה לGlycated קרישי פיברין (סוכרת) וקרישי Glycated עם ריכוז פלסמין מופחת. משמעות סטטיסטי נקבע בהתבסס על ניתוח שונה חד-כיווני ולאחר בדיקת השוואה מרובה הוק Tukey-Kramer. ניתוח ANOVA הראה כי לא היה הבדל משמעותי בין אמצעי שיעור תמוגה. מבחן Tukey-Kramer הראה כי לא היה הבדל משמעותי באמצעי בין קרישים נורמלים וקרישים עם פלסמין ירד עם ap <0.05. * מציין הבדל משמעותי מקרישים נורמלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לקבל נתונים משמעותיים על המבנה של מנגנוני קרישה במצבי מחלה, חשוב לבודד את הגורמים מעורבים בקרישה כדי לקבוע את ההשפעות של החלבונים ותאים בתנאים אלה. פרוטוקול זה פותח לצורך חקירת המבנה של קריש הפיברין במדינות סוכרת וSCD במבחנה.
זה הכרחי כדי להבין את המנגנונים מעורבים בהיווצרות הפיברין ופירוק פיברין במצבי מחלה שכן תנאים השתנו לגרום hypercoagulation, atherothrombosis, וCVD. מתמונות confocal שהתקבלו בניסוי זה, ברור כי פעילות hypercoagulation מתרחשת במדינות סוכרת וSCD, מה שגורם לריכוז פיברינוגן מוגבר. תוצאות ריכוז פיברינוגן מוגברים ברשת הפיברין צפופה עם יותר נקודות סניף ונקבוביים קטנים ברחבי הרשת. ברשתות הפיברין של חולי SCD, לא רק שיש יותר נוכח הפיברין, but טבע צבירה של אריתרוציטים מחולי אנמיה חרמשית גם משנה את המבנה של הרשת כפי שהיא לוכדת הפיברין לאשכולות. הגיבוב של RBCs מחולי אנמיה חרמשית גם מפחית נקבוביות של אשכולות הפיברין ברשת, אבל נראה להגדיל ריכוז החלל ברשת הכוללת. תוצאות ניתוח הפירוק פיברין של קרישי Glycated תמכו בהשערה של קצב תמוגה בקרישי Glycated להיות נמוך יותר עם פלסמין מופחת מזו של קרישים בריאים, נורמלים. עם זאת, התוצאות לא מספקות ראיות חותכות על שיעורי תמוגה קרישי Glycated עם ריכוזים נורמלים של פלסמין. כך ניתן להסיק כי לחולי סוכרת עם ריכוז פלסמין רגיל, ייתכן שיש פעילות פירוק פיברין מספיק כדי לבזות קרישי פיברין בצורה יעילה.
לניסויים שבוצעו במחקר זה, חלבונים וRBCs מבודדים שמשו, במקום כל הדם ופלזמה. על ידי שימוש בחלבונים מופרדים לסנתז קרישי פיברין, את הסיבות למבנים שינו בין הנורמלי לעומת קרישים חולים ניתן לקבוע. זה מופחת במידה ניכרת אפשרות שחלבוני פלזמה אחרות להפריע למבנה ומורפולוגיה של קרישי פיברין. עם זאת, על ידי שימוש בחלבונים מבודדים, חשוב לאחסן ולטפל בתאים וחלבונים כמו שצריך, כמו שהם פגיעים יותר למוות של תאים ופירוק חלבונים.
טכניקת ההדמיה מיקרוסקופית confocal שנבחרה למחקר זה הייתה בגלל היכולת להשיג תמונות של מבני קריש הפיברין תוך שמירה על המאפיינים טרומבוטיים הטבעיים של התאים וחלבונים. מיקרוסקופיה Confocal גם הוכח לתת ניגודיות משופרת ורזולוציה אופטית של הדגימה עם רעש מופחת בהשוואה לmicrocopy אור המסורתי. אור הלייזר מכוון אל חריר שאור לא ממוקד בלוקים מלהיכנס. ניצול של מיקרוסקופיה confocal בטל את הצורך בתוספת של כימיקלים מקבע; כך התאים והחלבונים היו מסוגלים לשמור על פעילות החלבון הטבעית שלהם ויוצרים קרישי פיברין. כתוצאה מכך תאים, חלבונים, האנזימים ופעלו במדינה האם שלהם, המאפשרים שימוש במיקרוסקופ confocal עבור לכידת תמונות וסרטוני וידאו של פעילות בזמן אמת. עם מיקרוסקופיה confocal, תמונות 3D של קרישי פיברין נתפסו וקטעי וידאו של עיכול פלסמין קרישי פיברין התקבלו בזמן אמת. בעת הוספת פלסמין לקריש כדי ללכוד וידאו סדרת זמן של תהליך תמוגה הקריש, זה היה חשוב להשתמש פעולת נימים באמצעות פלסמין לפזר את האנזים homogenously באמצעות מטריצת הפיברין. הדבר נעשה על מנת להבטיח כי ריכוז פלסמין הוסיף היה מדויק ואיפשר לאנזים לlyse כל הקריש, בניגוד לתקשורת המקומית כי פלסמין נוספו.
השיטה והתוצאות שהתקבלו במחקר זה היו דומים למחקר שנעשה על ידי דאן et al, שמצא כי תמוגה הקריששיעורים היו נמוכים יותר באופן משמעותי בנושאי סוכרת מנבדקי ביקורת 25. בשני המחקרים, היו הבדלים משמעותיים בשיעורי תמוגה קרישים סוכרתיים (Glycated); עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי עשוי לייצג במדויק מדינות סוכרת בשל רמות פלסמין המופחתת. בנוסף, בפירוק פיברין מחקר זה נתפס ברציפות בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ confocal, בניגוד לניתוח סעיפים נפרדים במרווחי זמן שונים. ווטון et al. 47 חקרו תמוגה קריש הפיברין ומועסקים מהירות מול תמוגה (סנטימטר / s) כדי לחקור את שיעור תמוגה לקרישים. הם השתמשו בניתוח תמונת confocal במחקר שלהם כדי לקבוע את המהירות הקדמית. במחקר הנוכחי, במקום מהירות מול תמוגה, מהירות אזור תמוגה שימשה (בגלל הדרך שהתמונה נותחה על confocal). כדי לאמת את השיטה שפותחה במחקר שלנו עוד יותר, המחברים ב -48 תארו מודל מתמטי של תמוגה קריש הפיברין ידי פלסמין, שבו הם רושמים את המהירות מול תמוגה כפונקציה של קבוע הריבית האפקטיבי בפירוק פיברין. המשוואה היא נתון כמו: 
כאן, 
מייצג את קבוע ריבית האפקטיבי בפירוק פיברין, K הוא קבוע הספיחה, בערב C הוא הריכוז פלסמין, וρ Fn הוא הצפיפות של הפיברין. אם הכמות שנמדדה 
(נמדד מניתוח confocal במחקר הנוכחי) מנוצל וכלל השרשרת הוא מועסק, זה מוביל ל: 
כך קבוע ריבית האפקטיבית בפירוק פיברין לניסוי מוביל ל: 
מערכת היחסים הזאת מנסה להגיד שקבוע הריבית האפקטיבי בפירוק פיברין ( 
) היא פונקציה של ריכוז פלסמין (pm C) והמחיר תמוגה האזור 
.
טכניקה זו היא גם חשובה לחקר פקקת בחולי SCD, שכן יש ידוע קצת על יפין ומנגנוני קרישה ביחס למחלה זו. היו מעט מאוד מחקרים שנערכו על ההשפעות של SCD על המבנה של קרישי פיברין; כך תמונות confocal שנאספו ממחקר זה מספקת הדמיה נדירה של מבנה הקריש עם RBCs sickled המשולב.
כדי להשוות את ההבדלים באמצעי בין הקבוצות, השתמש ANOVA חד-כיווני ומבחן Tukey-Kramer פוסט הוק. כיוון אחד ANOVA הוא מבחן סטטיסטי המשמש לקביעת הבדל מובהק סטטיסטי באמצעי בין קבוצות עצמאיות. לאחר בדיקת Tukey-Kramer משמשת להשוואת האמצעי מכל קבוצה עצמאית ולקבוע אילו האמצעים של הקבוצות שונים מבחינה סטטיסטית זה מזה. לפני ביצוע ניתוח שונה חד-כיווני, יש שש הנחות שיש לעמוד על מנת להבטיח שהתוצאות תקפות. שש הנחות הן: משתנה (שיעור תמוגה) תלוי רציף, שונות עצמאיותble מורכב משתיים או יותר עצמאי קבוצות קטגורי (רגילות, Glycated, וGlycated עם פלסמין המופחת), ובאופן עצמאי נצפה נתונים בכל קבוצה כך שאירוע אחד שאירע אינו משפיע על אירוע אחר (זה מבטיח כי אין חפיפה בנתונים.) , בסיס הנתונים לא מכילים כל חריגים משמעותיים, מתפלגים נורמלי הנתונים אומתו על ידי הבדיקה הסטטיסטית שפירו-וילק, וההומוגניות של סטיות בנתונים שאומתו על ידי הבדיקה הסטטיסטית לוין. ברגע שהנחות אלה נפגשו, ANOVA חד-כיווני ומבחן Tukey-Kramer פוסט הוק בוצעו עם p-ערך של 0.05 כסף לקביעת מובהקות סטטיסטיות. לפירוט מדוקדק של ANOVA חד-כיווני ומבחן Tukey-Kramer פוסט-הוק, מתייחס ל44,45.
בסך הכל, בשיטה זו מאפשרת הדמיה של קרישי פיברין נורמלים ולא נורמלים (עקב מדינות חולות) במדינות האם שלהם. השיטה מספקת גם פרטים להדמיה של תמוגה קריש בזמן אמת, כמו גםכניתוח סטטיסטי של שיעורי תמוגה. הקלות שבה קריש הדם יכול להיות מיוצרת וצלם במבחנה שימושית למגוון רחב של יישומים בתחום הנדסת רקמות ותאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 ml graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
References
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
- Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
- Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
- Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
- Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
- Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
- Wolberg, A. S.
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
- Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F.
- Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
- Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
- Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
- Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
- Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
- American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
- Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
- Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
- Stuart, M. J., Nagel, R. L.
- Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
- Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
- Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
- Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
- Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
- Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
- Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
- Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
- Weisel, J. W.
- Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
- Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
- Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
- Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
- Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
- Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
- Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
- Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
- Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
- Allison, A.
- Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
- Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
- Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
- Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
- Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45 (1998).
