Eksperimentelle og Imaging Teknikker for Undersøke fibrinkoagel Structures i Normal og Syke States

Introduction

Skade på en blodåre er endothelial fôr er reparert gjennom hemostatiske respons, eller dannelse av en blodpropp. Når blodgjennomsyrer i det ekstracellulære matrise, vev faktorer aktiverer blodplater i blodet som letter initiering av koagulasjonskaskaden. Nøkkelen mekaniske komponent av dette helbredelsesprosessen er den fibrin-matrise, som består av fibrin fibre som er meget elastiske og kan tåle store krefter ^1-4. Mange forskere har studert formasjonen struktur og funksjon av fibrin i stor utstrekning i de siste tiår ^5-13.

Pasienter med sykdommer slik som diabetes mellitus og sigdcelle har en økt risiko for utvikling av trombotiske komplikasjoner som myokardinfarkt, iskemisk hjertesykdom, slag og ^14-19. Over 2 millioner mennesker er nylig diagnostisert med diabetes mellitus hvert år i USA. Det er to typer av diabetes: Type I, derkroppen ikke klarer å fremstille tilstrekkelige mengder av insulin, og type II, hvor kroppen blir motstandsdyktig mot insulin. Blant pasienter med diabetes, er kardiovaskulær sykdom (CVD) på grunn til 80% av sykelighet og dødelighet i forbindelse med sykdommen ^20,21.

Sigdcelleanemi (SCD) er en genetisk blodsykdom som rammer mer enn 100.000 mennesker i USA ^22. SCD er en punkt-mutasjoner sykdom som fører til de røde blodcellene blir halvmåneformet, noe som gjør det vanskelig for cellene til å passere gjennom blod vaskulaturen ^23. Begge disse sykdomstilstander øker sjansene for å utvikle aterotrombotiske tilstander i kroppen. En av grunnene til dette er et resultat av endret fibrin struktur og funksjon i syke tilstander ^14,24-26.

I begge diabetes og sigdcelleanemi, er det hyperkoagulasjon og hypofibrinolysis aktivitet som induserer aterotrombose og kardiovaskulær sykdom (CVD) sammenlignet med friske pasienter ^17,27,28. Det er kjent at hypofibrinolysis fremmer åreforkalkning progresjon og skaper tilbakevend iskemiske hendelser for pasienter med tidlig koronarsykdom ^29. I dagens manuskript, undersøkte vi rollen som fibrin fysiske egenskaper i denne innstillingen. Fibrinkoagel strukturer i ikke-syke pasienter som er sammensatt av tynne fibre, større porer, og generelt mindre tett ^14,24. Den økede porøsitet og mindre tette fibrinkoageler hos friske pasienter har blitt funnet å lette fibrinolyse ^16. I hyperthrombotic tilstander slik som diabetes og sigdcelleanemi, er det en økning i fibrinogen produksjon, forårsaker fibrinogen-konsentrasjon til å øke mot normale nivåer av 2,5 mg / ml hos friske pasienter ^30-33. Fibrinkoageler dannet i diabetiske pasienter har blitt funnet å være mindre porøs, stivere, har flere forgreningspunkter, og tettere sammenlignet med friske, ikke-diaBetic pasienter ^14,24,33-35. Den endrede fibrin strukturen er et resultat av glycation mekanismer som forekommer i proteiner som er involvert i dannelse av blodpropper. Enzymatisk (irreversible) glykering oppstår når glukose molekyler binder seg til lysinrester på fibrinogen molekyl, som hemmer menneskelig faktor Xllla (FXIIIa) fra ordentlig kryss kobling glutamin og lysinrester ^33,36,37.

Den strukturelle analysen av fibrin nettverk har blitt studert inngå nylig. Spesielt har forskere benyttet elektronmikroskopi og 3D rekonstruksjon av fibrin-nettverk ^38, som er undersøkt hvordan både intravaskulære (endotelceller) celler og ekstravaskulære (fibroblaster og glatte muskelceller) celler påvirker fibrin struktur ^39, benyttet viskoelastisk og spektralanalyse for å analysere fibrin-strukturer ^40, og utviklede sammenhenger mellom fibrin struktur og mekaniske egenskaper ved hjelp av eksperimentell og beregningsorientert tilnærminger ⁴¹ in vitro fibrinogen glykering. Å simulere sigdcelleanemi clotting forhold, ble økt fibrinogen konsentrasjoner blandet med sigdcelle hematokrit innsamlet fra pasienter som gjort tidligere av vår gruppe ^42. Disse metodene ble anvendt for å undersøke strukturen og funksjonene som er involvert i fibrin-klumpdannelse og fibrinolyse i henhold syke betingelser, samt mekanismer som induserer CVD. Basert på oppdatert informasjon om disse sykdommene, de glykerte fibrinkoagel strukturer var tettere med færre ennd mindre porer. De fibrinkoageler med røde blodceller fra pasienter med sigdcelle (RBC) ble også tettere og vist aggregering av de røde blodlegemer og fibrin agglomererte klaser. Dette er et veletablert fenomen som har blitt bestemt tidligere ^43. Det ble også en hypotese om at fibrinolyse raten ville være betydelig lavere i glykerte fibrinkoageler med og uten redusert plasmin i forhold til sunn, normal fibrin. Resultatene viste at for glykerte fibrinkoageler, signifikant forskjellige lyse sats resultater ble observert kun under betingelser med redusert plasmin konsentrasjon. Denne eksperimentelle teknikken med å bruke konfokalmikroskopi gir betydelige fordeler fremfor andre avbildningsmetoder fordi cellene og proteiner forblir i sin opprinnelige tilstand, noe som gjør det mulig å fange av sanntids video av clotting aktivitet. Denne metoden for syntetisk induserende blodpropp er også billigere og mer tidseffektiv enn å skaffe pasientprøver og filtrere ut enkelteproteiner og enzymer. Videre, ved hjelp av separerte proteiner og enzymer for å syntetisere propper ble klumper standardisert, slik at det ikke var variasjonen mellom prøver som et resultat av andre proteiner i plasma.

Protocol

MERK: Følgende protokoll følger de retningslinjer fastsatt av Institutional Review Board (IRB) ved Georgia Tech.

1. Blodprøvetaking og røde blodceller Isolation Prosedyre

1. Samle 40-120 ml blod fra givere i 10 ml hepariniserte vacutainerrør. Starte PBMC (perifert blod mononukleærerte celle) isolasjon innen 4 timer av samlingen. I løpet av denne tiden holde blodet ved RT.
   MERK: O / N lagring av blod i RT eller i 4 ° C anbefales ikke da dette vil resultere i lavere PBMC yield.
2. Fortynn helblod 1: 1 i iskald (4 ° C) steril PBS.
3. Pipetter 10 ml iskald hydrofilt polysakkarid i en tom, sterilt 50 ml konisk rør. Forsiktig overføre fortynnet fullblod på toppen av det hydrofile polysakkarid.
4. Bruke en 25 ml pipette i langsom innstilling og pipette blod langs siden av røret meget langsomt. Sikre at blodet ikke blir blandet med sakkarid før sentrifugersentrifugering fordi den hydrofile polysakkarid er giftig for celler og ellers, vil PBMC avkastningen blir lavere.
5. Sentrifuger blodprøver i 30 minutter ved 400 x g ved 4 ° C. Hvis tilgjengelig, redusere bremsehastigheten til sentrifugen til halvparten av maksimum for bedre separasjon etter sentrifugering.
6. Aspirer av plasma / blodplatefraksjon av den sentrifugerte blodprøven. Nøye aspirere av det hydrofile sjikt polysakkarid direkte over sammenpakket RBC-lag.
7. Samle 8-10 ml pakket RBC og fortynne 1: 1 med unsterile 0,9% NaCl saltvann.

2. Konfokalmikroskopi Evaluering av glykosylert Clot Structures (simulert diabetiker Propper)

1. Tine humant fibrinogen og fluorescens-merket humant fibrinogen konjugat ved 37 ° C.
2. Pipette følgende i en 0,5 ml måle mikrosentrifugerør.
   1. For de sunne, normale fibrinogen propper, bland humant fibrinogen med 10% fluoresceinmerket humant fibrinogenkonjugat i en 50 mM Tris / 100 mM NaCl-buffer i en konsentrasjon på 5 mg / ml.
   2. For kunstig glykert fibrinogen (for å simulere diabetiske clots), inkuber humant fibrinogen og 10% fluorescensmerket fibrinogen-konjugat i en 5 mM oppløsning av glukose oppløst i 50 mM Tris / 100 mM NaCl for en resulterende konsentrasjon på 6,8 mg / ml.
3. Dekk til mikro-sentrifugerør bruker en ugjennomsiktig materiale for å unngå eksponering for lys. Inkuber rørene i et 37 ° C vannbad i 48 timer.
4. Gjør et kammer på et glass objektglass ved å feste en tynn lim på to sider av raset.
5. Etter 48 timers inkubasjonstid, forberede reagenser for fibrindannelse ved avriming FXIIIa og menneskelig alfa trombin ved RT.
6. Fortynne FXIIIa til 80 U / ml i 5 mM _CaCI2 buffer.
7. Fortynn trombin til 4 U / ml i 5 mM _{CaCl2-buffer.}
   1. For normale klumper, sørge for at de endelige konsentrasjoner av fibrinogen, FXIIIa, og trombin er 2,5 mg / ml, 20 U / ml, og 1 U / ml, henholdsvis i et volum på 50 pl.
   2. For de glykerte blodpropper, sørge for at de endelige konsentrasjoner av fibrinogen, FXIIIa, og trombin er 3,4 mg / ml, 20 U / ml, og 1 U / ml, henholdsvis ved et volum på 50 pl.
8. Umiddelbart pipettere 30 ul av fibrin oppløsningen inn i kammeret som dannes av limet.
9. Plasser en 22 mm x 22 mm glass dekkglass med tykkelse på 0,15 mm på toppen av de to lag av klebemiddel. Forsegle de åpne sidene med klar tape for å hindre fibrinkoagel tørker ut. Pass på at limet ikke samhandle med fibrinkoagel.
10. La fibrinkoageler å polymerisere ved 21 til 23 ° C i 2 timer før konfokal avbildning.
11. Ta konfokalmikroskopi bilder av blodpropp ved bruk av et konfokal mikroskop med en 40X / 1.30 Oil M27 linse med en 488 nm Argon laser.

3. Konfokalmikroskopi Evaluering av fibrinkoageler Inneholder RBC fra Sickle Cell Pasienter

1. Tine humant fibrinogen og fluorescens-merket humant fibrinogen konjugat ved 37 ° C.
2. Pipette følgende i en 0,5 ml måle mikrosentrifugerør.
   1. For det sunne, normale fibrinklump, bland humant fibrinogen med 10% fluorescensmerkede humant fibrinogen-konjugat i en 50 mM Tris / 100 mM NaCl-buffer i en konsentrasjon på 5 mg / ml.
   2. For de klumper som inneholder SCD RBC, bland humant fibrinogen og 10% fluorescensmerkede humant fibrinogen-konjugat i en 50 mM Tris / 100 mM NaCl, slik at den resulterende konsentrasjon av fibrinogen er 10 mg / ml.
3. Etiketten de isolerte RBC (både normale og de fra sigdcelle pasienter oppnådd fra RBC isolasjonsprotokoll) ved hjelp av en celle-merking løsning.
   1. Suspendere celler i en tetthet på 1 x 10 ⁶ per ml i en hvilken som helst valgt serumfritt kulturmedium.
   2. Tilsett 5 ul / ml av cellesuspensjonen til den cellemerking løsning. Bland godt ved forsiktig pipettering forsiktig.
   3. Sentrifuger merkede opphengsrørene ved 1500 rpm i 5 minutter ved 37 ° C.
   4. Fjern supernatanten og forsiktig resuspendere cellene i 37 ° C-medium.
   5. Gjenta vaskeprosedyren (3.3.4 og 3.3.5) to ganger til.
4. Fortynne FXIIIa til 80 U / ml i 5 mM _CaCI2 buffer.
5. Fortynn trombin til 4 U / ml i 5 mM _{CaCl2-buffer.}
   1. For vanlige klumper, sikre at de endelige konsentrasjoner av fibrinogen, FXIIIa, og trombin er 2,5 mg / ml, 20 U / ml, og 1 U / ml, henholdsvis ved et volum på 50 pl.
   2. For de klumper som inneholder SCD RBC-er, at de endelige konsentrasjoner av fibrinogen, FXIIIa, og trombin er 5 mg / ml, 20 U / ml, og 1 U / ml, henholdsvis ved et volum på 50 pl.
6. Pipetter 10 ul av de merkede røde blodceller inn i fibrin oppløsningen. Pipetter 30 ul av fibrin med RBC bort på mikroskopglass (se preparat for å gl gliycated propper).
7. La fibrin å polymerisere ved 21 til 23 ° C i 2 timer før konfokal avbildning.
8. Ta konfokale bilder av blodpropp ved bruk av konfokal mikroskop, og utnytte eksitasjon lasere med bølgelengder av 488 nm og 633 nm å opphisse fluoresceinmerket fibrin og RBC.

4. Konfokalmikroskopi Evaluering av Fibrinolyse priser i glykosylert Clot Structures

1. Gjenta konfokalmikroskopi protokollen glykerte propper (Protokoll Trinn 2) for fibrinolyse rente evaluering i glykerte propper.
2. Ikke forsegle endene av kammeret med klar tape. La fibrinkoageler å polymerisere i 1,5 timer ved 21-23 ° C i en forseglet kapsling inneholdende 250 ml vann for å forhindre dehydrering.
3. Etter polymerisasjon, få bilder av blodpropp ved bruk av konfokal mikroskop.
4. Pipetter plasmin i den åpne ende av kammeret og dispergere plasmin gjennom clot via kapillarvirkning.
   1. Forde normale og glykerte fibrinolyse eksperimenter med normale konsentrasjoner, pipette 25 pl 200 pg / ml plasmin inn i åpningen av kammeret.
   2. For de glykerte blodpropper med reduserte konsentrasjoner, pipette 25 ul ved 50 ug / ml inn i åpningen av kammeret.
5. Bruke tidsseriefunksjonen (se figur 1) i konfokal mikroskop programvare for å fange video i sanntid opptakene av plasmin lyse blodpropp.
   1. Klikk oppkjøpsmodus og deretter velge "Time-serien." Velg antall sykluser og opptakstidsintervall.

5. Beregning fibrinolyse priser

1. Bestem lysehastigheten ved å sette et område (2500 mikrometer ²⁾ og beregning av medgått tid som kreves for å oppløse et fast område av blodpropp. Beregn lyse hastighet ved hjelp av følgende ligning (figur 2):
   

6. Statistisk analyse av fibrinolyse priser

1. Analysere lyse data ved hjelp av statistisk analyse programvare. Utfør en enveis ANOVA og post hoc Tukey-Kramer test ^44,45.

Representative Results

Konfokalmikroskopi Analyse av glykosylert fibrinkoagel Structures

De Konfokalmikroskopi bilder av normale og glykerte blodpropper er presentert i figur 3. Konfokalmikroskopi analyse av de normale og glykerte blodpropper avslører at glykerte blodpropper er tettere med mindre porer enn de normale klumper både med og uten tilsetning av FXIIIa under koagel polymerisasjon. I figur 3A og 3B, er det en lavere konsentrasjon fibrin som skapte en mindre tett struktur enn de glykerte blodpropper med høyere fibrin konsentrasjon (figurene 3C og 3D).

Den større tetthet observert (antall fibre pr arealenhet) i de glykerte blodpropper er et resultat av den økte fibrinogen-konsentrasjon som forekommer hos mennesker med diabetes. I de normale klumper, fibrin fibrene var mer lineær og dannet lengre fibre ved polymerisasjon med FXIIIa, somer trolig et resultat av FXIIIa danne kryssbindinger mellom fibrene. I tilfelle av de glykerte blodpropper, fibrene syntes å være kortere, selv med tilsetning av FXIIIa. Dette er sannsynligvis et resultat av den polymerisasjonsprosess som ble endret på grunn av tilstedeværelsen av glykerte regioner på fibrinogen molekylet. I tillegg, fra analyse av figur 3, er det sannsynlig at fibertykkelsen ble også redusert som følge av glykering, noe som sannsynligvis grunnen til den fluorescens fra de glykerte fibre ser ut til å ha en lavere intensitet.

Konfokalmikroskopi Analyse av fibrinkoageler Inneholder RBC fra Sickle Cell Pasienter

De konfokale mikroskop-bilder av fibrinkoagel strukturen av klumper med normal og RBC-er fra sigdcelle pasienter er presentert i figur 4. Som forutsagt, de konfokale bilder av fibrinkoageler inneholder RBC fra sigdcelle pasientene hadde tettere struktur enn de av sunn fibrin cmassevis. 4A viser en homogen fordeling av fibrin og normale RBC. Imidlertid, på figur 4B er det klumper av fibrin og hulrom hvor det ikke fibrin-nettverk dannes. RBC fra sigdcelle pasienter ble ikke homogent spredt, men heller ble innebygd i fibrin klumper. Den økede tetthet (antall fibre pr arealenhet) var et resultat av den økte fibrinogen-konsentrasjon som oppstår som et resultat av hyperkoagulasjon i SCD-pasienter. Videre er den naturlige tendens av RBC fra sigdcelle pasienter for å danne aggregater skapt klumper av RBC-er som ble sammenvevet i fibrin-nettverket. Dette resulterte i dannelsen av aberrante clot strukturer som er markant forskjellig i morfologi enn de hos normale pasienter. Fra figur 4B, er det observert at RBC fra sigdcelle pasienter forårsaket større heterogenitet i fibrin prøven, og også forårsaket en større romlig fordeling av RBC i fibrin prøven, når comlignet med de sunne fibrinkoageler med normale RBC. I motsetning til dette, den sunne fibrinkoageler med normale RBC-er vist en mer homogen dispersjon av celler i hele fibrin-nettverket.

Det er ikke kjent hvor mye HbS (sigd hemoglobin) ble polymerisert på erytrocytter fra pasienter med sigdcelle og inneholdes i prøvene. Det som er kjent, er imidlertid at nærværet av en hvilken som helst mengde av HbS forårsaker større aggregering av celler i antall HBs molekyler per volumenhet sammenlignet med normale HbA molekyler. Pan et al. ⁴⁶ har vist dette fenomenet i en studie der de sammenlignet aggregering / clustering effekter av deoksv-HbS, og, for sammenligning av oksygen-HbS og oxy-normal voksen hemoglobin, HbA. Klynger dannet i løpet av få sekunder etter løsning forberedelse og deres størrelser og tall holdt seg relativt stabil i opptil tre timer. En av konklusjonene fra studien var at begge oksygen-HBs og deoksv-HBs molekyler gruppert på et høyere tall hietmangfold enn oksygen-HbA (normal) molekyler som funksjon av temperatur. Med hensyn til denne studien, betyr dette at RBC fra sigdcelle pasientene var trolig virker sammen, og fanget fibrin som det ble polymerisert fra fibrinogen-forløperen.

Konfokalmikroskopi Lysis Valuta Analyse av Normal og glykosylert Propper

Det ble antatt at disse fibrinolysis prisene ville være større for normale fibrinkoageler forhold til glykerte fibrinkoageler med redusert plasmin konsentrasjon. For å teste denne hypotesen, ble konfokalmikroskopi brukes til å vurdere de lyse priser av fibrinkoageler med tillegg av plasmin. Den gjennomsnittlige (midlere) lysehastigheter på normal fibrin ved tilsetning av 200 ug / ml plasmin var 43,2 ± 26,5 nm ² / sek, og de ​​gjennomsnittlige (gjennomsnittlig) lyseringshastigheter på glykert fibrin med tilsetning av 200 ug / ml av plasmin ble 29.7 ± 11.2 mikrometer ² / sek. For det glykerte fibrinkoagel lysert med50 ug / ml plasmin, gjennomsnittlig lyseringshastigheten var 12,8 ± 3,1 um ² / se. Totalt 10 prøver hver (30 prøver) ble anvendt for å bestemme den gjennomsnittlige verdier og standardavvik. Disse verdiene er vist i figur 5. Ble en p-verdi på 0,05 brukes til å bestemme signifikans mellom de uavhengige forsøksgrupper. Analyse av fibrinolyse prisene vist at verdien for den normale klumper sammenlignet med de glykerte (simulerte diabetiske) propper med redusert plasmin var signifikant forskjellig.

Figur 1. Eksempel på skjermbilde fra konfokal mikroskop programvare detaljering metode for å skaffe sanntid, kontinuerlig avbildning av fibrinkoagel lyse. Klikk her for å se en større versjon av this skikkelse.

Figur 2. Eksempel konfokalmikroskoper bilde med fast område som brukes til å beregne lyse rate av fibrinkoagel prøven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Confocal bilder av sunne og glykerte (diabetiker) fibrinkoageler. Grønn fluorescens representerer fibrin nettverk. Den unglycated fibrin representerer propper som dannes hos friske pasienter, mens glycated fibrin representerer propper som dannes hos diabetespasienter. (A) Unglycated fibrin uten tilsetning av FXIIIa. (B) Unglycated fibrin med FXIIIa. (C (D) glykosylert fibrin med FXIIIa. Den røde skala linjen viser 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Confocal bilder av sunne fibrinkoageler med normale RBC og fibrinkoageler med RBC fra sigdcelle pasienter. Grønn fluorescens representerer fibrin nettverk og magenta representerer merket sunn og RBC fra sigdcelle pasienter. (A) Sunn RBC i normal fibrin konsentrasjon med FXIIIa og (B) Økt fibrin med FXIIIa og RBC fra en sigdcelle pasient. Den hvite skala linjen viser 50 mikrometer. De hvite sirklene i bildet (B) indikerer gjenkjennelige sickled RBC.

Figur 5. fibrinolyse priser av normale fibrinkoageler forhold til glykosylert (diabetiker) fibrinkoageler og glykerte klumper med redusert plasmin konsentrasjon. Statistisk signifikans ble fastsatt på grunnlag av en enveis ANOVA og post hoc Tukey-Kramer multippel sammenligningstest. ANOVA-analysen viste at det var en signifikant forskjell mellom lyse rente betyr. Den Tukey-Kramer test viste at det var en signifikant forskjell i middel mellom de normale propper og klumper med redusert plasmin med en p <0,05. * Viser en signifikant forskjell fra normale blodpropper.

Discussion

For å oppnå meningsfylte data om strukturen av clotting mekanismer i sykdomstilstander, er det viktig å isolere de faktorer som er involvert i koagulering for å bestemme effekten av proteiner og celler i disse tilstandene. Denne protokollen ble utviklet for det formål å undersøke strukturen av fibrinklump i diabetiske og SCD tilstander in vitro.

Det er nødvendig å forstå mekanismene som er involvert i fibrindannelse og fibrinolyse i sykdomstilstander siden endrede betingelser forårsake hyperkoagulasjon, aterotrombose, og CVD. Fra de konfokale bilder som oppnås i dette forsøk, er det åpenbart at hyperkoagulasjon aktivitet forekommer hos pasienter med og SCD tilstander, som bevirker en øket konsentrasjon av fibrinogen. En økt fibrinogenkonsentrasjonen resulterer i en tettere fibrin-nettverk med flere forgreningspunkter og mindre porer gjennom hele nettverket. I fibrin nettverk av SCD pasienter, er ikke bare der mer fibrin stede, but aggregering natur av erytrocytter fra pasienter med sigdcelle også endrer strukturen av nettverket som det entraps fibrin i klynger. Den konglomerat av RBC fra pasienter med sigdcelle også reduserer porøsiteten av fibrin klynger i nettverket, men synes å øke void konsentrasjonen i den totale nettverket. Resultatene av fibrinolyse analyse av glykerte blodpropper støtter hypotesen av lysehastigheten i glykerte blodpropper er lavere med redusert plasmin enn for friske, normale klumper. Men gjorde ikke resultatene gi avgjørende bevis om lyse priser av glykerte propper med normale konsentrasjoner av plasmin. Således kan det konkluderes med at for diabetiske pasienter med normal plasmin konsentrasjon, kan det være tilstrekkelig fibrinolyse aktivitet for å nedbryte fibrinkoageler på en effektiv måte.

For de eksperimenter som er utført i denne studie, ble isolerte proteiner og RBC-er i bruk, i stedet for helt blod og plasma. Ved å brukeseparerte proteiner til å syntetisere fibrinkoageler, kan årsakene til endrede strukturer mellom den normale vs. syke propper bestemmes. Denne sterkt redusert muligheten for å ha andre plasmaproteiner påvirker strukturen og morfologien til de fibrinkoageler. Imidlertid, ved hjelp av isolerte proteiner, er det avgjørende å lagre og håndtere celler og proteiner korrekt, ettersom de er mer utsatt for celledød og proteinnedbrytingen.

Den konfokal mikrosavbildningsteknikk som er valgt for dette studiet var på grunn av evnen til å oppnå bilder av fibrinkoagel strukturer samtidig som de naturlige trombotiske egenskaper av celler og proteiner. Konfokal mikroskopi har også vist seg å gi bedre kontrast og optisk oppløsning av prøven med redusert støy sammenlignet med vanlig lys microcopy. Laserlyset blir ledet inn i et pinhole som blokkerer ufokusert lys fra å komme inn. Utnyttelse av konfokal mikroskopi unngås behovet fortillegg av festing kjemikalier; således celler og proteiner var i stand til å opprettholde sin naturlige proteinaktivitet for dannelse av fibrin-clots. Som et resultat av celler, proteiner og enzymer fungert i sin opprinnelige tilstand, som tillater bruk av konfokal mikroskopi for å ta bilder og video i sanntid aktivitet. Med konfokalmikroskopi, ble 3D-bilder av fibrinkoageler fanget og videoer av plasmin fordøyelsen av fibrinkoageler ble oppnådd i sanntid. Ved tilsetning av plasmin til koagulere for å fange opp en tidsserievideo av koagel-lysis prosessen, var det viktig å bruke kapillærvirkning via plasmin å homogent dispergere enzymet gjennom fibrin-matrise. Dette ble gjort for å sikre at den tilsatte plasmin konsentrasjonen var korrekt og tillater enzymet å lysere hele koagulere, i motsetning til det lokale området at plasmin ble tilsatt.

Fremgangsmåten og resultatene som ble oppnådd i denne studien var lik en studie utført av Dunn et al, som fant at koagel-lysisvar signifikant lavere hos diabetes fag enn kontrollpersoner ^25. I begge studiene var det signifikante forskjeller i lyse forekomst av diabetes (glykosylert) propper; kan imidlertid gjeldende protokollen nøyaktig representerer diabetiske tilstander på grunn av de reduserte plasmin nivåer. I tillegg, i denne forskningsstudien fibrinolyse ble fanget kontinuerlig i sanntid ved hjelp av konfokal mikroskop, i motsetning til å analysere diskrete seksjoner på ulike tidsintervaller. Wooton et al. ⁴⁷ har undersøkt fibrinkoagel lyse og ansatt en lyse foran hastighet (cm / s) for å undersøke frekvensen av lyse for blodpropp. De brukte konfokalmikroskoper bildeanalyse i sin studie for å bestemme fram hastighet. I denne studien, i stedet for et lysehastigheten foran, ble et lyseområdet hastighet brukes (på grunn av måten bildet ble analysert på konfokal). For ytterligere å validere metoden utviklet i vår studie, har forfatterne i ⁴⁸ beskrev en matematisk modell av fibrin koagel-lysis ved plasmin, hvori de fore lysis foran hastigheten som en funksjon av den effektive hastighetskonstant på fibrinolyse. Ligningen er gitt ved:

Her, representerer den effektive hastighetskonstant på fibrinolyse, K er _en konstant adsorpsjon, C _pm er plasmin konsentrasjon, og ρ _Fn er tettheten av fibrin. Hvis den målte mengde (Målt fra konfokal analysen i denne studien) benyttes og kjede regelen anvendes, fører dette til:

t "> Antar bare én dimensjon er i endring per tidsenhet fører til:

Således effektiv hastighetskonstant på fibrinolyse for forsøket fører til:

Dette forholdet konkluderer at den effektive rente konstant av fibrinolyse ( ) Er en funksjon av plasmin konsentrasjon (C _pm) og området lysehastigheten .

Denne teknikken er også viktig for studiet av trombose iSCD pasienter, siden det er lite kjent om fibrin og clotting mekanismer med hensyn til denne sykdommen. Det har vært svært få studier på effekten av SCD på strukturen i fibrinkoageler; dermed konfokale bilder hentet fra denne studien gir sjelden visualisering av blodpropp struktur med innlemmet sickled RBC.

Å sammenligne forskjellene i midler mellom grupper, bruker du en enveis ANOVA og post hoc Tukey-Kramer test. En en-veis ANOVA er en statistisk test benyttet for å bestemme en statistisk signifikant forskjell i innretningen mellom uavhengige grupper. Den Tukey-Kramer post-testen brukes til å sammenligne midler fra hver uavhengig gruppe og finne ut hvilke gruppers midler er statistisk forskjellig fra hverandre. Før du utfører en enveis ANOVA, er det seks forutsetninger som må oppfylles for å sikre at resultatene er gyldige. De seks forutsetninger er: en kontinuerlig avhengig variabel (lyse rate), en uavhengig variagjengelig som består av to eller flere uavhengige kategoriske grupper (normale, glykosylert, og glykosylert med redusert plasmin), og uavhengig av hverandre observerte data i hver gruppe slik at en hendelse som finner sted, påvirker ikke en annen hendelse (Dette sikrer at det ikke er noen overlapping i dataene.) , datasettet ikke inneholder noen vesentlige uteliggere, normalfordelt data verifisert av Shapiro-Wilk statistisk test, og homogenitet av avvik i dataene verifisert av Levene statistisk test. Når disse forutsetninger er oppfylt, ble en enveis ANOVA og en post hoc Tukey-Kramer test utført med en p-verdi på 0,05 som en terskel for å bestemme statistisk signifikans. For en streng detalj av enveis ANOVA og post-hoc Tukey-Kramer testen, se ^44,45.

Samlet gir denne metoden for avbildning av normale og unormale (på grunn av syke tilstander) fibrinkoageler i sitt eget land. Fremgangsmåten gir også informasjon for sanntids avbildning av koagel-lysis så velsom statistisk analyse av lyse priser. Den enkle som tromben kan produseres og avbildes in vitro er nyttig for et bredt spekter av applikasjoner i mobilnettet og tissue engineering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate	Molecular Probes	F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-120
Glucose powder	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Confocal Microscope	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Statistical Modeling Software	IBM	SPSS Statistics 22