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Medicine

정상과 병에 걸린 미국에서 혈병 구조를 조사하기위한 실험 및 이미징 기술

doi: 10.3791/52019 Published: April 1, 2015

Introduction

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혈관의 내피 라이닝 부상은 지혈 반응, 또는 혈전 형성을 통해 복구된다. 혈액 세포 외 매트릭스에 침투 할 때, 조직 인자는 응고 캐스케이드의 개시를 촉진 혈류 혈소판 활성화. 이 치유 과정의 핵심 요소는 기계적 고탄성 아르 피브린 섬유로 구성된 피브린 매트릭스이며, 큰 힘을 견딜 수있는 1-4. 많은 연구자들은 광범위 지난 수십 5-13 피브린의 형성 구조 및 기능을 연구 하였다.

예컨대 당뇨병 및 겸상 적혈구 질환 등 환자는 심근 경색, 허혈성 심질환 등의 혈전 성 합병증의 발병 위험이 증가하고, 14 ~ 19 스트로크. 2 백만 명 이상의 사람들이 새로 미국에서 매년 당뇨병으로 진단된다. 유형 I 여기서, : 두 가지 형태가있다몸은 몸이 인슐린에 저항하게 인슐린 및 유형 II, 충분한 양을 생산하는 데 실패합니다. 당뇨병 환자 중, 심혈관 질환 (CVD)는 질병 (20, 21)과 관련된 이환율과 사망율 80 %의 원인이다.

겸상 적혈구 질환 (SCD)는 미국 22 개 이상 십만명에 영향을 미치는 유전 적 혈액 질환이다. SCD 어려운 세포가 혈액 맥관 구조 (23)를 통과하도록하기 위해, 초승달 모양 될 적혈구 발생 점 돌연변이 질환이다. 이들 질환 상태는 모두 몸에서 죽상 조건을 개발할 가능성을 증가시킨다. 이에 대한 이유 중 하나는 병에 걸린 상태에서 변경 14,24-26 피브린의 구조와 기능의 결과이다.

모두 당뇨병과 겸상 적혈구 질환에서 hypercoagulation 및 죽상 혈전증과 심혈관 질환을 유발 hypofibrinolysis 활동 (C가있다VD) 건강한 환자에 비해 17,27,28. 이 hypofibrinolysis이 죽상 동맥 경화증의 진행을 촉진하고 조기 관상 동맥 질환 29 환자 재발 허혈성 이벤트를 낳는다 것으로 알려져있다. 현재 원고에서, 우리는이 특정 설정에 섬유소 물리적 특성의 역할을 조사했다. 비 병든 환자 혈병 구조는 얇은 섬유, 큰 모공, 일반적으로 밀도가 낮은 (14, 24)로 구성된다. 건강한 환자에서 증가 된 다공성 및 저밀도 피브린 혈병 16은 섬유소 용해를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 당뇨 및 겸상 적혈구 질환 hyperthrombotic 조건에서, 건강한 환자들 30-33에서 2.5 ㎎ / ㎖의 정상 수준에서 증가하는 피브리노겐 농도를 일으키는 피브리노겐 생산의 증가가있다. 건강한 비 DIA에 비해 당뇨병 환자에 형성된 피브린 혈병 더 분기점을 가지고, 밀도, 더 강성, 다공성이 덜한 것으로 밝혀졌다betic 환자 14,24,33-35. 변형 구조는 피브린 응괴 형성에 관여하는 단백질 당화 발생 메커니즘의 결과이다. 포도당 분자가 적절하게 가교 글루타민 리신 잔기 33,36,37에서 인간 인자 XIIIa에 (FXIIIa)를 억제 피브리노겐 분자에 리신 잔기에 결합 할 때 비 효소 (비가역) 당화 발생한다.

피브린 네트워크의 구조 분석은 최근 광범위하게 연구되어왔다. 특히, 연구자들은 전자 현미경과 혈관 (내피) 세포와 혈관 외 (섬유 아 세포 및 평활근) 모두 세포는 섬유소 구조 (40)를 분석하는 섬유소 구조 (39), 이용 점탄성과 스펙트럼 분석에 미치는 영향을 조사 섬유소 네트워크 (38)의 차원 복원 등을 활용 한 피브린 구조 및 기계적 특성 간의 상관 관계를 실험 개발하여 전산 41 접근 체외 피브리노겐 당화를 유도하기 위해 포도당 용액에서 배양 하였다. 겸상 적혈구 질환 응고 조건을 시뮬레이션하기 위해 증가 피브리노겐 농도는 우리 그룹 (42)에 의해 이전에 수행으로 환자로부터 수집 겸상 적혈구 용적률과 혼합 하였다. 이러한 방법은 질병 및 구조 조건 하에서 피브린 응괴 형성 및 섬유소 용해에 관여하는 기능뿐만 아니라, CVD 유도 메커니즘을 조사 하였다. 이들 질환에 대한 현재 정보에 기초하여, 당화 피브린 응고 구조는 적은 밀도로했다ND 작은 구멍. 겸상 적혈구 환자 (적혈구)에서 적혈구와 섬유소 혈전은 밀도가 있었고, 적혈구의 응집과 응집 섬유소 클러스터를 표시. 이것은 이전에 43 결정된 노포 현상이다. 또한 섬유소 레이트와 건강한 정상 피브린에 비해 감소 플라스없이 당화 피브린 혈병에 훨씬 낮은 것이라고 가정 하였다. 결과는 당화 피브린 혈병 대해 상당히 상이한 용해 속도 결과 만 감소 플라스 농도 조건 하에서 관찰 된 것으로 나타났다. 세포 및 단백질이 응고 활성의 실시간 비디오의 캡처를 가능하게 그 나라의 상태로 남아 있기 때문에, 공 초점 현미경을 사용하여이 실험은 다른 이미징 기술의 방법들에 비해 현저한 장점들을 제공한다. 합성 유도부 응고이 방법은 환자의 샘플을 획득하고 개인을 필터링 또한보다 저렴하고 더 시간 효율적인단백질과 효소. 샘플 간의 변이성은 다른 혈장 단백질의 결과로서 없었다되도록 또한 혈전을 합성 분리 된 단백질 및 효소를 사용하여, 혈전 표준화 하였다.

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Protocol

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참고 : 다음 프로토콜은 조지아 공대에서 임상 시험 심사위원회 (IRB)가 설정 한 가이드 라인을 준수합니다.

1. 혈액 수집 및 적혈구 격리 절차

  1. 10 ml의 헤파린 vacutainer 튜브에 기증자의 혈액의 40 ~ 120 ml의를 수집합니다. 컬렉션의 4 시간 이내에 PBMC (말초 혈액 단핵 세포) 분리를 시작합니다. 이 시간 동안 실온에서 혈액을 유지합니다.
    참고 :이 낮은 PBMC 수율 발생합니다으로 RT 또는 4 ° C에서 혈액의 O / N 저장하지 않는 것이 좋습니다.
  2. 전혈 1을 희석 : 1을 얼음처럼 차가운 (4 ° C) 멸균 PBS에.
  3. 피펫 빈, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 얼음처럼 차가운 친수성 ​​폴리 사카 라이드 10 ㎖. 조심스럽게 친수성 ​​폴리 사카 라이드의 상단에 희석 전체 혈액을 전송합니다.
  4. 아주 천천히 튜브의 측면을 따라 느린 설정과 피펫 혈액 25ml를 피펫을 사용합니다. 혈액 센트리하기 전에 당과 혼합되지 않았는지 확인친수성 폴리 사카 라이드는 달리 세포에 독성이 fugation 때문에, PBMC 수율이 낮은 것입니다.
  5. 4 ° C에서 400 XG에 30 분 동안 원심 분리기 혈액 샘플. 가능한 경우, 원심 분리 후 더 나은 분리를 위해 최대의 절반에 원심 분리기의 브레이크 속도를 줄일 수 있습니다.
  6. 원심 분리 된 혈액 시료의 혈장 / 혈소판 분획 대기음. 조심스럽게 직접 포장 RBC 레이어 위에 친수성 ​​폴리 사카 라이드 층을 대기음.
  7. 포장 된 적혈구의 8 ~ 10 ml의 수집 및 1 희석 : unsterile 0.9 % 염화나트륨 식염수로 1.

2. 공 초점 현미경 평가 당화의 응고 구조 (시뮬레이션 당뇨병 혈전)

  1. 37 ° C에서 인간 피브리노겐과 형광 표지 된 인간 피브리노겐 접합체를 해동.
  2. 피펫 0.5 ml의에 다음은 마이크로 원심 튜브를 졸업했다.
    1. 건강한 정상 피브리노겐 응고를 들어, 10 % 형광 표지 된 인간 피브리노겐과 인간 피브리노겐을 혼합5 mg / ml의 농도로 50 mM 트리스 / 100 mM의 NaCl을 완충액 접합체.
    2. 인위적 당화 피브리노겐 들어, (당뇨병 응고 시뮬레이션) 6.8 ㎎ / ㎖의 생성 된 농도 50mM 트리스 / 100 mM의 염화나트륨에 용해 글루코스 5mM의 용액에 인간 피브리노겐과 10 %의 형광 표지 된 피브리노겐 공액 부화.
  3. 빛에 대한 노출을 피하기 위해 불투명 재료를 사용하는 마이크로 원심 분리기 튜브 커버. 48 시간 동안 37 ° C의 물을 용기에 튜브를 부화.
  4. 슬라이드의 2면에 얇은 접착제를 부착하여 유리 현미경 슬라이드에 실을 확인합니다.
  5. 48 시간의 잠복기 후, RT에서 FXIIIa과 인간의 알파 트롬빈을 해동하여 섬유소 형성을위한 시약을 준비합니다.
  6. 5 mM의 염화칼슘이 버퍼에 80 U / ㎖로 FXIIIa을 희석.
  7. 5 mM의 염화칼슘이 버퍼에 4 U / ml의 트롬빈을 희석.
    1. 정상 응고를 들어, 피브리노겐, FXIIIa, 트롬빈​​의 최종 농도가 2.5 m 있는지 확인g / ㎖, 20 U / ㎖, 각각 50 μL의 부피로 1 U / ㎖,.
    2. 당화 혈전를 들어, 피브리노겐, FXIIIa, 트롬빈​​의 최종 농도가 각각 50 μL의 볼륨, 3.4 ㎎ / ㎖, 20 U / ㎖, 1 U / ㎖되어 있는지 확인하십시오.
  8. 즉시 접착제에 의해 형성된 챔버 내에 피브린 용액 30 μL 피펫.
  9. 접착제의 2 층의 상단에 0.15 mm의 두께가 22mm X 22mm 유리 커버 슬립을 놓습니다. 마르지 섬유소 혈전을 방지하기 위해 투명 접착제로 열린 측면 인감. 접착제가 섬유소 응고와 상호 작용하지 않도록하십시오.
  10. 섬유소 혈전 공 초점 이미징 전에 2 시간 동안 21 ~ 23 ° C에서 중합 할 수 있습니다.
  11. 488 nm의 아르곤 레이저 40X / 1.30 오일 M27 렌즈를 공 초점 현미경을 이용하여 혈전의 공 초점 현미경 이미지를 가져 가라.

겸상 적혈구 환자에서 적혈구를 포함하는 섬유소 혈전의 3 공 초점 현미경 평가

  1. 37 ° C에서 인간 피브리노겐과 형광 표지 된 인간 피브리노겐 접합체를 해동.
  2. 피펫 0.5 ml의에 다음은 마이크로 원심 튜브를 졸업했다.
    1. 건강한 정상 피브린 응괴를 들어, 5 mg / ml의 농도로 50 mM 트리스 / 100 mM의 NaCl을 완충액에 10 %의 형광 표지 된 인간 피브리노겐 공액 인간 피브리노겐 섞는다.
    2. SCD 적혈구를 함유하는 혈전의 경우, 피브리노겐 농도가 얻어진 10 ㎎ / ㎖로되어 50mM 트리스 / 100 mM의 NaCl을 예컨대 인간 피브리노겐과 10 %의 인간 피브리노겐 형광 표지 된 복합체를 혼합한다.
  3. 세포 표지 용액을 사용하여 격리 된 적혈구 (RBC 정상 및 분리 프로토콜로부터 얻어진 겸상 적혈구 환자에서 그 모두) 라벨.
    1. 선택된 임의의 무 혈청 배지에서 1 ㎖ 당 1 × 106의 밀도로 세포를 일시.
    2. 세포 표지 용액에 세포 현탁액의 5 μL / ㎖를 추가한다. 부드러운 피펫으로 잘 부드럽게 섞는다.
    3. 37 ° C에서 5 분 동안 1,500 rpm으로 표지 된 현탁액을 원심 튜브.
    4. 37 ° C 배지에서 세포를 다시 일시 부드럽게 상등액을 제거하고.
    5. 세척 절차 (3.3.4과 3.3.5)을 두 번 더 반복합니다.
  4. 5 mM의 염화칼슘이 버퍼에 80 U / ㎖로 FXIIIa을 희석.
  5. 5 mM의 염화칼슘이 버퍼에 4 U / ml의 트롬빈을 희석.
    1. 정상 응고를 들어, 피브리노겐, FXIIIa, 트롬빈​​의 최종 농도가 각각 50 μL의 볼륨, 2.5 ㎎ / ㎖, 20 U / ㎖, 1 U / ㎖되어 있는지 확인하십시오.
    2. SCD 적혈구를 포함하는 혈전의 경우, 피브리노겐, FXIIIa, 트롬빈​​의 최종 농도가 각각 50 μL의 볼륨, 5 ㎎ / ㎖, 20 U / ㎖, 1 U / ㎖되어 있는지 확인하십시오.
  6. 피펫 섬유소 용액에 표시된 적혈구의 10 μL. 피펫 현미경 유리 위에 적혈구와 섬유소의 30 μL (GL 준비를 밀어 참조ycated 혈전).
  7. 섬유소가 공 초점 이미징 전에 2 시간 동안 21 ~ 23 ° C에서 중합 할 수 있습니다.
  8. 공 초점 현미경을 이용하여 혈전의 공 촛점 이미지를 가지고, 형광 표지 된 섬유소와 적혈구를 자극하는 488 nm에서 633 nm의 파장으로 여기 레이저를 사용한다.

당화 응고 구조의 섬유소 용해 요금 4. 공 초점 현미경 평가

  1. 당화 혈전의 섬유소 용해 속도 평가를위한 당화 혈전 (프로토콜 2 단계)의 공 초점 현미경 프로토콜을 반복합니다.
  2. 투명 접착제로 챔버의 끝을 밀봉하지 마십시오. 피브린 혈병 탈수를 방지하기 위해 250 ml의 물을 함유하는 밀봉 된 인클로저에 21-23 ℃에서 1.5 시간 동안 중합하도록 허용.
  3. 중합 종료 후, 공 초점 현미경을 사용하여 응고 화상을 얻었다.
  4. 피펫 챔버의 개방 단부로 플라스 민과는 모세관 작용을 통해 응고 통해 플라스를 분산.
    1. 용정상적인 농도 피펫 챔버의 개구에 플라스 200 ㎍ / ml의 25 μL와 정상 및 당화 섬유소 용해 실험.
    2. 감소 된 농도 피펫 챔버의 개구에 50 ㎍ / ml의 25 μL와 당화 혈전 용.
  5. 혈전을 용해하는 플라스의 실시간 비디오 영상을 캡처하는 공 초점 현미경 소프트웨어의 시계열 기능 (그림 1 참조)를 사용합니다.
    1. 획득 모드를 클릭 한 다음 선택 "시계열을."사이클의 수와 녹화 시간 간격을 선택합니다.

5. 섬유소 용해 요금을 계산

  1. 응고의 고정 영역을 용해하는 데 필요한 경과 시간을 영역 (2500 2 ㎛)를 설정하고 계산함으로써 용해 속도를 결정. 이하의 식 (도 2)를 사용하여 용해 속도를 계산한다 :
    식 (1)

섬유소 용해 요금 6. 통계 분석

  1. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 용해 된 데이터를 분석한다. 단방향 ANOVA 및 특별 Tukey의-크레이머 시험 44,45 게시물을 수행합니다.

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Representative Results

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당화 섬유소 응고 구조의 공 초점 현미경 분석

정상 및 당화 혈전의 공 초점 현미경 이미지. 그림 3에 제시되어있다 정상 및 당화 혈전의 공 초점 현미경 분석 당화 혈전 밀도와 혈전 중합 동안 FXIIIa의 첨가없이 모두 정상 혈전보다 작은 구멍을 가진 것을 알 수있다. 그림 3a 및도 3b에서, 더 높은 섬유소 농도 (그림 3C3D)와 당화 혈전보다 밀도가 낮은 구조를 만들어 낮은 섬유소 농도가있다.

당화에서 관찰되는 혈전 큰 밀도 (단위 면적당 섬유의 수)은 당뇨병 환자에서 발생 피브리노겐 농도 증가의 결과이다. 정상 혈전에서는 섬유소 더 선형이었고 FXIIIa, 중합시에 더 긴 섬유를 형성하는아마 섬유 간의 가교를 형성 FXIIIa의 결과이다. 당화 혈전의 경우, 섬유도 첨가 FXIIIa으로 짧은 것으로 나타났다. 이러한 가능성 때문에 피브리노겐 분자상의 당화 영역의 존재로 변경된 중합 공정의 결과이다. 또한,도 3의 분석에서, 그것은 아마 섬유 두께는 또한 당화 섬유에 낮은 형광 강도를 가질 가능성이 나타나는 이유 당화의 결과로 감소되었음을이다.

겸상 적혈구 환자에서 적혈구를 포함하는 섬유소 혈전의 공 초점 현미경 분석

겸상 적혈구 환자의 정상과 혈전 및 적혈구의 섬유소 응고 구조의 공 초점 현미경 이미지는 그림 4에 제시되어있다. 예측 된 바와 같이, 겸상 적혈구 환자에서 적혈구가 들어있는 섬유소 혈전의 공 초점 이미지 건강 섬유소 C의 것보다 더 조밀 한 구조를 가지고 있었다많이. 그림 4a는 섬유소 정상 적혈구의 균일 한 분포를 보여줍니다. 그러나,도 4b에서 더 피브린 네트워크가 형성되지 않는 섬유소 덩어리 보이드가있다. 겸상 적혈구 환자가 균일하게 분산되지 않은, 오히려 섬유소 덩어리에 매설 하였다. 증가 된 밀도 (단위 면적당 섬유의 수)는 환자에서 SCD hypercoagulation의 결과로 발생 피브리노겐 농도 증가의 결과였다. 또한, 응집체를 형성하기 위해 겸상 적혈구 환자에서 적혈구의 자연적인 경향은 섬유소 네트워크로 짜여진되었다 적혈구의 덩어리를 발생시킨. 이것은 정상 환자에 비해 현저히 상이한 형태이다 비정상적인 응고 구조의 형성 결과. 도 4b로부터, 겸상 적혈구 환자의 적혈구 피브린 샘플에서 더 얼룩이 발생하고 또한 피브린 샘플에서 적혈구의 넓은 공간 분포를 일으킨 것으로 관찰 될 때 COM정상 적혈구와 건강한 섬유소 혈전을 깎았 다. 반면, 정상 적혈구와 건강한 섬유소 혈전은 섬유소 네트워크를 통해 세포의보다 균일 한 분산을 표시.

많은 HBS (겸상 헤모글로빈) 겸상 적혈구 환자의 적혈구에서 중합하고 샘플에 포함하는 방법을 알 수 없습니다. 알려진 그러나 HBS 임의 양의 존재가 정상 당화 대 분자 단위 부피당 HBS 분자의 수가 더 큰 세포 응집을 유발한다는 것이다. 팬 등. (46) 옥시 HBS 및 옥시 정상 성인 헤모글로빈, 당화의 비교를 위해, 그들은 옥시 HBS의 집계 / 클러스터링 효과를 비교 한 연구에서이 현상을 증명하고있다. 용액 제제 및 그 크기와 숫자 후 몇 초 내에 형성 클러스터는 3 시간까지 비교적 안정적 남았다. 연구의 결론 중 하나는 두 옥시 HBS 및 옥시 HBS 분자가 더 많은 수의 서재에서 클러스터이었다온도의 함수로 산소 - 당화 (정상) 분자보다 SITY. 본 연구에 관한이 겸상 적혈구 환자에서 적혈구가 함께 클러스터 가능성이 있었고,이 피브리노겐 전구체로부터 중합이되면서 섬유소 갇혀 있다는 것을 의미한다.

일반 및 당화 혈전의 공 초점 현미경 용해 속도 분석

그것은 섬유소 용해 속도가 플라스 민 농도 감소와 당화 섬유소 혈전에 비해 정상 섬유소 혈전에 대한 더 클 것이라고 가정했다. 이 가설을 시험하기 위해, 공 초점 현미경의 플라스 민은 피브린 첨가 혈전의 용해 속도를 평가하는데 사용 하였다. 평균 (평균) 플라스 200 μg의 / ㎖ 첨가 정상 피브린 용해 속도는 43.2 ± 2 / 초 및 플라스 민 200 ㎍ / ml를 첨가하여 당화 피브린의 평균 (평균) 용해 속도 μm의 26.5이었다 29.7 ± 11.2 μm의 2 / 초. 에 용해 당화 섬유소 응고를 들어플라스 50 ㎍ / ㎖의, 평균의 용해 속도는 12.8 ± 3.1 ㎛의 2 / SE이었다. 각 샘플 (10) (샘플 30)의 총 평균치와 표준 편차 값을 결정하는 데 사용 하였다. 이 값은도 5에 나타낸다. 0.05 P 값은 독립적 실험군 간의 유의성을 측정 하였다. 섬유소 용해 비율의 분석 플라스 크게 달랐다 감소 된 응고에 대한 정상 값이 당화 (시뮬레이션 당뇨병) 혈병에 비해 것을 보여 주었다.

그림 1
실시간 얻기위한 방법을 자세하게 공 초점 현미경 소프트웨어에서 그림 1. 샘플 스크린 샷, 섬유소 혈전 용해의 연속 영상. 생의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오의 그림입니다.

그림 2
섬유소 혈전 샘플의 용해 속도를 계산하는 데 사용되는 고정 영역 그림 2. 예 공 초점 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 건강하고 당화 (당뇨병) 섬유소 혈전의 공 초점 이미지. 녹색 형광 섬유소 네트워크를 나타냅니다. 당화 섬유소는 당뇨병 환자에서 혈전 형성을 나타내는 반면 unglycated 섬유소는 건강한 환자에서 혈전 형성을 나타냅니다. (A) FXIIIa의 첨가없이 Unglycated 피브린. (B) FXIIIa와 Unglycated 섬유소. (C (D) FXIIIa와 당화 섬유소없이 강한>) 당화 피브린. 빨간색 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 겸상 적혈구 환자의 적혈구 정상 적혈구와 섬유소 혈전 건강 섬유소 혈전 4. 공 초점 이미지. 녹색 형광 섬유소 네트워크를 나타내며, 마젠타는 겸상 적혈구 환자의 건강하고 적혈구 표시 나타냅니다. (A) FXIIIa 정상 섬유소 농도와 겸상 적혈구 환자의 FXIIIa 및 적혈구와 (B) 증가 섬유소의 건강한 적혈구. 흰색 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이미지 (B)의 흰색 원은 인식 겸상 적혈구를 나타냅니다.

그림 5
그림 당화 (당뇨병) 섬유소 혈전 감소 플라스 민 농도와 당화 혈전에 비해 정상 섬유소 혈전 5. 섬유소 용해 속도. 통계적 유의성은 일원 분산 분석 및 사후 Tukey의-Kramer의 여러 비교 테스트를 기반으로 결정되었다. ANOVA 분석은 용해 속도 수단 사이에 상당한 차이가있는 것으로 나타났다. 한 Tukey-Kramer의 시험 AP <0.05로 감소 플라스 정상적인 응고 및 응혈 수단 사이에 상당한 차이가있는 것으로 나타났다. * 정상 혈전에서 유의 한 차이를 나타냅니다.

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Discussion

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질환 상태에서 응고 메카니즘의 구조에 대한 의미있는 데이터를 얻기 위해서는, 이러한 조건에서 단백질 및 세포의 효과를 결정하기 위해 혈액 응고에 관여하는 인자를 분리하는 것이 중요하다. 이 프로토콜 및 시험 관내에서 당뇨병 상태에서 SCD 피브린 응괴의 구조를 조사하는 목적으로 개발되었다.

이는 변경된 조건 hypercoagulation, 죽상 혈전증 및 CVD 발생할 보낸 질환 상태에서 피브린 형성 및 섬유소 용해에 관여하는 메커니즘을 이해하는 것이 필요하다. 이 실험에서 얻어지는 공 초점 화상으로부터, hypercoagulation 활성이 증가 된 피브리노겐 농도를 유발 당뇨 SCD 상태에서 발생하는 것을 알 수있다. 네트워크를 통해 분기점보다 작은 기공 밀도 피브린 네트워크에서 증가 된 피브리노겐 농도를 초래한다. SCD 환자의 섬유소 네트워크에서 더 많은 섬유소 현재, BU가 아니라이 클러스터로 피브린을 entraps으로서도 네트워크의 구조를 변경 겸상 적혈구 환자의 적혈구 응집 성질을 t. 겸상 적혈구 환자의 대형화는 또한 네트워크의 피브린 클러스터의 다공성을 감소 시키지만, 전체 네트워크에 공극 농도를 증가시킬 것으로 보인다. 당화 응고 섬유소 용해 분석 결과 건강한 정상 혈전보다 감소 된 플라스 민으로 낮지 당화 혈전의 용해 속도의 가설을지지. 그러나, 결과는 플라스 정상적인 농도 당화 혈전 용해 속도에 대한 결정적인 증거를 제공하지 않았다. 따라서 정상 플라스 농도 당뇨병 환자, 효율적인 방식으로 피브린 혈병을 저하 충분한 섬유소 용해 활성이있을 수 있다는 결론을 내릴 수있다.

이 조사 연구에서 수행 된 실험을 위해, 고립 된 단백질과 적혈구 대신 전혈 및 혈장을 사용 하였다. 사용하여분리 된 단백질 섬유소 혈전을 합성, 병에 걸린 혈전 대 정상 사이의 변경된 구조에 대한 원인은 결정될 수있다. 이것은 크게 다른 혈장 단백질이 섬유소 응괴의 구조 및 형태를 갖는 방해 가능성을 감소시켰다. 이들이 세포 사멸 단백질 분해에 더욱 취약하지만, 절연 단백질을 사용함으로써, 저장하고 적절 세포 및 단백질을 처리하는 것이 중요하다.

이 연구를 위해 선택된 초점 현미경 영상 법은 세포 단백질의 천연 혈전 특성을 유지하면서 피브린 응고 구조의 이미지를 획득 할 수있는 능력 때문이었다. 공 초점 현미경은 개선 된 반면 전통적인 빛 축소 복사에 비해 감소 된 소음과 시편의 광학 해상도를 제공하는 것으로 나타났다. 레이저 광 유입을 차단 unfocused 라이트 핀홀에 관한 것이다. 공 초점 현미경의 활용에 대한 필요성을 미연에 방지정착 화학 물질의 첨가; 따라서, 세포와 단백질 피브린 응괴를 형성하는 자연 단백질 활성을 유지할 수 있었다. 결과적으로 세포, 단백질, 효소 및 실시간 활성의 이미지 및 비디오를 캡처 초점 현미경의 사용을 허용, 그 나라의 상태로 작용. 공 초점 현미경으로, 섬유소 혈전의 3D 이미지를 캡처하고 섬유소 혈전의 플라스 소화의 동영상을 실시간으로 얻을 수 있었다. 혈전 용해 공정의 시계열 비디오를 캡처 응고 플라스 민을 첨가하면 균일 피브린 매트릭스를 통해 효소를 분산시키는 플라스 통해 모세관을 사용하는 것이 중요했다. 이는 플라스 민을 첨가 농도가 정확하고 플라스 첨가 로컬 영역에 대조적으로, 전체 혈전을 용해하는 효소를 허용하도록 수행되었다.

방법이 연구에서 얻은 결과는 혈전 용해하는 결과 던 등의 문헌에 의해 수행 연구 유사했다비율은 대조군 (25)보다 당뇨병 환자에서 유의하게 낮았다. 두 연구에서 당뇨병 (당화) 혈전의 용해 속도에 유의 한 차이가 있었다; 그러나, 현재의 프로토콜 정확하게 인해 감소 된 플라스 레벨 당뇨병 상태를 나타낼 수있다. 또한이 연구 연구 섬유소 용해에 상이한 시간 간격으로 분리 된 부분을 분석 달리, 공 초점 현미경을 사용하여 실시간으로 연속적으로 촬영 하였다. 우튼 등. 47 피브린 응괴 용해를 조사 대한 혈전 용해의 비율을 조사하는 용해 전방 속도 (cm / s)을 사용 하였다. 그들은 전방 속도를 결정하기 위해 자신의 연구에 촛점 이미지 분석을 사용 하였다. 현재 연구에서, 대신에 용해 전면 속도, 용해 속도는 영역 (인해 화상을 공 초점 분석 하였다 방식)를 사용했다. 또한 본 연구에서 개발 된 방법의 유효성을 확인하기 위해, 48 저자의 수학적 모델을 설명했다 그들은 섬유소 용해의 실효 속도 상수의 함수로서 용해 속도 전면을 처방하는 플라스 민에 의한 피브린 응괴 용해. 방정식은 다음과 같이 주어진다 :
식 (2)

여기에, 식 (3) 섬유소 용해의 실효 속도 상수를 나타내고, A는 K 흡수 상수 C의 오후 플라스 농도이고, ρ는 FN 피브린의 밀도이다. 측정 량 경우 수학 식 4 (현재 연구에서 공 초점 분석에서 측정) 활용과 체인 규칙이 사용된다,이에 이르게 :
식 (5)

하나의 차원을 가정 t는 "> 시간이 리드 단위 당 변화 :

식 (6)

식 (7)

따라서 실험 섬유소 용해의 유효 속도 상수에 이르게 :
식 (8)

이 관계는 섬유소 용해의 유효 속도 상수 (유추 식 (9) ) 플라스 농도 (C의 PM) 및 면상 용해 속도의 함수이다 식 (10) .

이 기술은 혈전증의 연구에 중요하다SCD 환자 거의이 질병에 대해 피브린 응고적인 기작이 공지되기 때문이다. 섬유소 혈전의 구조에 SCD의 영향에 실시 거의 연구가 있었다; 따라서 본 연구에서 수집 된 공 초점 이미지 통합 겸상 적혈구와 응고 구조의 희귀 한 시각화를 제공합니다.

수단 군간의 차이를 비교하기 위해, 일방향 ANOVA와 Tukey의 사후 - 크레이머 시험에 사용한다. 일방향 ANOVA 독립적 군간 수단에서 통계적으로 유의 한 차이를 결정하는데 사용 통계 시험이다. 한 Tukey-Kramer의 시험 후 각 그룹에서 독립적 인 수단을 비교 및​​ 그룹 '수단은 서로 다른 통계적으로 결정하기 위해 사용된다. 일원 분산 분석을 수행하기 전에 결과가 유효한지 확인하기 위해 충족해야 여섯 가정이있다. 여섯 가정은 다음과 같습니다 연속 종속 변수 (용해 속도), 독립적 인 바리 아하나의 이벤트가 다른 이벤트에 영향을 미치지 않는다 발생되도록 각 그룹의 데이터를 관찰 독립적으로 둘 이상의 독립된 범주기로 이루어진 BLE (당화, 정규, 감소 된 플라스 민과 당화) 및 (이 데이터의 중첩이 없다는 것을 보장한다.) 어떠한 유의 한 특이점을 포함하지 않는 데이터 셋은, 일반적 샤피로 - 윌크 통계적 시험에 의해 검증 데이터 및 통계적 테스트하는 Levene 검증 데이터의 분산의 균일 분산. 이러한 가정이 충족 된 후, 일방향 ANOVA와 Tukey의 사후 - 크레이머 시험 통계적 유의성을 판정하기위한 임계 값으로 0.05 P 값으로 수행 하였다. 편도 ANOVA 및 사후 Tukey의-크레이머 시험의 엄격한 세부를 들어, 44, 45을 참조하십시오.

전반적으로,이 방법은 그 나라의 국가 정상과 (때문에 병에 걸린 상태로) 이상 섬유소 혈전의 이미징 수 있습니다. 또한,이 방법은 물론 혈전 용해의 실시간 이미징을위한 세부 사항을 제공한다용해 속도의 통계 분석 등. 혈전이 생성 및 체외에서 이미징 될 수있는 용이성은 세포 및 조직 공학의 다양한 애플리케이션에 유용하다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) GE Healthcare 45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes BD Biosciences 366643
Human Fibrinogen Enzyme Research Laboratories N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate Molecular Probes F13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tube Fisher Scientific 05-408-120
Glucose powder Life Technologies 15023-02
FXIIIa Enzyme Research Laboratories N/A
VIS Confocal Microscope Zeiss LSM 510 LSM 510
50 mM Tris Lonza S50-642
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma Aldrich 449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution Life Technologies L7781
Plasmin Enzyme Research Laboratories N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl) Life Technologies AM9759
Statistical Modeling Software IBM SPSS Statistics 22

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References

  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2, (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13, (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45 (1998).
정상과 병에 걸린 미국에서 혈병 구조를 조사하기위한 실험 및 이미징 기술
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Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. O., Averett, R. D. Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States. J. Vis. Exp. (98), e52019, doi:10.3791/52019 (2015).More

Fan, N. K., Keegan, P. M., Platt, M. O., Averett, R. D. Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States. J. Vis. Exp. (98), e52019, doi:10.3791/52019 (2015).

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