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Developmental Biology

फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति में Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52042
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 4, 1, 5, 2
1Département de Biologie du Développement et Cellules Souches, Institut Pasteur, 2Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer (UMR7009 CNRS/UPMC Univ Paris 06), Sorbonne Universités, 3Equipe Epigenetic Control of Normal and Pathological Hematopoiesis, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, 4Unité de Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR5235/DAA/cc107/Université Montpellier II, 5Plateforme BioEmergences IBiSA FBI, CNRS-NED, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard

Summary

हम Branchiostoma lanceolatum की unfertilized oocytes में यहां mRNA के इंजेक्शन के बाद फ्लोरोसेंट प्रोटीन के मजबूत और कुशल अभिव्यक्ति की रिपोर्ट। इस बेसल कोरडेट में microinjection तकनीक के विकास, इस उभरते हुए मॉडल प्रणाली में तकनीकी नवाचार दूरगामी vivo इमेजिंग और जीन विशिष्ट जोड़तोड़ में शामिल करने के लिए मार्ग प्रशस्त होगा।

Introduction

विकास के दौरान, एक एकल कोशिका कोशिका विभाजन और आंदोलनों दोनों शामिल है कि एक बेहद जटिल प्रक्रिया में एक पूरे जीव को जन्म देता है। बेहतर सेल व्यवहार की गतिशीलता अंतर्निहित जैविक सिद्धांतों को समझने की, विकासात्मक जीव के प्रतिदीप्ति आधारित vivo इमेजिंग तकनीक में उपयोग करने के लिए शुरू कर दिया है। ऐसे कोशिका झिल्ली के रूप में कोशिकाओं के विशिष्ट डिब्बों, या तो, फ्लोरोसेंट रंगों के साथ उपचार द्वारा विशिष्टता की कमी से और ऊतक पैठ एक की बाधा एक दृष्टिकोण लेबल किया जा सकता है, या फ्लोरोसेंट प्रोटीन 2 एन्कोडिंग बहिर्जात mRNAs का भ्रूण में विशिष्ट लागू होने से। विभिन्न तकनीकों ऐसे mRNAs रूप बहिर्जात यौगिकों के कुशल प्रसव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये शामिल हैं, लेकिन microinjection, इलेक्ट्रोपोरेशन, microparticles, lipofection और पारगमन 3,4 के साथ बमबारी, तक सीमित नहीं हैं। इन तरीकों के सभी एक में बहिर्जात यौगिकों को पेश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैभ्रूण के विकास, केवल microinjection के प्रत्येक कोशिका तीन में पूर्वनिर्धारित और सटीक मात्रा के आवेदन की अनुमति देता है। Microinjection तकनीक सभी प्रमुख विकासात्मक मॉडल प्रणाली के लिए वर्णित किया गया है 4 (जैसे, फल मक्खियों, निमेटोड कीड़े, zebrafish, मेंढ़क, चूहों) के रूप में अच्छी तरह से विकास तंत्र के विकास को समझने के उद्देश्य से तुलनात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया उन सहित कुछ वैकल्पिक मॉडल 4, के लिए के रूप में (उदाहरण के लिए, समुद्री एनीमोन, एनेलिड कीड़े, समुद्री अर्चिन, ascidian tunicates, cephalochordate amphioxus)।

एक साथ tunicates और कोरडेट संघ की स्थापना के रीढ़ के साथ, विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल मॉडल हैं जो Cephalochordates, Chordates के विकास और एक अकशेरुकी पूर्वज 5-8 से रीढ़ की विविधीकरण अध्ययन करने के लिए। cephalochordate वंश बहुत जल्दी कोरडेट विकास के दौरान भिन्नताएं; और तीन पीढ़ी में उप-विभाजित कर रहे हैं, जो वर्तमान cephalochordates, (चोकरchiostoma, Asymmetron और Epigonichthys), रीढ़ सदृश दोनों समग्र शारीरिक रचना और जीनोम वास्तुकला 5-8 के संदर्भ में। अब तक वर्णित किया गया है कि cephalochordates के बारे में 30 प्रजातियों में से पांच embryological और विकास अध्ययन 6,9 के लिए उपलब्ध हैं: Asymmetron lucayanum (Bahama lancelet), Branchiostoma floridae (फ्लोरिडा amphioxus), Branchiostoma lanceolatum (यूरोपीय amphioxus), Branchiostoma belcheri (चीनी amphioxus) और Branchiostoma japonicum (जापानी amphioxus)। इन प्रजातियों में से तीन की परिपक्व वयस्कों (बी lanceolatum, बी belcheri और बी japonicum) मांग पर प्रजनन के मौसम 10,11 के दौरान अंडे के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इसके अलावा, कम से कम बी के लिए lanceolatum, कुशल स्पॉन भी जिससे laborator के लिए इस विशेष cephalochordate प्रजातियों सुलभ बनाने, कृत्रिम समुद्र के पानी में 12 में प्रेरित किया जा सकता हैप्राकृतिक समुद्री जल के लिए पहुँच नहीं है कि एँ। बी में संयोजन, lanceolatum, ऐसे microinjection के रूप में एक कुशल वितरण पद्धति के साथ भ्रूण, के लिए एक सुविधाजनक और विश्वसनीय पहुँच के, अब तक 13-15, (बी floridae और बी belcheri दोनों में) amphioxus में विकसित केवल प्रसव तकनीक एक के विकास के लिए सक्षम हो जाएगा वंश tracing- और गतिशील सेल व्यवहार आधारित दृष्टिकोण सहित जोड़ तोड़ तकनीक के उपन्यास स्वीट।

MRNAs का कुशल microinjection के लिए एक प्रोटोकॉल बी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए lanceolatum भ्रूण इसलिए विकसित किया गया था। इसके अलावा, बी के रहते इमेजिंग के लिए एक बुनियादी टूलकिट प्रदान करने के लिए lanceolatum भ्रूण, वेक्टर सिस्टम झिल्ली जुड़े और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की परमाणु अभिव्यक्ति की अनुमति है कि विकसित किए गए। झिल्ली लक्ष्यीकरण के लिए, बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) mCherry और EGFP के मानव HRAS CAAX बॉक्स और परमाणु स्थानीयकरण के लिए गया था इनकार किया गया थाzebrafish हिस्टोन 2 बी (H2B) एक्सॉन (चित्रा 1, अनुपूरक फ़ाइल 1) के संलयन से प्राप्त की। इसके अलावा, प्रोटीन अनुवाद का अनुकूलन करने के लक्ष्य के साथ, निर्माणों की कोज़ाक दृश्यों और codons संशोधित किया गया है और बी में उपयोग करने के लिए अनुकूलित lanceolatum। साथ में ले ली, यहाँ प्रस्तुत इंजेक्शन विधि और अभिव्यक्ति वैक्टर विशेषकर नवीनतम vivo इमेजिंग तकनीक में प्रतिदीप्ति आधारित का उपयोग कर विश्लेषण करती है, cephalochordates के लिए नए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की पीढ़ी के लिए एक आधार के रूप में काम करेगा।

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Protocol

उपकरण और अभिकर्मकों के 1. तैयारी

  1. पाश्चर pipettes स्थानांतरण
    1. अलग गति में एक लौ से ऊपर 230 मिमी लंबे पाश्चर pipettes खींच कर अलग टिप व्यास के साथ स्थानांतरण पाश्चर pipettes की एक श्रृंखला उत्पन्न करता है। घटना आकांक्षा की चिकनी और ठीक नियंत्रण के लिए संभव के रूप में लंबे समय है कि सुनिश्चित करें।
    2. एक हीरा मुंशी के साथ, सीधा पिपेट की लंबाई के लिए एक लाइन के साथ पिपेट खरोंच। दोनों हाथों के साथ, एक कुंद कटौती उत्पन्न करने के लिए इसकी लंबाई को पिपेट समानांतर पुल। तेजी से लौ-पॉलिश टिप सील बिना पिपेट।
    3. , 200-400 माइक्रोन (व्यास में 500 माइक्रोन के आसपास) निषेचित अंडे के लिए, 600 माइक्रोन unfertilized oocytes के लिए 300-400 माइक्रोन (व्यास में 150 माइक्रोन के आसपास): oocytes / भ्रूण की अवस्था के साथ टिप के व्यास pipetted किया जा के लिए अलग अलग रची neurulae के लिए। एक मुंह से निगरानी की आकांक्षा ट्यूब के साथ प्रयोग करें pipettes के एक पकवान से oocytes / भ्रूण हस्तांतरण करने के लिएदूसरे करने के लिए।
  2. इंजेक्शन सुई
    1. RNase मुक्त शर्तों सुनिश्चित करने के लिए दस्ताने के साथ केशिकाओं में हेरफेर। आयुध डिपो 1.20 मिमी, आईडी 0.94 मिमी, लंबाई 10 मिमी के आयामों के साथ रेशा केशिकाओं के साथ borosilicate ग्लास का प्रयोग करें।
    2. केशिकाओं सामग्री सूची में वर्णित हीटिंग रेशा सुई खींचने के प्रकार पर खींच रहे हैं, तो निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: हीट 600, वेग 80, समय 60, दबाव 200 या अन्यथा 300. 50 खींचो, आकार, जो कि यह सुनिश्चित करें सफल इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है, तो निम्न गुणों के साथ चित्रा 2 में दिखाया गया है: 4-8 माइक्रोन बाहरी टिप व्यास, 2 सेमी शंकु लंबाई।
      नोट: सुई spawning के मौसम से पहले खींच लिया और मौसम में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. 5% phenol लाल शेयर समाधान (4x)
    1. प्रत्येक spawning के मौसम से पहले नए सिरे से तैयार करें।
    2. 0.22 माइक्रोन निस्पंदन ट्यूब में, phenol लाल पाउडर के 25 मिलीग्राम बाहर तौलना।
    3. को DNase- और RNase मुक्त पानी के 0.5 मिलीलीटर जोड़ेंपाउडर युक्त ट्यूब।
    4. समाधान फिल्टर बाँझ और इंजेक्शन की सुई रोकना सकता है कि क्रिस्टल को दूर करने के लिए कमरे के तापमान पर 18,000 XG पर 3-5 मिनट के लिए स्पिन।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या -20 डिग्री सेल्सियस पर 250 μl aliquots दुकान।
  4. / एमएल पाली lysine समाधान 0.25 मिलीग्राम
    1. प्रत्येक spawning के मौसम से पहले नए सिरे से तैयार करें।
    2. आसुत जल 20 मिलीलीटर में पाली एल लाइसिन की 5 मिलीग्राम भंग। स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिलीलीटर aliquots।
    3. पाली lysine लेपित डिश के लिए oocytes की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत आसंजन सुनिश्चित करने के लिए केवल एक बार तुरंत एक defrosted विभाज्य का प्रयोग करें और।
  5. mRNA के संश्लेषण
    1. प्रत्येक spawning के मौसम से पहले नए सिरे से तैयार करें।
    2. (37 डिग्री सेल्सियस पर आम तौर पर 2 घंटे के लिए,) पर्याप्त एंजाइम के साथ ब्याज के डीएनए के 5 माइक्रोग्राम प्रति linearize। पाचन की पूर्णता की जांच करने के लिए, 20 मिनट के लिए 150 डब्ल्यू पर TBE बफर में एक 1% agarose-TBE जेल पर पाचन मिश्रण की मात्रा में 2% चलाते हैं।
    3. LINEA निकालें24: 1 फिनोल (8.0 पीएच): क्लोरोफॉर्म: 25 के साथ rized डीएनए isoamyl शराब। 20 सेकंड, अपकेंद्रित्र 18,000 XG पर 10 मिनट और जलीय (ऊपरी) चरण इकट्ठा के लिए भंवर।
    4. 24 के साथ फिर से जलीय चरण निकालें: 1 क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब। 20 सेकंड, अपकेंद्रित्र 10 18,000 XG पर न्यूनतम और जलीय चरण इकट्ठा के लिए भंवर।
    5. 10: 300 linearized डीएनए: 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2): -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 100% इथेनॉल 100 के साथ linearized डीएनए वेग।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 18,000 XG पर अपकेंद्रित्र 20 मिनट। 70% इथेनॉल में कुल्ला।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 18,000 XG पर अपकेंद्रित्र 10 मिनट। RNase मुक्त पानी में सूखे और resuspend 0.5 माइक्रोग्राम प्रति / μl के अंतिम एकाग्रता में करते हैं।
    8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, उचित पोलीमर्स के साथ एक mRNA संश्लेषण किट का उपयोग कर linearized डीएनए के एक माइक्रोग्राम प्रति टाइप करना।
    9. एक फिनोल (पीएच 4.7): 5 के साथ mRNA के निकालें किट के साथ प्रदान क्लोरोफॉर्म और अमोनियम एसीटेट स्थान पर समाधान।
    10. 20 सेकंड के लिए भंवर, सीईntrifuge 18,000 XG पर 10 मिनट और जलीय चरण इकट्ठा।
    11. 24 के साथ फिर से जलीय चरण निकालें: 1 क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब। 20 सेकंड, अपकेंद्रित्र 10 18,000 XG पर न्यूनतम और जलीय चरण इकट्ठा के लिए भंवर।
    12. रातोंरात -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% isopropanol के साथ mRNA के वेग।
    13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 18,000 XG पर अपकेंद्रित्र 20 मिनट। 80% इथेनॉल में कुल्ला।
    14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 18,000 XG पर अपकेंद्रित्र 10 मिनट। यह तो resuspend के लिए मुश्किल हो जाएगा के रूप में नहीं रह गया है की तुलना में 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गोली शुष्क करते हैं। कम से कम 2 माइक्रोग्राम प्रति / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए DNase- और RNase मुक्त पानी में Resuspend इंजेक्शन मिश्रण में एक सभ्य अंतिम mRNA के एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए।
    15. , प्रतिलेखन उत्पाद की गुणवत्ता और आकार की जाँच 20 मिनट के लिए 150 डब्ल्यू पर TBE बफर में एक RNase मुक्त 1% agarose-TBE जेल पर mRNA की 0.5 μl चलाने के लिए। स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर 2 μl aliquots।
  6. पाली lysine लेपित व्यंजन
    नोट: पाली lysine सीओएटेड व्यंजन इंजेक्शन के दौरान oocytes स्थिर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
    1. प्रत्येक 35 मिमी सेल संस्कृति पेट्री डिश (कुल 5) के लिए, thawed 0.25 मिलीग्राम / एमएल पाली lysine समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश के तल को कवर किया। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    2. प्रत्येक 35 मिमी सेल संस्कृति पेट्री डिश (कुल 5) के लिए, एक और 35 मिमी सेल संस्कृति पेट्री डिश में 0.25 मिलीग्राम / एमएल पाली lysine समाधान स्थानांतरण। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    3. 0.25 मिलीग्राम / एमएल पाली lysine समाधान त्यागें।
    4. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पेट्री डिश सूखी, ऊपर से नीचे चलो।
    5. एक सप्ताह के अधिकतम के लिए संक्रमण से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्लास्टिक की चादर में लिपटे पाली lysine लेपित बर्तन स्टोर।
  7. Agarose लेपित व्यंजन
    नोट: वे संस्कृति इंजेक्शन भ्रूण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। agarose इंजेक्शन भ्रूण के लिए एक तकिया प्रदान करता है और पकवान के नीचे से चिपके से रोकता है।
    1. कृत्रिम समुद्री जल (ASW) 37-38 ग्राम / एल कॉम का उपयोग करनारिवर्स ऑस्मोसिस पानी में ercial साल्ट + 0.25 मिमी 3 NaHCO।
    2. एक माइक्रोवेव में समाधान हीटिंग द्वारा 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर ASW में agarose एक 1% एकाग्रता को भंग।
    3. तेजी से पकवान की एक बहुत पतली agarose कोटिंग सुनिश्चित करने के क्रम में एक और एक में एक 35 मिमी पेट्री डिश से गर्म agarose समाधान डालना।
    4. सरन में लिपटे agarose लेपित व्यंजन एक सप्ताह अधिकतम के लिए संक्रमण से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लपेट स्टोर।
  8. इंजेक्शन सुई का इंजेक्शन मिश्रण और लदान
    1. के बारे में 2 घंटा इंजेक्शन शुरू करने से पहले, 1-1.8 mRNA की माइक्रोग्राम प्रति / μl, 15% ग्लिसरॉल, 1.25% phenol लाल के अंतिम सांद्रता के साथ एक 2 μl इंजेक्शन RNase- में मिश्रण और DNase मुक्त पानी बनाते हैं।
      नोट: phenol लाल रंग इंजेक्शन कुशलता और सफलतापूर्वक इंजेक्शन भ्रूण की पहचान की निगरानी की अनुमति देता है समाधान। ग्लिसरॉल डिम्बाणुजनकोशिका भीतर mRNA के प्रसार के पक्ष में है।
    2. अपकेंद्रित्र 4 मिनट के लिए 18,000 XG परगोली क्रिस्टल। बर्फ पर उपयोग करें जब तक रखें।
    3. एक 10 μl विंदुक के साथ, क्रिस्टल pelleted किया गया है, जहां ट्यूब के नीचे से परहेज है, इंजेक्शन मिश्रण के 0.5 μl इकट्ठा।
    4. सुई की बड़ी उद्घाटन के अवसर पर इंजेक्शन मिश्रण के 0.5 μl ड्रॉप pipetting द्वारा (मामले में इंजेक्शन के दौरान एक टूट जाता है) में कम से कम दो इंजेक्शन सुई backfill।
    5. इंजेक्शन मिश्रण के वाष्पीकरण को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तल पर तरल के साथ एक भंडारण जार में सुइयों को स्थापित करें। इंजेक्शन मिश्रण धीरे धीरे बुलबुले के निर्माण के लिए कम से कम करने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए इंजेक्शन की सुई की नोक के लिए यात्रा करते हैं।
    6. MRNA के गुणवत्ता कमजोर होती जाती है, जिसके बाद तीन अतिरिक्त का उपयोग करता है, की अधिकतम के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर अतिरिक्त इंजेक्शन मिश्रण (नहीं दिखाया डेटा)।

जैविक सामग्री, microinjection और भ्रूण संस्कृति की 2. संग्रह

  1. Oocyte और शुक्राणु संग्रह
    नोट: Theodosiou देखेंएट अल। स्पॉन उत्प्रेरण के लिए और युग्मक संग्रह के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए 12।
    1. 24 घंटे के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर ASW में शॉक पुरुषों और महिलाओं।
    2. ज्यादातर वयस्कों सूर्यास्त के बाद 1-2 घंटा अंडे जाएगा क्योंकि सूर्यास्त से पहले एक से दो घंटे, 19 डिग्री सेल्सियस पर ASW में व्यक्तिगत कप में वयस्कों के हस्तांतरण।
    3. फ़िल्टर्ड ASW में 35 मिमी पेट्री डिश कुल्ला और उन्हें पकवान की तह तक चिपके से oocytes को रोकने के लिए सूखी उलटा करते हैं।
    4. स्पॉन पर, तुरंत एक 1000 μl विंदुक के साथ शुक्राणु और oocytes इकट्ठा।
      1. शुक्राणु रखें और संपर्क युग्मक स्वास्थ्य के लिए हानिकारक है, क्योंकि oocytes वयस्क amphioxus से अलग (डेटा) नहीं दिखाया।
      2. इसके अलावा, शुक्राणु और oocytes दोनों फैलने कि आंदोलनों की ओर जाता है, जो वयस्कों चौंकाने बचने के लिए, और इसलिए पतला। संभव के रूप में लंबे समय के रूप में सक्रिय शुक्राणु रखने के लिए और, निषेचन दर का अनुकूलन संभव के रूप में ध्यान केंद्रित के रूप में शुक्राणु एकत्र करने के लिए।
    5. रखनाएक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में बर्फ पर शुक्राणु।
    6. पूर्व rinsed 35 मिमी पेट्री डिश में फ़िल्टर ASW में oocytes स्थानांतरण।
    7. स्थानांतरण 100-500 इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए एक और 35 मिमी पेट्री डिश के लिए एक पहले से खींच लिया 300-400 माइक्रोन स्थानांतरण पाश्चर विंदुक के साथ oocytes।
    8. शुक्राणु और oocyte गुणवत्ता के लिए या अन्य प्रयोगों के लिए एक नियंत्रण के रूप में क्लच के शेष खाद।
  2. Oocyte इंजेक्शन
    1. क्षैतिज विमान के लिए एक 50 डिग्री के कोण रिश्तेदार पर micromanipulator पर इंजेक्शन की सुई को स्थापित करें।
      नोट: अधिक से अधिक 50 डिग्री के कोण डिम्बाणुजनकोशिका को सुई की स्थिति रिश्तेदार का एक उपयुक्त निगरानी की अनुमति नहीं दी जाएगी, जबकि कम से कम 50 डिग्री के कोण, पकवान पर चारों ओर oocytes धक्का होगा।
    2. 25x oculars के साथ एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश के तहत, फ़िल्टर्ड ASW युक्त एक पाली lysine लेपित पकवान पर 300-400 माइक्रोन स्थानांतरण पाश्चर विंदुक के साथ 30 oocytes हस्तांतरण।
    3. ले जाने के लिए एक लाइन के साथ oocytes जमाएक आदेश के रास्ते में और बाहर इंजेक्शन गैर इंजेक्शन oocytes से इंजेक्ट भेद करने के लिए। विकासशील भ्रूण खंडित हो जाती है, जो पाली lysine, के लिए oocytes के लोगों तक पहुंचाने के समय को कम करने के लिए कम संख्या (30 oocytes) इंजेक्षन (डेटा) नहीं दिखाया।
    4. संभव के रूप में पारदर्शी रूप में oocytes रेंडर करने के लिए अंधेरे क्षेत्र रोशनी का उपयोग करें।
    5. Micromanipulator के मोटे आंदोलन दस्ता के साथ, एक oocyte के करीब इंजेक्शन की सुई ले आओ।
    6. ठीक संदंश के साथ, टिप घुमावदार होने के लिए शुरू होता है, जहां के स्तर पर सुई खोलने में कटौती। इंजेक्टर साथ स्पंदन से, कि लाल इंजेक्शन मिश्रण वास्तव में सुई से बाहर बह रहा है सत्यापित करें।
    7. 200X बढ़ाई और micromanipulator के ठीक आंदोलन दस्ता के साथ, धीरे डिम्बाणुजनकोशिका की कोर के अंदर इंजेक्शन की सुई चाल है।
      नोट: बहुत अल्पज्ञता डाला, तो इंजेक्शन समाधान डिम्बाणुजनकोशिका के अंदर नहीं रह जाएगा। बहुत दूर डाला, तो डिम्बाणुजनकोशिका नष्ट हो जाएगा।
    8. 120 मिसे durat 1-3 दालों के साथ इंजेक्षनआयन और 1-10 साई दबाव। सुई काफी ठीक है, तो लगातार दबाव में निरंतर प्रवाह के साथ इंजेक्षन। इंजेक्शन की मात्रा एक एकल डिम्बाणुजनकोशिका की मात्रा का 1/3 के लिए 1/5 से मेल खाती है कि सुनिश्चित करें।
    9. इंजेक्शन के बाद, डिम्बाणुजनकोशिका के रिसाव से बचने के लिए तेजी से सुई को बाहर खींच।
    10. इंजेक्शन समाधान डिम्बाणुजनकोशिका के भीतर रहता है और कहा कि कुछ सेकंड के बाद, इंजेक्शन समाधान डिम्बाणुजनकोशिका भर में फैलता है सत्यापित करें।
    11. अगली पंक्ति में डिम्बाणुजनकोशिका पर जाएं।
    12. इंजेक्शन भ्रूण के लिए स्कैनिंग के दौरान पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति अनुमान लगाने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रत्येक श्रृंखला के कुछ uninjected भ्रूण रखें।
  3. इंजेक्शन भ्रूण और भ्रूण संस्कृति के निषेचन, चयन
    1. के रूप में जल्द ही एक श्रृंखला इंजेक्ट कर दिया गया है के रूप में oocytes खाद। डिम्बाणुजनकोशिका गुणवत्ता समय के साथ गिरावट के रूप में, इंजेक्षन और 12 स्पॉन के बाद एक घंटा के भीतर oocytes खाद।
    2. शुक्राणु एकाग्रता पर निर्भर करता है, oocytes के लिए शुक्राणु की 1-5 बूँदें जोड़ने औरपकवान ज़ुल्फ़।
      नोट: निषेचन लिफाफा के बारे में एक मिनट के बाद भ्रूण पर स्पष्ट हो जाना चाहिए।
    3. Oocytes की एक और श्रृंखला इंजेक्शन लगाने, जबकि भ्रूण पाली lysine लेपित पकवान से अलग करने की अनुमति दें।
    4. एक agarose लेपित पेट्री डिश में 600 माइक्रोन स्थानांतरण पाश्चर विंदुक के साथ भ्रूण स्थानांतरण। सभी संभव दो सेल चरण से पहले, तो जितनी जल्दी हो सके पाली lysine लेपित पकवान से भ्रूण निकालें।
      नोट: पाली lysine करने के लिए लंबे समय तक निवेश के मामले में, भ्रूण पकवान के नीचे छू तरफ चपटा घनी पैक blastulae, हो जाते हैं।
    5. 2-सेल 4 सेल करने के लिए मंच पर, इस dsr फिल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश के साथ चयन सफलतापूर्वक-इंजेक्शन भ्रूण, यानी, एक phenol लाल व्युत्पन्न लाल फ्लोरोसेंट संकेत दिखा रहे हैं कि एक सामान्य आकृति विज्ञान के साथ थे।
    6. वांछित चरण के लिए जब तक 19 डिग्री सेल्सियस पर agarose लेपित पेट्री डिश में फ़िल्टर्ड ASW में संस्कृति में भ्रूण रखेंvivo इमेजिंग में।

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Representative Results

ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल बी के microinjection के लिए आधार प्रदान करता है lanceolatum oocytes और इसलिए बी के विकास में शुरूआत के लिए mRNA की lanceolatum भ्रूण में vivo इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग। तकनीक निश्चित रूप से मजबूत और विश्वसनीय है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग सफल इंजेक्शन की दर चर (तालिका 1) बनी हुई है। इस पेचीदा तथ्य के लिए बहुत संभावना विवरण डिम्बाणुजनकोशिका चंगुल से चरम परिवर्तनशीलता है: इंजेक्शन दबाव के अधीन जब अलग अंडे बैचों दरअसल, बहुत अलग ढंग से व्यवहार करते हैं। दूसरों को काफी कड़ा कर रहे हैं और इंजेक्शन पर दौर बने हुए हैं, जबकि कुछ oocytes, बल्कि लोचदार हैं और डिश के तल पर समतल करने के लिए करते हैं। कुछ लोग सिर्फ lyse (डेटा) नहीं दिखाया है, जबकि इसके अलावा, कुछ डिम्बाणुजनकोशिका बैचों, इंजेक्शन पर उनके जरायु झिल्ली बढ़ जाते हैं। कोई स्पष्ट सहसंबंध इंजेक्शन और भ्रूण पर डिम्बाणुजनकोशिका व्यवहार के बीच स्थापित किया जा सकता हैनिषेचन के बाद विकास। यह microinjection के लिए सबसे उपयुक्त है oocytes की किस श्रेणी पूर्वानुमान करने के लिए इस प्रकार के लिए मुश्किल है। हालांकि निषेचन के बाद, सामान्य विकास के दौर से गुजर भ्रूण दरार चरणों के रूप में जल्दी के रूप में पहचाना जा सकता है: blastomeres के बीच संपर्क सतह छोटा है जब 4 सेल चरण भ्रूण को दो-सेल, सामान्य माना जा सकता है एक ठोस दरार चरण भ्रूण, जहां व्यक्ति की कोशिकाओं, जबकि विचार करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं, निश्चित रूप से असामान्य है।

हमारे हाथ में, oocytes के बारे में आधे इंजेक्शन द्वारा और इंजेक्शन प्रदर्शनी एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबल जीवित है कि भ्रूण के बारे में आधा वजह से आघात जीवित नहीं है। इस प्रकार, हम इस इंजेक्शन प्रोटोकॉल के साथ, 50 और 120 के बीच भ्रूण सफलतापूर्वक 15 और 60 में लेबल भ्रूण के बीच उपज एक दिया स्पॉन दिन पर इंजेक्ट किया जा सकता है कि अनुमान है।

4 सेल चरण भ्रूण को दो-सेल में phenol लाल के लाल प्रतिदीप्ति बहुत मज़बूती से है कि भ्रूण के निशानइस तरह से चयनित भ्रूण की 100% बाद में इंजेक्ट mRNA के द्वारा इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन के रूप में ठीक से, इंजेक्शन दिया गया। साथ ही, 2-सेल 4 सेल करने के लिए मंच पर phenol लाल प्रतिदीप्ति की तीव्रता और इंजेक्शन mRNA के द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन द्वारा उत्पादित प्रतिदीप्ति की शुरुआत के समय के बीच एक बहुत ही स्पष्ट सकारात्मक संबंध है। इस संबंध इस प्रकार इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान mRNA की उच्चतम मात्रा प्राप्त किया है कि उन भ्रूणों की पहचान के लिए अनुमति देता है।

इंजेक्शन के mRNA के द्वारा इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का संकेत phenol लाल पॉजिटिव भ्रूण के चयन के बाद पता नहीं है, तो हम mRNA के क्षरण या फँसाने के लिए जाँच करने के क्रम में एक RNase मुक्त जेल पर इंजेक्शन मिश्रण को चलाने के लिए सलाह देते हैं (चित्रा 3) । लेन 1 में, एक अक्षुण्ण mRNA के बैंड का पता चला है। इस मिश्रण का इंजेक्शन भ्रूण में मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत का नेतृत्व किया। इसके विपरीत, लेन दो में एक और experimen से मेल खाती हैphenol लाल (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें) मिश्रण में dextran डाई के साथ बदल दिया गया था, जहां टी, mRNA के भ्रूण में फ्लोरोसेंट संकेत करने के लिए नेतृत्व कभी नहीं इस मिश्रण की dextran डाई और इंजेक्शन से फंस गया है लगता है।

इस microinjection तकनीक और हमारे निर्माणों (टेबल्स 2 और 3, अनुपूरक फ़ाइल 1) (चर्चा देखें), हम इस प्रकार reproducibly झिल्ली में नाभिक में और EGFP साथ mCherry या EGFP साथ भ्रूण भर में समरूप फ्लोरोसेंट लेबलिंग उत्पादन कर सकते हैं का उपयोग करना (चित्रा 4) । इमेजिंग प्रोटोकॉल चित्रा 4 कहीं वर्णित किया जाएगा (Faure एट अल।, वर्तमान तैयारी में) उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। MRNA की राशि पर निर्भर करता है फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति आम तौर पर 16-सेल (चित्रा -4 ए) और 64-सेल चरणों के बीच पता लगाने योग्य हो जाता है और कम से कम देर neurula चरण के लिए ऊपर से detectable रहता है, इंजेक्ट (डेटा) नहीं दिखाया। बाद के चरणों परीक्षण नहीं किया गया। परमाणु संकेतआम तौर पर संभावित क्योंकि नाभिक की कॉम्पैक्ट प्रकृति की तुलना में झिल्ली की आंतरिक रूप से फैलाना प्रकृति के कारण, झिल्ली संकेत पहले की तुलना में प्रकट होता है (डेटा) नहीं दिखाया। यह योजनाबद्ध तरीके से नजर रखी नहीं किया गया है हालांकि, भ्रूण एक परमाणु EGFP लेबल के साथ विशेष रूप से इंजेक्शन भ्रूण की तुलना में कम स्वस्थ होना दिखाई देते हैं एक परमाणु और एक झिल्ली लेबल दोनों के साथ इंजेक्शन। इंजेक्शन के mRNA की कुल राशि एक या दो mRNA प्रजातियों मिश्रण करने के लिए शामिल किए गए हैं कि क्या एक ही है, के रूप में दिलचस्प, इस आशय से इंजेक्शन mRNA की कुल राशि के स्वतंत्र होने लगता है (डेटा) नहीं दिखाया।

चित्रा 1
चित्रा 1: विवरण का निर्माण। (ए) के नमूने झिल्ली-लक्षित EGFP (EGFP: CAAX बॉक्स), (ख) परमाणु-लक्षित EGFP (H2B: EGFP) और (सी) परमाणु-लक्षित mCherry (H2B: mCherry) की गिरफ्तारी constructsई दिखाया।

चित्रा 2
चित्रा 2: एक प्रतिनिधि इंजेक्शन सुई का आकार। (ए) शंकु के बारे में दो लंबाई में सेमी और नोक पर सुई से घटता है। स्केल बार = 2 मिमी। ए में बॉक्सिंग क्षेत्र (बी) आवर्धन सुई (तीर) कतरन के लिए स्थिति सुई की अवस्था में है। सुई की नोक नोक ने संकेत दिया है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3:। लेन 1 में mRNA और phenol लाल युक्त एक मिश्रण के प्रवास के mRNA की बातचीत और चयनित फ्लोरोसेंट रंजक (ए) के रिजल्ट औरmRNA और लेन में (3.3 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में) mRNA और ओरेगन ग्रीन dextran युक्त एक मिश्रण के प्रवास के लेन 2. (बी) के परिणाम में (3.3 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में) टेक्सास रेड dextran के 3, mRNA और ए और बी में लेन 5. जेल प्रवास के समय में (3.3 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में) 4 लेन में और mRNA और rhodamine dextran के (3.3 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में) FITC dextran के था अलग। स्पष्टता के लिए, एक प्रकाश परावर्तन और धराशायी लाइनों प्रवास गलियों चित्रित करना एक मुखौटे में काला आयत। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: mRNAs फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए कोडिंग के साथ इंजेक्शन amphioxus भ्रूण की 3 डी प्रतिपादन (अमीरा सॉफ्टवेयर) छवियाँ हैं।एक अनुकूलित Leica SP5 2 फोटॉन लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन पर हासिल कर ली 3 डी समय-चूकों से निकाले (ए) 16 सेल चरण भ्रूण परमाणु H2B व्यक्त:।। mCherry और झिल्ली-लक्षित: EGFP (बी) गेसट्रुला चरण भ्रूण परमाणु H2B व्यक्त EGFP:। CAAX बॉक्स (सी) गेसट्रुला चरण भ्रूण परमाणु H2B व्यक्त: mCherry और झिल्ली-लक्षित EGFP: CAAX बॉक्स। ऑप्टिकल अनुभाग परमाणु mCherry और झिल्ली जुड़े EGFP संकेतों के साथ आंतरिक कोशिकाओं से पता चलता है। स्केल बार 50 माइक्रोन =।

प्रयोग संख्या इंजेक्ट निर्माण mRNA इंजेक्शन भ्रूण की संख्या लेबल वाले भ्रूण की संख्या
1 H2B: EGFP 53 23
2 H2B: EGFP 50 31
3 H2B: EGFP 48 20
4 H2B: EGFP 54 24
5 H2B: EGFP 114 47
6 H2B: EGFP 80 46
7 H2B: EGFP या 62 24
H2B: mCherry + EGFP: CAAX बॉक्स
8 H2B: EGFP 87 60
9 H2B: EGFP 77 45
10 EGFP: CAAX बॉक्स या 110 51
H2B: mCherry + EGFP: CAAX बॉक्स
11 H2B: mCherry + EGFP: CAAX बॉक्स 45 26
12 H2B: mCherry + EGFP: सीएकुल्हाड़ी बॉक्स 52 16
13 EGFP: CAAX बॉक्स या 74 35
H2B: mCherry + EGFP: CAAX बॉक्स
टोटल 906 448
सफलता की दर 49%

तालिका 1:। सफल इंजेक्शन के कुल प्रतिशत के रूप में इंजेक्शन सफलता दर इंजेक्ट निर्माणों, इंजेक्शन और लेबल (या सफलतापूर्वक इंजेक्ट) भ्रूण की संख्या बच गया है कि इंजेक्शन भ्रूण की संख्या, संकेत कर रहे हैं।

निर्माण PCS2 + वेक्टर में स्थिति मूल अनुक्रम उत्परिवर्तित अनुक्रम
pCS2 + EGFP: CAAX बॉक्स 79..87 GGA टीसीसी एसीसी एसीसी जी.टी. सी एक एक सी
pCS2 + H2B: EGFP 82..90 टीसीसी GAC ACG एक सीसी जी टी सी ए एसी
pCS2 + H2B: mCherry 82..90 टीसीसी GAC ACG एक सीसी जी टी सी ए एसी

तालिका 2:। कोज़ाक दृश्यों की अंतरिम अनुकूलन मूल और उत्परिवर्तित कोज़ाक दृश्यों प्रत्येक निर्माण के लिए संकेत कर रहे हैं। शुरू की म्यूटेशन बी के कोज़ाक अनुक्रम की वसूली बहुत बारीकी से मिलता-जुलता है जो lanceolatum actin के जीन, कि amphioxus की अनुमानित सैद्धांतिक वरीय कोज़ाक अनुक्रम की (ए / सीजीए / सीजी / टीटीसी ए / GAC ATG टीजी / सीटी)।

pCS2 + EGFP: CAAX बॉक्स
मूल कोडोन उत्परिवर्तित कोडोन PCS2 + वेक्टर में स्थिति
(उपयोग स्तर) (उपयोग स्तर)
GTA जीटी जी 154..156 EGFP अनुक्रम
(0.08) (0.43)
आगा एजी जी 814..816 Linker
(0.09) (0.27)
pCS2 + H2B: EGFP
मूल कोडोन उत्परिवर्तित कोडोन में स्थितिpCS2 + वेक्टर
(उपयोग स्तर) (उपयोग स्तर)
GTA जीटी जी 223..225 H2B अनुक्रम
(0.08) (0.43)
289..291 H2B अनुक्रम
469..471 Linker
568..570 EGFP अनुक्रम
सीटीए सीटी जी 226..228 H2B अनुक्रम
(0.06) (0.51)
pCS2 + H2B: mCherry
मूल कोडोन उत्परिवर्तित कोडोन PCS2 + V में स्थितिEctor
(उपयोग स्तर) (उपयोग स्तर)
GTA जीटी जी 223..225 H2B अनुक्रम
(0.08) (0.43)
289..291 H2B अनुक्रम
469..471 Linker
913..915 mCherry अनुक्रम
सीटीए सीटी जी 226..228 H2B अनुक्रम
(0.06) (0.51)

तालिका 3: कोडोन उपयोग की अंतरिम अनुकूलन। मूल और उत्परिवर्तित codons प्रत्येक निर्माण के लिए संकेत कर रहे हैं। इस प्रयोगात्मक परीक्षण नहीं किया गया है, जबकि mutati शुरू कीऑन्स amphioxus में mRNA अनुवाद का अनुकूलन करने के लिए होती हैं।

अनुपूरक फ़ाइल 1: दृश्यों का निर्माण (ए) झिल्ली-लक्षित EGFP के न्यूक्लियोटाइड दृश्यों। (EGFP: CAAX बॉक्स), (ख) परमाणु-लक्षित EGFP (H2B: EGFP) और (सी) परमाणु-लक्षित mCherry (H2B : mCherry) निर्माणों pCS2 + वेक्टर रीढ़ की हड्डी के संदर्भ में दिया जाता है। निर्माणों में से प्रत्येक के द्वारा इनकोडिंग मुख्य डोमेन के रंग में संकेत कर रहे हैं: EGFP (हरा), mCherry (लाल), मानव HRAS (CAAX बॉक्स) से झिल्ली स्थानीयकरण संकेत (नीला सियान), zebrafish हिस्टोन 2B एक्सॉन (H2B) (पीला)।

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Discussion

इस अनुच्छेद में, हम बी के इंजेक्शन के लिए, पहली बार के लिए, एक विस्तृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल पेश lanceolatum oocytes, जो, के बाद बी floridae 13,14 और बी belcheri 15, इस प्रकार एक ऐसी तकनीक वर्णित किया गया है, जिसके लिए तीसरे amphioxus प्रजातियों है। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटोकॉल भी बी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुकूल वेक्टर प्रणालियों का विवरण भी शामिल है यहाँ वर्णित इन विट्रो में उत्पादित इंजेक्ट mRNA से lanceolatum (नीचे वर्णित)। साथ में, इन नए उपकरणों amphioxus के प्रारंभिक विकास और ऐसी दरार और gastrulation के रूप में भ्रूण में जल्द से जल्द morphogenetic घटनाओं आबाद है कि गतिशील सेल व्यवहार के विश्लेषण के vivo इमेजिंग में अनुमति देते हैं।

सामान्य में, microinjection तकनीक एक विशिष्ट परिसर के एक पूर्व निर्धारित मात्रा का एक लक्ष्य सेल में, प्रसव की इजाजत देने का लाभ है। इस किया जा रहा है साथसहायता, इस तकनीक का एक प्रमुख सीमा एक दिया प्रयोग के दौरान इंजेक्शन जा सकता है कि कोशिकाओं की सीमित संख्या है। उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल बी के लिए यहाँ वर्णित lanceolatum बारे में आधे से लेबल किया जाएगा, जिनमें से इंजेक्शन प्रति सत्र 100-120 अंडे, (3 टेबल) के इंजेक्शन की अनुमति देता है। बी के लिए floridae, संख्या 50% से अधिक इंजेक्शन 13,14 बच जाएगा, जिनमें से प्रति दिन इंजेक्ट किया जा सकता है कि 500 या उससे अधिक अंडे, साथ बहुत समान हैं। बी इंजेक्शन लगाने के लिए प्रोटोकॉल जबकि lanceolatum और बी floridae अंडे बारीकी बी, एक दूसरे के समान belcheri तकनीक से थोड़ा अलग है: एक अलग ब्रांड की एक microinjector का उपयोग कर एक औंधा माइक्रोस्कोप के नीचे अंडे पाली lysine लेपित coverslips पर रखा जाता है और इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं। यह दृष्टिकोण जाहिरा तौर पर 200 और 300 के बीच बी के इंजेक्शन की अनुमति देता है एक जीवित रहने की दर के साथ, neurula चरण में अंडे सेने के बाद इंजेक्शन प्रति सत्र belcheri अंडे, ओएफ 95.83% से 15 89.39%। प्रोटोकॉल में मतभेद को देखते हुए, यह सफलता दर में मतभेद प्रजातियों से संबंधित या प्रोटोकॉल से संबंधित मतभेदों की वजह से कर रहे हैं कि क्या पता करने के लिए मुश्किल है। इस सवाल का जवाब देने में अलग प्रोटोकॉल के साथ समानांतर में विभिन्न प्रजातियों का परीक्षण करने के लिए होगा। बहरहाल, आगे बहिर्जात यौगिकों के वितरण के लिए लक्षित oocytes की संख्या में वृद्धि करने, अन्य प्रोटोकॉल amphioxus के लिए विकसित करना होगा। उम्मीदवार तकनीक इलेक्ट्रोपोरेशन, microparticles, lipofection साथ बमबारी, और पारगमन 4 शामिल हैं। ध्यान से, electroporation के पहले से ही निषेचित ascidian सचोली अंडे में बहिर्जात सामग्री की शुरूआत के लिए एक मानक तकनीक के रूप में स्थापित किया गया है, एक और अकशेरुकी कोरडेट मॉडल विकासात्मक तंत्र 8 के विकास के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है।

सफल microinjection और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बाद vivo इमेजिंग, के लिए उपयुक्तअभिव्यक्ति वैक्टर एक अनिवार्य शर्त है। इस दिशा में तीन प्लास्मिड (चित्रा 1, अनुपूरक फ़ाइल 1) मान्य प्रयोगात्मक विकसित किया गया है: CAAX बॉक्स का निर्माण: झिल्ली लक्ष्यीकरण के लिए, EGFP जीन मानव HRAS CAAX बॉक्स करने के लिए अपने 3 'अंत में इनकार किया गया था (एक EGFP में जिसके परिणामस्वरूप ) 16 और, परमाणु लक्ष्यीकरण के लिए, EGFP और mCherry जीन दोनों अपने 5 पर जुड़े हुए थे 'एक H2B में, क्रमशः, जिसके परिणामस्वरूप zebrafish हिस्टोन 2 बी (H2B) एक्सॉन (करने के लिए समाप्त हो जाती है: EGFP और एक H2B: mCherry निर्माण) 17। इन निर्माणों में से हर एक एक SV40 देर polyadenylation साइट और इन विट्रो छाया mRNA के संश्लेषण 18,19 में अनुमति देने के लिए एक SP6 प्रमोटर युक्त pCS2 + प्लाज्मिड में क्लोन किया गया है। इसके अलावा, लक्ष्य के साथ बी में निर्माणों का अनुवाद करने के लिए अनुकूलन lanceolatum, कोज़ाक दृश्यों और codons दोनों एकल nucleotide उत्परिवर्तजनन (टेबल्स 2 और 3, अनुपूरक फ़ाइल 1) का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है। बासनाकागावा 20, बी के एक छोटे से पूल द्वारा दृष्टिकोण पर एड lanceolatum जीन इस प्रजाति में एक पसंदीदा कोज़ाक अनुक्रम की पहचान के लिए विश्लेषण किया गया था। इस सैद्धांतिक वरीय अनुक्रम करने के लिए करीब से जाना जाता है, स्वाभाविक रूप से होने वाली अनुक्रम बी का है actin के जीन lanceolatum। तीन निर्माणों की कोज़ाक दृश्यों इसलिए इस actin के जीन अनुक्रम मैच के लिए संशोधित किया गया है। इसके अलावा, बी के कोडोन उपयोग lanceolatum बी में एक कम उपयोग संभावना के साथ निर्माणों में कोडोन उपयोग डेटाबेस 21 और codons का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था lanceolatum (<10%) एक उच्च उपयोग संभावना के साथ बराबर codons से, जहां भी संभव हो, बदल दिया गया था।

इंजेक्शन के परिणामों इन वैक्टर से प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर इमेजिंग विश्लेषण में विवो के लिए उपयुक्त है कि दिखा। संशोधित वैक्टर की अभिव्यक्ति उत्पादन असंशोधित निर्माणों के साथ तुलना नहीं किया गया है कि यह देखते हुए, हम चुनाव नहीं कर सकतेकोज़ाक आम सहमति और कोडिंग दृश्यों में शुरू किए गए थे कि संशोधनों की दक्षता पर clude। यह निश्चित रूप से इन संशोधनों वास्तव में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर प्रभाव पड़ता है कि क्या परीक्षण करने के लिए दिलचस्प होगा। इन पंक्तियों के साथ, हाल ही में एक विश्लेषण बी में microinjections पर आधारित belcheri अन्य, असंशोधित वैक्टर भी amphioxus 15 में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उत्पादन के लिए mRNA की संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पता चलता है।

Amphioxus अंतर्जात हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 22 में शामिल है। भ्रूण इसलिए हरी के निम्न स्तर के साथ ही लाल प्रतिदीप्ति (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) दिखा रहे हैं। हालांकि, इन अंतर्जात स्तरों हमारे mRNA के निर्माणों के इंजेक्शन से उत्पन्न प्रतिदीप्ति के स्तर के संबंध में नगण्य हैं। इसलिए, amphioxus भ्रूण की अंतर्जात प्रतिदीप्ति फ्लोरोसेंट दूरबीन या बहु लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रयोगात्मक टिप्पणियों को परेशान नहीं करता है। इसके साथ - साथइंजेक्शन प्रयोगों mRNA के इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न बहिर्जात प्रतिदीप्ति की तीव्रता सीधे इंजेक्शन मिश्रण में प्रयोग किया जाता mRNA की अंतिम एकाग्रता के साथ जोड़ा जाता है जो इंजेक्शन सामग्री की वास्तविक राशि पर निर्भर करता है कि पता चलता है। बी lanceolatum भ्रूण अप करने के लिए 1.8 माइक्रोग्राम प्रति की एकाग्रता वास्तविक mRNA के एकाग्रता की स्वतंत्र, कुछ mRNA के संयोजन लगते हैं, हालांकि / μl mRNA के, कम बी द्वारा सहन किया जा करने के लिए बर्दाश्त करने की प्रवृत्ति दूसरों की तुलना में भ्रूण lanceolatum। इस प्रकार, परमाणु mCherry और झिल्ली EGFP mRNAs का संयोजन अकेले परमाणु EGFP के इंजेक्शन की तुलना में अधिक विषाक्त होने के लिए दिखाई दिया।

टेक्सास रेड dextran के पहले से amphioxus oocytes 13-15 में सफल इंजेक्शन के लिए एक अनुरेखक के रूप में इस्तेमाल किया गया है। दिलचस्प, इंजेक्ट mRNA से ली गई एक फ्लोरोसेंट संकेत टेक्सास रेड dextran युक्त समाधान के इंजेक्शन और यह दोनों amphioxus oocytes में (एन = 4 प्रयोगों) और zebrafi के बाद प्राप्त कभी नहीं किया गया थाश भ्रूण (एन = 3 प्रयोगों)। MRNA और टेक्सास लाल dextran के लिखित विट्रो में से युक्त एक इंजेक्शन मिश्रण एक RNase मुक्त agarose जेल (चित्रा 3, 2 लेन) पर लोड किया जाता है, mRNA के लिए इसी बैंड अनुपस्थित है। इसके विपरीत, लिखित विट्रो में mRNA phenol लाल (चित्रा 3, लेन 1) की उपस्थिति में एक RNase मुक्त agarose जेल पर detectable है। जेल पर mRNA के क्षरण के लिए कोई सबूत नहीं है कि यह देखते हुए, इन परिणामों टेक्सास रेड dextran के जाल mRNA के लिए जाता है कि सलाह देते हैं। एक इंजेक्शन समाधान में इस्तेमाल किया, टेक्सास रेड dextran के इस प्रकार से इंजेक्शन mRNA की अनुवाद को रोकने सकता है। इस अवलोकन के बाद, mRNA के साथ अन्य रंगों (FITC dextran, rhodamine dextran और ओरेगन ग्रीन dextran) की बातचीत बी में agarose जैल RNase मुक्त पर और इंजेक्शन द्वारा दोनों, परीक्षण किया गया lanceolatum या zebrafish (चित्रा 3)। विश्लेषण FITC dextran के जेल पर जाल mRNA के नहीं करता है कि संकेत मिलता है (चित्रा 3, लैनई 4) और (एन = एक प्रयोग) zebrafish में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है, लेकिन नहीं बी के भ्रूण में lanceolatum (एन = एक प्रयोग) (डेटा) नहीं दिखाया। Rhodamine dextran जेल (चित्रा 3, 5 लेन) पर नहीं जाल mRNA करता है और zebrafish भ्रूण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है (एन = एक प्रयोग) (डेटा) नहीं दिखाया, लेकिन अपनी गतिविधि दुर्भाग्य बी में परीक्षण नहीं किया जा सका lanceolatum भ्रूण। ओरेगन ग्रीन dextran mRNA, mRNA के रूप में एक ही स्तर पर migrates के रूप में अंत में, agarose जेल (चित्रा 3, 3 लेन) द्वारा मूल्यांकन नहीं किया जा सका फँसाने। यह बाद डाई amphioxus (एन = एक प्रयोग) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को रोका, लेकिन zebrafish नहीं भ्रूण (एन = एक प्रयोग) (डेटा) नहीं दिखाया। संक्षेप में, इन आंकड़ों कुछ dextrans कुशलता से इंजेक्शन mRNA की अनुवाद बाधित कर सकते हैं सुझाव है कि। खुराक-प्रतिक्रिया किए गए प्रयोगों के नहीं थे कि यह देखते हुए, इन आंकड़ों गुणात्मक हैं। दिलचस्प, इस निरोधात्मक प्रभाव पर निर्भर हो रहा हैपशु प्रजातियों आगे के अध्ययन के इस आशय के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला गया है, जो (zebrafish बनाम amphioxus),। Dextrans इंजेक्शन के लिए रंग ट्रेसर के रूप में इस्तेमाल किया जा रहे हैं इसके अलावा, अगर इन परिणामों, प्रारंभिक विश्लेषण के लिए कहते हैं।

एक दिया मॉडल के लिए microinjection तकनीक के विकास के जीन विशिष्ट जोड़तोड़ के लिए दरवाजे खोलता है। Amphioxus में, उदाहरण के लिए, microinjections की पहली विवरण (बी floridae में) morpholino oligonucleotide इंजेक्शन 23,24 का उपयोग करते हुए, एक जीन, hox1 के सफल पछाड़ना द्वारा पीछा किया गया था। बी की संख्या सफलतापूर्वक यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग हर दिन इंजेक्ट किया जा सकता है कि lanceolatum भ्रूण अध्ययन के इस प्रकार के साथ निश्चित रूप से संगत है। इसके अलावा, इन तरीकों और हाथ में उपन्यास निर्माणों के साथ, एक अब भी डिजाइन कर सकते हैं और देशी ब्याज की mRNAs (या प्रमुख neg के इंजेक्शन द्वारा overexpression और पछाड़ना पढ़ाई प्रदर्शनative रूपों) या उदाहरण microRNA- या shRNA आधारित रणनीतियों) के लिए जीन की अभिव्यक्ति (खलल न डालें के लिए अन्य रणनीतियों का उपयोग करें। अब तक, amphioxus इंजेक्शन केवल इस कुशलता से स्थिर किया जा सकता है कि केवल मंच है, सिर्फ इसलिए कि डिम्बाणुजनकोशिका स्तर पर किया जा सकता है। डिम्बाणुजनकोशिका चरण में इंजेक्शन के बाद, ब्याज की अणु सर्वत्र भ्रूण में व्यक्त किया है। जीन की अभिव्यक्ति या बदल कोशिकाओं के एक सबसेट में ही नजर रखी जा करने की जरूरत है अगर इन विकासशील amphioxus भ्रूण 15,25-27 में mosaically व्यक्त कर रहे हैं के रूप में इस प्रकार, डीएनए निर्माणों, इंजेक्ट करने की आवश्यकता है। डीएनए का निर्माण इंजेक्शन भी मोज़ेक अभिव्यक्ति 15,25-27 के aforementioned दोष के साथ, क्षणिक ट्रांसजेनिक assays में amphioxus विकास के दौरान विनियामक क्षेत्रों की गतिविधि का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

अंत में, amphioxus microinjection तकनीक को भी विशिष्ट आनुवंशिक loci के लक्षित तोड़े बाहर या तोड़े में शामिल स्थिर transgenesis, के लिए दरवाजे खोलता है। प्रणालीबहिर्जात डीएनए के स्थिर प्रविष्टि के लिए पहले से ही कीड़े और amniote रीढ़ 28 दोनों में कार्य करने के लिए लगता है कि मछली transposon आधारित Tol2 प्रणाली के साथ, उदाहरण के लिए मौजूद हैं। इसके अलावा, संशोधित जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) या प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) या आरएनए निर्देशित जीनोम संपादन उपकरण पर आधारित दृष्टिकोण (CRISPR / कैस सिस्टम) बिंदु उत्परिवर्तन पैदा करते हैं और दस्तक में विशिष्ट में संशोधन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जीनोम 29 के क्षेत्रों के। पहले से ही बी के लिए स्थापित किया गया है जो कैद में amphioxus के साल के दौर प्रजनन, की आवश्यकता होगी ये प्रयास belcheri 11,30 और बी 30,31 japonicum और वर्तमान ए के लिए विकसित किया जा रहा है lucayanum, बी floridae और amphioxus प्रजातियों बी, यहाँ विशेष रुप से प्रदर्शित lanceolatum 32।

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Acknowledgments

लेखकों पशुपालन के लिए "Animalerie सेंट्रेल डे Gif सुर वेट्टी" द्वारा समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम में यूरोपीय संघ FP6 अनुदान "Embryomics" द्वारा और ANR अनुदान "द्वारा, माइकल Schubert के लिए ANR (ANR-09-Blan-0262-02 और ANR-11-JSV2-002-01) से धन द्वारा समर्थित किया गया ANR- जीन फ़्राँस्वा निकोलस और नादिन Peyriéras करने के लिए 10-Blan-121,801 देव-प्रक्रिया "। जोआओ एमानुएल कार्वाल्हो एक एफसीटी डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा वित्त पोषण किया है (SFRH / बी / 86878/2012)।

यहाँ वर्णित वैक्टर के लिए अनुरोध लेखकों को सीधे संबोधित किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
35 mm Petri dishes Falcon 353001 Culture-treated
Filtration unit (Stericup 1 L) Fisher W21719 0.22 μm
Spin-X tubes Costar 8160 0.22 μm
Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries WPI E212
Pasteur pipettes 230 mm long
Aspiration tube Dutscher 75056
Capillaries for injection needles Sutter BF 120-94-10 Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm
Reagents
Low-melting agarose Sigma A9414
Phenol Red Sigma 114537
Glycerol Sigma G2025
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma P9155
H2O, DNase/RNase-free Gibco 10977-035
mMessage mMachine SP6 Transcription kit Ambion AM1340 mRNA synthesis kit
Phenol pH 8 Sigma P4557
24:1 chloroform:isoamylic alcohol Sigma C0549
5:1 phenol pH 4.7:chloroform Sigma P1944
Reef Crystal salts (200 kg) Europrix  Commercial salts
NaHCO3 Sigma S6014
Equipment
Fluorescent dissecting scope with 200X magnification Leica MZ16F 25X oculars, DSR and GFP2 filters
Micromanipulator Marzhauzer M-33
Injector Picospritzer model II or III
Needle puller Sutter P97 Heating-filament needle puller
Fine forceps Fine Science Tools GmbH 11252-30 Dumont #5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकास जीवविज्ञान अंक 95 Amphioxus cephalochordate जीन अभिव्यक्ति वैक्टर, microinjection के प्रोटोकॉल मॉडल जीव
फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति में<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Unfertilized Oocytes में mRNA इंजेक्शन द्वारा
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Hirsinger, E., Carvalho, J. E.,… More

Hirsinger, E., Carvalho, J. E., Chevalier, C., Lutfalla, G., Nicolas, J. F., Peyriéras, N., Schubert, M. Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes. J. Vis. Exp. (95), e52042, doi:10.3791/52042 (2015).

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