Summary
Мы сообщаем здесь надежную и эффективную экспрессию флуоресцентных белков после инъекции мРНК в неоплодотворенные ооциты в Branchiostoma lanceolatum. Развитие техники микроинъекции в этом базальной хордовых проложит путь для далеко идущих технические новшества в этой новой модельной системе, в том числе в естественных изображений и геноспецифических манипуляций.
Introduction
Во время разработки, одна клетка порождает весь организм в очень сложного процесса, который включает в себя как деления клеток и движений. Чтобы лучше понять биологические принципы, лежащие в основе динамики поведения клеток, онтогенетики начали использовать флуоресценцию на основе методам естественных изображений. Конкретные отделения клеток, такие как клеточные мембраны, либо могут быть помечены с помощью лечения, с флуоресцентными красителями, подход препятствует отсутствие специфичности и проникновения в ткани 1, или конкретной введения в зародыше экзогенных мРНК, кодирующих флуоресцирующие белки 2. Различные методы могут быть использованы для эффективной доставки экзогенных соединений, таких как мРНК. Они включают, но не ограничиваются ими, микроинъекции, электропорации, бомбардировки микрочастицами, липофекция и трансдукции 3,4. Хотя все эти подходы могут быть использованы для введения экзогенных соединений вразвивающегося эмбриона, только микроинъекции позволяет использовать предопределенные и точных количествах в каждой ячейке 3. Методы Микроинъекция были описаны для всех основных моделей развития систем 4 (например, плодовые мушки, нематоды, данио, лягушек, мышей), а также для некоторых альтернативных моделей 4, в том числе те, которые используются для сравнительных исследований, направленных на понимание эволюции механизмов развития (например, морские анемоны, кольчатые черви, морские ежи, асцидии оболочники, Бесчерепные ланцетника).
Cephalochordates, которые вместе с оболочников и позвоночных животных устанавливают хордовых Тип, особенно хорошо подходят модели для изучения эволюции хордовых и диверсификации позвоночных от беспозвоночных предка 5-8. Бесчерепные линия разошлись очень рано в процессе эволюции хордовых; и дошедшие до нас cephalochordates, которые подразделяются на три рода (отрубиchiostoma, Asymmetron и Epigonichthys), напоминают позвоночных как в плане общей анатомии и генома архитектуры 5-8. Из около 30 видов cephalochordates, которые были описаны до сих пор, пять доступны для эмбриологических и развития исследований 6,9: Asymmetron lucayanum (Багамы ланцетника), Branchiostoma floridae (ланцетника Флорида), Branchiostoma lanceolatum (Европейский ланцетника), Branchiostoma belcheri (китайский ланцетника) и Branchiostoma japonicum (Японский ланцетника). Спелые взрослые трех этих видов (B. lanceolatum, Б. belcheri и B. japonicum) может быть вызван на нерест по требованию в течение сезона размножения 10,11. Кроме того, по крайней мере для В. lanceolatum, эффективный нерест может также быть вызван в искусственной морской воде 12, тем самым делая это конкретные виды Бесчерепные доступны для лаборатох годов, которые не имеют доступа к естественной морской воде. Сочетание в В. lanceolatum, удобного и надежного доступа к эмбрионам эффективного способа доставки, таких как микроинъекции, до сих пор единственным методом доставки разработаны в ланцетника (как Б. floridae и Б. belcheri) 13-15, будет способствовать развитию Роман набор манипулятивных техник, в том числе клонов tracing- и поведенческих подходов, основанных на динамический клеток.
Протокол для эффективного микроинъекции мРНК, чтобы выразить флуоресцентные белки в B. lanceolatum эмбрион, следовательно, разработан. Кроме того, для обеспечения базового инструментария для живого изображения В. эмбрионы lanceolatum, векторные системы были разработаны, которые позволяют ассоциированный с мембранами и ядерная выражение флуоресцентных белков. Для мембраны таргетинга, усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) был слит с коробкой человека HRAS CAAX и ядерной локализации mCherry и EGFP былополучены путем слияния с данио гистонов 2B (H2B) экзона (рис 1, дополнительном файле 1). Кроме того, с целью оптимизации трансляции белка, последовательности Козака и кодоны конструкций были изменены и приспособлены к использованию в В. lanceolatum. Взятые вместе, методом литья и векторы экспрессии, представленные здесь, служат в качестве основы для создания новых экспериментальных подходов к cephalochordates, в частности, анализ с использованием последней флуоресценции основе в технике естественных изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка инструментов и реактивов
- Трансфер пипетки Пастера
- Создать серию передачи пипетки Пастера с различными диаметрами наконечника, потянув 230 мм в длину пипетки Пастера над пламенем на разных скоростях. Убедитесь, что конус является как можно дольше для плавного и точного контроля аспирации.
- С алмазной писца, поцарапать пипетки вдоль линии, перпендикулярной к длине пипетки. С обеими руками, потяните пипетки параллельно его длине, чтобы создать тупой срез. Быстро пламени польский пипетки без уплотнения наконечника.
- Вары диаметр наконечника со стадией ооцитов / эмбрионов, которые будут пипеткой: 300-400 мкм для неоплодотворенных яйцеклеток (около 150 мкм в диаметре), 600 мкм для оплодотворенных яиц (около 500 мкм в диаметре), 200-400 мкм для заштрихованной neurulae. Используйте пипетки со ртом-контроль аспирации трубки для передачи ооцитов / эмбрионов из одной тарелкис другой.
- Иглы для инъекций
- Манипулировать капилляры перчатки, чтобы обеспечить РНКазы условия. Используйте боросиликатного стекла с накаливания капилляров с размерами OD 1,20 мм, ID 0,94 мм, длина 10 мм.
- Если капилляры вытащил от типа нагрева нити иглы съемника, описанной в список материалов, используйте следующие параметры: Heat 600, Pull 50, скорость 80, 60 Время, давление 200 или 300. В противном случае, убедитесь, что форма, которая является решающее значение для успешных инъекций, выглядит, как показано на рисунке 2 со следующими свойствами: 4-8 мкм Наружный диаметр наконечника, 2 см длиной заостренной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы могут быть выведены до нереста и используется на протяжении всего сезона.
- 5% Фенол красный раствор (4x)
- Подготовка свежий перед каждым нереста.
- В мкм-фильтрации трубки 0,22, взвесить 25 мг фенола красного порошка.
- Добавить 0,5 мл DNase- и РНКазы свободной воды длятрубка, содержащая порошок.
- Спин в течение 3-5 мин при 18000 х г при комнатной температуре, фильтруют, стерилизуют раствор и удалить кристаллы, которые могут засорить инъекционной иглой.
- Хранить при 4 ° С или хранить 250 мкл аликвотах при -20 ° С.
- 0,25 мг / мл поли-лизина раствор
- Подготовка свежий перед каждым нереста.
- Растворите 5 мг поли-L-лизина в 20 мл дистиллированной воды. Магазин 5 мл аликвоты при -20 ° С.
- Использование сразу размороженный аликвоты и только один раз, чтобы гарантировать воспроизводимое и надежное сцепление ооцитов к поли-лизин покрытием блюдо.
- синтез мРНК
- Подготовка свежий перед каждым нереста.
- Линеаризовать 5 мкг ДНК интереса с адекватной фермента (как правило, в течение 2 часов, при 37 ° С). Чтобы проверить полноту пищеварения, запустите 2% в объеме пищеварения смеси на 1% агарозном-TBE геля в КЭ буфера при 150 Вт в течение 20 мин.
- Извлеките Lineaавторизованного ДНК с 25: 24: 1 фенол (рН 8,0): хлороформ: изоамиловый спирт. Vortex в течение 20 секунд, центрифуги 10 мин при 18000 мкг и собрать водную (верхнюю) фазу.
- Экстракт водную фазу снова 24: 1 хлороформ: изоамиловый спирт. Вихревые в течение 20 сек, центрифуги 10 мин при 18000 х г и собирают водную фазу.
- Осадок линеаризованной ДНК с 100: 10: 300, линеаризованной ДНК: 3 М ацетата натрия (рН 5,2): 100% этанола в течение ночи при -20 ° С.
- Центрифуга 20 мин при 18000 х г при 4 ° С. Промыть в 70% этаноле.
- Центрифуга 10 мин при 18000 х г при 4 ° С. Пусть сухой и ресуспендируют в РНКазы свободной воды в конечной концентрации 0,5 мкг / мкл.
- Расшифруйте 1 мкг линеаризованной ДНК с использованием мРНК синтез комплект с соответствующей полимеразы, в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Выписка мРНК с 5: 1 фенола (рН 4,7): хлороформ и этилацетат аммония универсальное решение, входящие в комплект.
- Vortex в течение 20 секунд, CEntrifuge 10 мин при 18000 х г и собирают водную фазу.
- Экстракт водную фазу снова 24: 1 хлороформ: изоамиловый спирт. Вихревые в течение 20 сек, центрифуги 10 мин при 18000 х г и собирают водную фазу.
- Осадок мРНК с 100% изопропанола в течение ночи при -20 ° С.
- Центрифуга 20 мин при 18000 х г при 4 ° С. Промыть в 80% этанола.
- Центрифуга 10 мин при 18000 х г при 4 ° С. Пусть гранул высохнуть при комнатной температуре не более чем на 5-10 мин, как тогда будет трудно ресуспендирования. Ресуспендируют в DNase- и РНКазы воды до конечной концентрации по меньшей мере 2 мкг / мкл, чтобы обеспечить достойное конечной концентрации мРНК в смеси инъекции.
- Для проверки качества и размер транскрипции продукта, работать 0,5 мкл мРНК на РНКазы 1% агарозном-TBE гель в TBE буфере при 150 Вт в течение 20 мин. Магазин 2 мкл аликвоты при -80 ° С.
- Поли-лизин-покрытием блюда
Примечание: поли-лизин-СоА-Тед блюда используется для иммобилизации ооцитов во время инъекции.- Для каждого 35 мм клеток культуральной чашке Петри (5) в целом, покрывают дно чашки Петри с 1 мл талой 0,25 мг / мл поли-лизин раствора. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Для каждого 35 мм культивирования клеток Петри (всего 5), передача 0,25 мг / мл поли-лизин раствор в другой 35 мм культивирования клеток Петри. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Откажитесь от 0,25 мг / мл поли-лизин решение.
- Пусть чашки Петри сухой, вверх-вниз при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Хранить поли-лизин покрытием блюда, завернутый в полиэтиленовую пленку при 4 ° С, чтобы избежать загрязнения в течение одной недели максимум.
- Агарозные покрытием блюда
ПРИМЕЧАНИЕ: Они используются для культивирования вводили эмбрионов. Агарозы обеспечивает подушку для инъекции эмбрионов и предотвращает их прилипание к нижней части блюда.- Сделать искусственное морской воды (ASW) с помощью 37-38 г / л коммercial соли + 0,25 мм NaHCO 3 в обратного осмоса воды.
- Растворить агарозы с концентрацией 1% в 0,22 мкм фильтровали ASW нагреванием раствора в микроволновой печи.
- Быстро влить теплую раствора агарозы с одной 35 мм чашки Петри в другую, чтобы обеспечить очень тонкий агарозном покрытие тарелки.
- Хранить в агарозном покрытием блюда, завернутые в Saran Wrap при 4 ° С, чтобы избежать загрязнения в течение одной недели максимум.
- Смесь для инъекций и погрузка инъекционных игл
- Около 2 ч до начала инъекции, сделать 2 мкл смеси для инъекций в RNase- и ДНКазы бесплатно воду с конечной концентрации 1-1,8 мкг / мкл мРНК, 15% глицерина, 1,25% фенола красного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный цвета раствора, который позволяет осуществлять мониторинг эффективности впрыска и идентификации успешно вводили эмбрионов. Глицерин способствует мРНК диффузии в яйцеклетки. - Центрифуга 4 мин при 18000 мкг напеллетах кристаллы. Держите на льду до использования.
- С 10 мкл пипетки, собирают 0,5 мкл смеси для инъекций, избегая дно трубки, где кристаллы были гранулированной.
- Засыпка по меньшей мере, две иглы для инъекций (в случае, если один перерывы во время инъекции) с помощью пипетки капли 0,5 мкл инъекции смеси на большое отверстие от иглы.
- Установка иглы в запоминающем банку с жидкостью в нижней части при 4 ° С, чтобы предотвратить испарение смеси инъекции. Пусть смесь медленно инъекции поездки в кончике инъекционной иглой, по крайней мере, 1 часа, чтобы свести к минимуму образование пузырьков.
- Магазин дополнительное соединение впрыска при -80 ° С в течение не более трех дополнительных применений, после чего качество ухудшается мРНК (данные не показаны).
- Около 2 ч до начала инъекции, сделать 2 мкл смеси для инъекций в RNase- и ДНКазы бесплатно воду с конечной концентрации 1-1,8 мкг / мкл мРНК, 15% глицерина, 1,25% фенола красного.
2. Сбор биологического материала, микроинъекции и культивирования эмбрионов
- Яйцеклетка и сперматозоид коллекция
ПРИМЕЧАНИЕ: См Theodosiouи др. 12 для детального протокола для индукции нереста и для сбора гамет.- Ударные мужчины и женщины в ASW при температуре 23 ° С в течение 24 ч.
- Один-два часа до захода солнца, передают взрослых в отдельные чашечки в ASW на 19 ° С, так как большинство взрослых будут появляться 1-2 часа после захода солнца.
- Промыть 35 мм чашки Петри с фильтром ПАВ и дайте им высохнуть в обратном порядке, чтобы предотвратить ооциты от прилипания к нижней части блюда.
- По нереста, немедленно собрать сперму и яйцеклетки с 1000 мкл пипетки.
- Хранить сперму и ооциты отдельно от взрослых Amphioxus поскольку контакт является вредным для здоровья гамет (данные не показаны).
- Кроме того, не вспугнуть взрослых, что приводит к движениям, которые рассеивают, и, следовательно, разбавить, как сперматозоиды и яйцеклетки. Чтобы сохранить сперму активным до тех пор, насколько это возможно, и для оптимизации скорости оплодотворения, сбора спермы, как концентрируют, насколько это возможно.
- Держатьспермы на льду в 1,5 мл пробирку.
- Трансфер ооциты с фильтром ПАВ в предварительно промыть 35 мм чашки Петри.
- Передача 100-500 ооцитов с передачи пипетки Пастера ранее вытащил 300-400 мкм, еще 35 мм чашки Петри для выполнения инъекций.
- Оплодотворите остаток муфты в качестве контроля для спермы и качества ооцитов или для других экспериментов.
- Инъекции ооцитов
- Установка инъекционной иглы на микроманипулятором на 50 ° по отношению к горизонтальной плоскости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Углы менее 50 ° подтолкнет ооциты вокруг на блюдо, в то время как углы более 50 ° не позволит соответствующий контроль за положением иглы по отношению к яйцеклетке. - Под флуоресцентным рассекает рамки с 25x окулярами, трансфер 30 ооцитов с передачей пипетки Пастера 300-400 мкм на поли-лизин покрытием чашки с фильтрованной ASW.
- Депозит ооциты вдоль линии для выполненияиз инъекции в упорядоченном пути и отличить впрыскивается из неинъекционные ооцитов. Вводят небольшое количество (30 ооцитов), чтобы минимизировать время экспозиции ооцитов с поли-лизина, который имеет тенденцию к деформации развивающихся эмбрионов (данные не показаны).
- Используйте темного поля, чтобы сделать ооциты как полупрозрачные, насколько это возможно.
- С грубой движения ручки на микроманипулятора, довести инъекционной иглы близко к яйцеклетке.
- С тонким пинцетом, разрезать иглу на уровне, где наконечник начинает быть изогнуты. По пульсирует с инжектором, убедитесь, что красный смесь инъекции на самом деле течет из иглы.
- В 200-кратное увеличение и тонкой движения ручки на микроманипулятора, осторожно двигаться инъекционной иглы внутри ядра ооцита.
ПРИМЕЧАНИЕ: при слишком поверхностно, вводят решение не будет оставаться внутри яйцеклетки. Если вставлена слишком далеко, яйцеклетка будет уничтожен. - Вводите 1-3 импульсов 120 мс duratионов и 1-10 давление фунтов на квадратный дюйм. Если игла достаточно хорошо, придать с непрерывным потоком при постоянном давлении. Убедитесь, что объем инъекции соответствует 1/5 до 1/3 объема одного ооцита.
- После инъекции, вытащите иглу быстро, чтобы избежать утечки яйцеклетки.
- Убедитесь, что введен раствор остается в яйцеклетке и что после нескольких секунд, вводят раствор распространяется по всему яйцеклетки.
- Переходите к следующему яйцеклетки в очереди.
- Держите некоторые неинъецированных эмбрионов каждой серии в качестве отрицательного контроля для оценки фоновой флуоресценции при сканировании введенных эмбрионов.
- Установка инъекционной иглы на микроманипулятором на 50 ° по отношению к горизонтальной плоскости.
- Оплодотворение, выбор инжектированных эмбрионов и культивирования эмбрионов
- Оплодотворить яйцеклетки, как только серия была введена. Поскольку качество яйцеклеток снижается со временем, внедрить и оплодотворить яйцеклетки в течение 1 ч после нереста 12.
- В зависимости от концентрации сперматозоидов, добавить 1-5 капли спермы и ооцитоввихревой блюдо.
ПРИМЕЧАНИЕ: оплодотворение конверт должен стать очевидными на зародышах примерно через 1 мин. - Разрешить эмбрионов для отсоединения от поли-лизин покрытием блюдо, при введении очередную серию ооцитов.
- Трансфер эмбрионов с мкм передачи пипетки Пастера 600 в агарозном покрытием чашке Петри. Удалить эмбрионов из поли-лизин покрытием блюдо как можно быстрее, если это вообще возможно до стадии 2-клеток.
Примечание: В случае длительного воздействия поли-лизина, эмбрионы имеют тенденцию становиться плотно упакованы blastulae, плоские на стороне касаясь дно тарелки. - В 2-клетки до 4-клетки шаге выберите флуоресцентным рассекает рамки с DSR фильтровать успешно впрыском эмбрионов, то есть те, с нормальной морфологией, которые проявляют фенол красный производный красный сигнал флуоресцентного.
- Держите эмбрионов в культуре с фильтром ПАВ в агарозном покрытием чашки Петри при 19 ° до нужной стадии дляв естественных изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол подробно выше, обеспечивает основу для микроинъекции В. lanceolatum ооциты и, следовательно, для введения в разработке В. lanceolatum эмбрионы мРНК, кодирующей флуоресцентные белки для визуализации в естественных условиях. Хотя этот метод, безусловно, прочный и надежный, скорость успешных инъекций с использованием этого протокола остается переменной (таблица 1). Очень вероятным объяснением этого интригующего факта крайняя изменчивость ооцитов лап: разные партии яйца действительно ведут себя очень по-разному, когда подвергается воздействию давления впрыска. Некоторые ооциты, а эластичным и, как правило, для выравнивания в нижней части тарелки, в то время как другие являются достаточно жесткими и остается круглой после инъекции. Кроме того, некоторые ооцитов партии, как правило, раздувают их хориона мембраны после инъекции, в то время как другие просто лизируют (данные не показаны). Нет очевидной корреляции не могут быть установлены между поведением ооцитов после инъекции и эмбриональныхразвитие после оплодотворения. Таким образом, трудно предвидеть, к какой категории ооцитов лучше всего подходит для микроинъекции. Однако после оплодотворения эмбрионы, подвергающиеся нормальному развитию могут быть определены уже в стадии расщепления: 2-элементная эмбрионов 4-элементная стадии можно считать нормальным, когда поверхность контакта между бластомеров невелика, в то время как уплотненной расщепление стадии эмбриона, когда отдельные клетки трудно различить, безусловно, является ненормальным.
В наших руках, около половины из ооцитов не пережить травмы, вызванной инъекцией и около половины эмбрионов, которые выживают инъекции, обладают весьма своеобразным флуоресцентную метку. Таким образом, мы считаем, что с этим протоколом инъекции, между 50 и 120 эмбрионы могут быть успешно введен на данном нереста день уступая между 15 и 60 меченых эмбрионов.
Красной флуоресценции фенола красного в 2-клетки эмбрионов 4-элементная стадии очень надежно отмечает эмбрионов, которые имеютнадлежащим образом вводили, как 100% от зародышей, отобранных таким образом, затем производят флуоресцентные белки, кодируемые впрыскиваемого мРНК. Кроме того, существует очень четко положительная корреляция между интенсивности фенолового красного флуоресценции на 2-клеток к 4-клетки стадии и времени начала флуоресценции, полученного путем белков, кодируемых мРНК впрыскиваемого. Таким образом, это соотношение позволяет идентифицировать тех эмбрионов, которые получили наибольшее количество мРНК в процессе инъекции.
Если сигнал флуоресцентного белка, кодируемого нагнетаемой мРНК не обнаруживается после выбора фенола Red-положительных эмбрионов, мы рекомендуем, чтобы запустить соединение впрыска на РНКазы без геля для того, чтобы проверить деградации мРНК или захвата (рис 3) , В переулке 1, без изменений мРНК полоса обнаружено. Введение этой смеси привела к сильной флуоресцентного сигнала в эмбрионе. Напротив, в полосе 2, который соответствует другому экспериментальт, где Фенол красный был заменен Dextran красителя в смеси (см обсуждения для получения дополнительной информации), мРНК, кажется, были захвачены красителя декстран и инъекции этой смеси не привела к флуоресцентного сигнала в зародыше.
Используя эту технику микроинъекции и наши конструкции (таблицы 2 и 3, дополнительном файле 1) (см обсуждения), мы можем, таким образом, воспроизводимо производить однородную флуоресцентных меток на протяжении эмбриона с mCherry или EGFP в ядре и с EGFP в мембране (рис 4) , Протокол изображения используется для генерации фиг.4 будет описана в другом месте (Фор и др., В настоящее время в процессе подготовки). В зависимости от количества мРНК инъекций, выражение флуоресцентный белок, как правило, становится обнаружить между 16-клетки (фиг.4А) и стадии 64-клеток и остается обнаружить по крайней мере, до стадии поздней нейрулы (данные не показаны). На более поздних стадиях не были проверены. Ядерная сигналкак правило, появляется раньше, чем мембраны сигнала, потенциально из-за своей природе диффузного природы мембраны по сравнению с компактной природе ядра (данные не показаны). Хотя он не был проведен мониторинг систематически, эмбрионы вводят как ядерная и этикетки мембраны кажутся менее здоровыми, чем эмбрионов введенных исключительно с меткой ядерной EGFP. Интересно, что этот эффект, как представляется, зависит от общего количества мРНК введенного как общее количество впрыскиваемого мРНК такой же, независимо от того один или два вида мРНК включены в смесь (данные не показаны).
Рисунок 1: Построить детали. Эскизы (а) мембрана, ориентированные EGFP (EGFP: CAAX коробка), (B) ядерного целевых EGFP (H2B: EGFP) и (C) ядерного направлены mCherry (H2B: mCherry) создает ARе показано на рисунке.
Рисунок 2: Форма репрезентативной инъекционной иглой. () Конуса составляет около 2 см в длину и кривые иглы на конце. Шкала бар = 2 мм. (В) Увеличение в штучной упаковке в области А. Положение для стрижки иглы (стрелки) в кривой иглой. Кончик иглы обозначается стрелкой. Масштабная линейка = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3:. Взаимодействие мРНК и отдельные флуоресцентные красители () Результат миграции смеси, содержащей мРНК и фенола красного в полосе 1 имРНК и Texas Red декстран (в конечной концентрации 3,3 мг / мл) на дорожке 2. (В) из-за миграции смеси, содержащей мРНК и Орегон Зеленый декстран (в конечной концентрации 3,3 мг / мл) в полосе 3, мРНК и FITC декстрана (в конечной концентрации 3,3 мг / мл) в полосе 4 и мРНК и родамина декстрана (в конечной концентрации 3,3 мг / мл) на дорожке 5. Гель время миграции в А и В было отличается. Для ясности, черный прямоугольник в A масок отражения света и пунктирные линии разграничения миграции полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: 3D-рендеринга (программное обеспечение Amira) эмбрионов Amphioxus вводили мРНК, кодирующей флуоресцентных белков Изображения.извлечены из 3D временных погрешностей, полученных на оптимизированной Leica SP5 2-фотонов лазерного сканирующего микроскопа стадии (а) 16-клеток эмбриона экспрессии ядерного H2B:.. EGFP (В) гаструлы стадии эмбриона экспрессии ядерного H2B: mCherry и мембрана-мишенью EGFP:. CAAX коробка (C) гаструлы стадии эмбриона выражения ядерной H2B: mCherry и EGFP мембраной целевой: CAAX окно. Оптический раздел показывает внутренние клетки с ядерной mCherry и ассоциированных с мембранами EGFP сигналов. Масштабная линейка = 50 мкм.
| Номер эксперимента | Введенный конструкция мРНК | Количество вводимых эмбрионов | Количество меченых эмбрионов |
| 1 | H2B: EGFP | 53 | 23 |
| 2 | H2B: EGFP | 50 | 31 |
| 3 | H2B: EGFP | 48 | 20 |
| 4 | H2B: EGFP | 54 | 24 |
| 5 | H2B: EGFP | 114 | 47 |
| 6 | H2B: EGFP | 80 | 46 |
| 7 | H2B: EGFP или | 62 | 24 |
| H2B: mCherry + EGFP: CAAX окно | |||
| 8 | H2B: EGFP | 87 | 60 |
| 9 | H2B: EGFP | 77 | 45 |
| 10 | EGFP: CAAX коробка или | 110 | 51 |
| H2B: mCherry + EGFP: CAAX окно | |||
| 11 | H2B: mCherry + EGFP: CAAX окно | 45 | 26 |
| 12 | H2B: mCherry + EGFP: CAAX окно | 52 | 16 |
| 13 | EGFP: CAAX коробка или | 74 | 35 |
| H2B: mCherry + EGFP: CAAX окно | |||
| Общий | 906 | 448 | |
| Успех ставка | 49% |
Таблица 1:. Показатели успеха инъекции вводили конструкции, количество вводимых зародышей, которые пережили инъекции и количество меченых (или успешно вводили) эмбрионов указаны, как это общий процент успешных инъекций.
| Строить | Положение в PCS2 + вектор | Исходной последовательности | Мутация последовательность |
| PCS2 + EGFP: CAAX окно | 79..87 | GGA TCC ACC | ACC GT C C |
| PCS2 + H2B: EGFP | 82..90 | TCC GAC ACG | CC G T C AC |
| PCS2 + H2B: mCherry | 82..90 | TCC GAC ACG | CC G T C AC |
Таблица 2:. Ориентировочное оптимизация последовательностей Козак Оригинальный и мутировавшие последовательности Козак указаны для каждой конструкции. Введенные мутации восстановить последовательность Козака о В. ген актина lanceolatum, что очень напоминает, что из предполагаемой теоретической предпочтительного Козака последовательности ланцетника (/ CGA / CG / TTC / GAC ATG TG / КТ).
| PCS2 + EGFP: CAAX окно | |||
| Оригинал кодон | Мутации кодона | Положение в PCS2 + вектор | |
| (Уровень использования) | (Уровень использования) | ||
| GTA | GT G | 154..156 | EGFP последовательность |
| (0,08) | (0,43) | ||
| AGA | AG G | 814..816 | Linker |
| (0,09) | (0,27) | ||
| PCS2 + H2B: EGFP | |||
| Оригинал кодон | Мутации кодона | Позиция вPCS2 + вектор | |
| (Уровень использования) | (Уровень использования) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B последовательность |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | H2B последовательность | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 568..570 | EGFP последовательность | ||
| CTA | КТ G | 226..228 | H2B последовательность |
| (0,06) | (0,51) | ||
| PCS2 + H2B: mCherry | |||
| Оригинал кодон | Мутации кодона | Положение в PCS2 + VЭктор | |
| (Уровень использования) | (Уровень использования) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B последовательность |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | H2B последовательность | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 913..915 | mCherry последовательность | ||
| CTA | КТ G | 226..228 | H2B последовательность |
| (0,06) | (0,51) | ||
Таблица 3: Предварительные оптимизации использования кодонов. Оригинальные и мутировавших кодоны указаны для каждой конструкции. В то время как это не было экспериментально проверены, представил mutatiДополнения предназначены для оптимизации трансляции мРНК в ланцетника.
Дополнительная Файл 1: Построить последовательности нуклеотидных последовательностей (а) мембрана, ориентированные EGFP. (EGFP: CAAX коробка), (B) ядерного целевых EGFP (H2B: EGFP) и (C) ядерного направлены mCherry (H2B : mCherry) конструкции приведены в контексте шт.2 векторных позвоночника. Основные области, кодируемые каждой из конструкций указаны в цвете: EGFP (зеленый), mCherry (красный), мембраны локализации сигнал от человека HRAS (CAAX поле) (голубой синий), данио гистонов 2B экзон (H2B) (желтый).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представляем, впервые, подробный и воспроизводимый протокол для инъекций В. lanceolatum ооциты, которые, после B. floridae 13,14 и B. belcheri 15, таким образом, что третий вид Amphioxus, для которых такой способ был описан. Важно отметить, что протокол, описанный здесь, также включает в себя описание векторных систем подходит для производства флуоресцирующих белков в B. lanceolatum от вводили мРНК, полученных в пробирке (описано ниже). Вместе, эти новые инструменты позволяют в естественных изображений раннего развития ланцетника и анализа динамического поведения клеток, которые лежат в основе ранних морфогенетические события в зародыше, таких как расщепление и гаструляции.
В общем, метод микроинъекции имеет преимущество позволяет доставку, в клетку-мишень, из заранее определенного объема конкретного соединения. При этом, как спомощь, один из основных ограничений этого метода является ограниченное число клеток, которые могут быть введены в течение данного эксперимента. Например, протокол, описанный здесь В. lanceolatum позволяет инъекцию 100 до 120 яиц на одну инъекцию сессии, из которых приблизительно половина будет меченых (таблица 3). Для В. floridae, число очень похожи на 500 или более яиц, которые могут быть введены в день, из которых более 50% выживут инъекции 13,14. Хотя протоколов для потребителей инъекционных B. lanceolatum и B. floridae яйца напоминают друг друга, В. belcheri техника несколько отличается: яйца размещаются на поли-лизин покрытием покровные и инъекции проводятся под инвертированным микроскопом с использованием microinjector другого производителя. Этот подход, по-видимому позволяет инъекцию между 200 и 300 В. belcheri яиц в инъекции сессии с выживаемостью, после вылупления на стадии нейрулы, уплотнительныеF 89.39% до 95.83% 15. Учитывая различия в протоколах, это трудно понять, являются ли различия в показателях успеха из-за видовых различий, связанных с или по протоколам. Можно было бы тестировать различные виды параллельно с различными протоколами, чтобы ответить на этот вопрос. Тем не менее, для дальнейшего увеличения числа ооцитов целевых для доставки экзогенных соединений, другие протоколы должны быть разработаны для Amphioxus. Методы кандидаты включают электропорацию, бомбардировку микрочастицами, липофекцией и трансдукции 4. Следует отметить, что электропорации уже было установлено в качестве стандартного метода для введения экзогенного материала в оплодотворенных асцидии оболочника яйца, другой беспозвоночных модель хордовых используется для изучения эволюции механизмов развития 8.
Для успешного микроинъекции и последующей визуализации в естественных условиях флуоресцентных белков, пригодныхвекторы экспрессии обязательным условием. С этой целью три плазмиды были разработаны и экспериментально подтверждено (рис 1, Дополнительное файла 1): для мембранного таргетинга, ген EGFP был слит на своем 3'-конце к человеческому поле HRAS CAAX (в результате чего EGFP: CAAX коробки конструкции ) 16 и, по ядерной таргетинга, как EGFP и гены mCherry сливали на их 5 'концов к данио гистонов 2B (H2B) экзона (полученного, соответственно, в H2B: EGFP и H2B: mCherry конструкция) 17. Каждый из этих конструкций был клонирован в плазмиду шт.2 + содержащего SV40 сайт полиаденилирования поздно и SP6 промотора, позволяющую в пробирке ограничен мРНК синтеза 18,19. Кроме того, с целью оптимизации перевод конструкций в В. lanceolatum, как последовательности Kozak и кодоны были адаптированы с помощью одного нуклеотида мутагенеза (таблицы 2 и 3, дополнительный файл 1). Basред на подходе по Накагава 20, небольшим бассейном В. Гены lanceolatum анализировали, чтобы определить предпочтительную последовательность Козака у этого вида. Наиболее близким известным в природе последовательности с этой теоретической последовательности предпочтительного является то, что в B. lanceolatum ген актина. Козака последовательности трех конструкций были, следовательно, изменяется в соответствии с этой последовательностью гена актина. Кроме того, использование кодонов В. lanceolatum была проанализирована с использованием базы данных использования кодонов 21 и кодоны в конструкциях с вероятностью низкое потребление в В. lanceolatum (<10%) были заменены там, где это возможно, эквивалентных кодонов с более высокой вероятностью использования.
Результаты инъекций показывают, что уровень экспрессии белка из этих векторов является подходящим для анализа в естественных изображений. Учитывая, что выход выражение модифицированных векторов не по сравнению с немодифицированных конструкций, мы не можем подставитьзаключить об эффективности изменений, которые были внесены в консенсусе Козака и кодирующих последовательностей. Конечно, было бы интересно проверить, действительно ли эти изменения оказывают влияние на уровень экспрессии белка. Вдоль этих линий, недавний анализ основывается на микроинъекции в B. belcheri предполагает, что другие, немодифицированные векторы также могут быть использованы для синтеза мРНК флуоресцентного белка в производстве Amphioxus 15.
Amphioxus содержит эндогенные зеленые флуоресцентные белки 22. Эмбрионы поэтому проявляют низкий уровень зеленого, а также красную флуоресценцию (наши неопубликованные данные). Тем не менее, эти эндогенные уровни незначительным по отношению к уровням флуоресценции в результате инъекции мРНК из наших конструкций. Таким образом, эндогенные флуоресценции эмбрионов ланцетника не беспокоить экспериментальные наблюдения с использованием флуоресцентных бинокль или микроскоп мульти-лазерного сканирования. В дополнение, Эксперименты показывают, что инжекции интенсивность флуоресценции экзогенного генерируемого мРНК инъекции зависит от фактического количества впрыскиваемого материала, который непосредственно коррелирует с конечной концентрации мРНК, используемого в смеси инъекции. B. Эмбрионы lanceolatum, как правило, переносят концентрацию до 1,8 мкг / мкл мРНК, хотя, зависит от действительной концентрации мРНК, некоторые комбинации мРНК-видимому, меньше, переносимой В. lanceolatum эмбрионов, чем другие. Таким образом, сочетание атомной mCherry и мембранных EGFP мРНК оказались более токсичными, чем инъекции только ядерного EGFP.
Техасский красный декстран ранее использовалось в качестве индикатора для успешных инъекций в Amphioxus ооцитов 13-15. Интересно, что флуоресцентный сигнал выводится из введенного мРНК и не был получен после инъекции растворов, содержащих Texas Red декстран и это в обоих Amphioxus ооцитов (N = 4) и опытов zebrafiэмбрионы SH (п = 3 эксперименты). При инъекционный раствор, содержащий смесь в пробирке транскрибируется мРНК и техасский красный декстран загружается на РНКазы агарозном геле (фиг.3, дорожка 2), полоса, соответствующая мРНК отсутствует. В отличие от этого, в пробирке транскрипции мРНК можно обнаружить на РНКазы агарозном геле в присутствии фенолового красного (фиг.3, дорожка 1). Учитывая, что нет никаких доказательств деградации мРНК на геле, эти результаты свидетельствуют о том, что техасский красный декстран, как правило, ловушки мРНК. При использовании в качестве инъекционного раствора, техасский красный декстран может, таким образом, предотвратить перевод впрыскиваемого мРНК. После этого наблюдения, взаимодействие других красителей (FITC декстрана, родамин декстрана и Орегон Зеленый декстрана) с мРНК были испытаны, как на РНКазы агарозном геле и путем инъекции в B. lanceolatum или данио (Рисунок 3). Анализы показывают, что FITC декстран не ловушка мРНК на гель (рис 3, LANе 4), что приводит к экспрессии флуоресцентного белка в данио (п = 1 эксперимент), но не у зародышей В. lanceolatum (п = 1 эксперимент) (данные не показаны). Родамин декстран не ловушки мРНК на геле (фиг.3, дорожка 5), и приводит к экспрессии флуоресцентного белка в эмбрионов данио рерио (п = 1 эксперимент) (данные не показаны), но его активность не может быть проверена, к сожалению, в В. lanceolatum эмбрионов. Наконец, как Орегон Зеленый декстран мигрирует на том же уровне, что и мРНК, мРНК пленения не может быть оценена в агарозном геле (фиг.3, дорожка 3). Этот последний краситель предотвратить экспрессию флуоресцентного белка в Amphioxus (N = 1 эксперимент), но не данио эмбрионов (п = 1 эксперимент) (данные не показаны). В целом, эти данные свидетельствуют о том, что некоторые декстраны может эффективно ингибировать перевод введенного мРНК. Учитывая, что эксперименты доза-реакция не проводились, эти данные являются качественными. Интересно, что это тормозящий эффект, кажется, зависит отвиды животных (рыбок данио против ланцетника), в котором подчеркивается необходимость дальнейших исследований, чтобы понять механизмы, лежащие в основе этого эффекта. Кроме того, эти результаты требуют подготовительных анализов, если декстраны будут использовать в качестве цветовых индикаторов для инъекций.
Развитие техники микроинъекции для данной модели открывает двери для геноспецифических манипуляций. В Amphioxus, например, первое описание микроинъекций (в В. floridae) последовало успешное нокдауна гена, hox1, с использованием олигонуклеотидных морфолино инъекций 23,24. Число B. lanceolatum эмбрионы, которые успешно могут быть введены каждый день, используя протокол, представленный здесь, конечно, совместимый с этим типом обучения. Кроме того, с помощью этих методов и новых конструкций под рукой, можно теперь также разрабатывать и выполнять ГИПЕРЭКСПРЕССИЯ и нокдаун исследования путем инъекции мРНК интерес (Родной язык или доминантной негческие формы) или использовать другие стратегии по срыву экспрессию генов (например microRNA- или стратегий shRNA основе). До сих пор, Amphioxus инъекции могут быть выполнены только на стадии яйцеклетки, просто потому, что это только этап, который может быть эффективно заблокирован. После инъекции на стадии ооцита, представляющая интерес молекула повсеместно экспрессируется в эмбрионе. Таким образом, если экспрессия гена должна быть изменена или мониторинг только в подмножестве элементов, конструкции ДНК должны быть введены, как они выражены мозаично в развивающихся Amphioxus эмбриона 15,25-27. ДНК-конструкции инъекции также могут быть использованы для проверки активности регуляторных областей в процессе разработки Amphioxus в переходных трансгенных анализов, с вышеупомянутым недостатком мозаики выражения 15,25-27.
В конечном счете, методика микроинъекции ланцетника также открывает дверь для стабильный трансгенеза, в том числе целевой нокаут или забивные конкретного генетических локусов. Системас для стабильного введения экзогенной ДНК уже существуют, например, с транспозонов основе системы Tol2 рыбы, что, кажется, функционирует в обоих насекомых и амниот позвоночных 28. Кроме того, подходы, основанные на модифицированных нуклеаз цинкового пальца (-ZFNs) или активатора транскрипции, как эффекторных нуклеаз (Talens) или РНК наведением средствам редактирования генома (CRISPR / CAS системы) может быть использован для создания точечных мутаций и стук в модификации в конкретных области генома 29. Эти усилия требуют круглый год разведение ланцетника в неволе, который уже был установлен на B. belcheri 11,30 и B. japonicum 30,31 и в настоящее время разрабатывается для А. lucayanum, B. floridae и виды Amphioxus признакам здесь, B. lanceolatum 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за поддержку со стороны "Animalerie центрального де Gif-сюр-Иветт" для животноводства. Эта работа была поддержана за счет средств ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 и ANR-11-JSV2-002-01) с Майклом Шуберта, за счет гранта Европейского Союза 6РП "Embryomics" и грантом ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "Жан-Франсуа Николя и Надин Peyriéras. João Emanuel Карвалью финансируется за счет исследовательских стипендий FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
Заявки на векторы, описанные здесь могут быть адресованы непосредственно авторами.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | Culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μm |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 μm |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P9155 | |
| H2O, DNase/RNase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | Sigma | C0549 | |
| 5:1 phenol pH 4.7:chloroform | Sigma | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200X magnification | Leica | MZ16F | 25X oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Fine forceps | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
