Summary
우리는 창고 기의 미 수정 난자에 여기 mRNA의 주입 후 형광 단백질의 강력하고 효율적인 표현을보고합니다. 이 기초 척색에 미세 주입 기술의 개발은,이 새로운 모델 시스템에서 기술 혁신을 광범위한 생체 내 이미징 및 유전자 특이 조작을 포함하여있는 길을 만들어 줄 것입니다.
Introduction
개발하는 동안, 하나의 세포가 세포 분열과 이동을 모두 포함하는 매우 복잡한 공정에서 전체 유기체를 일으킨다. 나은 셀 동작의 역학의 기초 생물학적 원리를 이해하기 위해서, 발달 생물학 형광 기반 생체 이미징 기법을 사용하기 시작했다. 이러한 세포막 등 세포의 구체적인 구획, 어느 형광 염료로 처리하여 특이성 부족 및 조직 침투 (1)의 저해 방법을 표시 할 수, 또는 형광 단백질 둘을 코딩 외인성의 mRNA 배아 내로 특정 도입. 다른 기술들은 예컨대 mRNA가 같은 외인성 화합물의 효율적인 전달을 위해 사용될 수있다. 이들은 다음을 포함하지만, 미세 주입, 전기 천공, 미세 입자, 리포 펙션과 함께 충격 전달 3,4, 이에 한정되지 않는다. 이러한 모든 접근에 외인성 화합물을 도입하는 데 사용될 수 있지만배아를 현상 만 마이크로 인젝션은 각 셀 (3)에 소정 수량의 정확한 적용을 허용한다. 마이크로 인젝션 기술은 모든 주요 발달 모델 시스템을 위해 설명되었다 4 (예, 초파리, 선충 웜, 제브라 피쉬, 개구리, 마우스)뿐만 아니라 발전기구의 발전을 이해 목표 비교 연구에 사용되는 등 일부 다른 모형 (4)에 관해서 (예를 들어, 말미잘, 환형 동물 벌레, 성게, 멍게의 tunicates, 두삭 동물의 amphioxus).
함께 tunicates과 척색 문을 설정 척추 동물로, 특히 적합 모델입니다 Cephalochordates는 척색 동물의 진화와 무척추 동물의 조상 5-8에서 척추 동물의 다양 화를 연구한다. 두삭 동물의 혈통은 초기 척색 진화하는 동안 분기; 세 장군으로 세분화되어 현존하는 cephalochordates (밀기울chiostoma, Asymmetron 및 Epigonichthys가), 척추 동물과 유사 모두 전체 해부학과 게놈 구조 5-8의 관점에서. 지금까지 설명 된 cephalochordates의 약 30 종, 다섯 배아 발달 연구 6,9 사용할 수 있습니다 Asymmetron의 lucayanum (바하마 창고 기), Branchiostoma floridae (플로리다 amphioxus), 창고 기 (유럽 amphioxus) Branchiostoma belcheri (중국 amphioxus)과 Branchiostoma japonicum (일본 amphioxus). 이 종의 세 가지의 잘 익은 성인 (B.의 lanceolatum, B.의 belcheri 및 B. japonicum)는 주문형 짝짓기의 계절 (10, 11) 중 산란을 유도 할 수있다. 또한, 적어도 용 B. lanceolatum, 효율적인 산란은 이에 연구소 용에 대한이 특정 두삭 동물 종에 액세스 할 수 있도록, 인공 해수 (12)에 유도 할 수있다천연 해수에 액세스 할 수 없습니다 이거 야. B의 조합, lanceolatum, 이러한 미세 주입 등의 효율적인 전달 방법과 배아에 편리하고 안정적으로 액세스의, 지금까지 13 ~ 15, (B. floridae와 B belcheri 모두) amphioxus에서 개발 된 유일한 전달 기술의 개발을 가능하게합니다 계보 tracing- 및 동적 셀 동작 기반 접근 방식을 포함 속임수 기술의 새로운 제품군.
의 mRNA를 효율적으로 미세 주입을위한 프로토콜은 B의 형광 단백질을 표현 lanceolatum 배아, 따라서 개발되었다. 또한, B의 라이브 영상을위한 기본 툴킷을 제공하는 lanceolatum 배아, 벡터 시스템은 막 - 관련 단백질의 형광 핵 발현 허용하는 것이 개발되었다. 막 타겟팅의 경우, 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는)는 mCherry 및 eGFP는 인간 HRAS의 CAAX 상자와 핵 현지화했다 융합했다제브라 피쉬 히스톤 2B (H2B) 엑손 (그림 1, 보충 파일 1)을 융합하여 얻을 수 있습니다. 또한, 단백질 번역을 최적화 할 목적으로, 구조체의 서열과 코작 코돈 변형 된 사용 및 B.에 적응 lanceolatum. 종합적으로, 여기에 제시된 주입 방법 및 발현 벡터는 특히 최근의 생체 영상 기술에 기반하여 형광 분석 cephalochordates 새로운 실험 접근법의 생성을위한 기초로서 역할을한다.
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Protocol
악기 및 시약 1. 준비
- 파스퇴르 피펫을 전송
- 다른 속도로 불꽃보다 230mm 긴 파스퇴르 피펫을 잡아 당겨 다른 팁 직경 전송 파스퇴르 피펫의 시리즈를 생성합니다. 테이퍼이기도의 부드럽고 미세한 제어를위한 가능한 한 긴 있는지 확인하십시오.
- 다이아몬드 스크라이브으로 수직 피펫의 길이에 따라 라인 피펫 긁힐. 두 손으로 무딘 컷을 생성하기 위해 길이로 피펫 평행을 당깁니다. 신속 불꽃 폴란드어 끝을 밀봉하지 않고 피펫.
- , 200 ~ 400 μm의 (직경 500 μm의 주위에) 수정란를 들어, 600 μm의 미 수정 난자에 대한 300 ~ 400 μm의 (직경 150 μm의 주위에) : 난자 / 배아의 무대와 팁의 직경은 피펫 수에 따라 달라질 부화 neurulae합니다. 입 모니터링 흡인 튜브를 사용 피펫은 한 접시에서 난자 / 배아를 전송합니다다른.
- 주사 바늘
- 의 RNase없는 조건을 보장하기 위해 장갑과 모세 혈관을 조작합니다. OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, 길이 10mm의 크기와 필라멘트 모세 혈관과 붕규산 유리를 사용합니다.
- 모세 혈관이 자료 목록에 설명 가열 필라멘트 바늘 풀러의 종류에 가져온 경우, 다음 설정을 사용 : 열 (600), 속도 (80), 시간 (60), 압력 (200) 또는 그렇지 않으면 300 (50)를 당겨, 모양, 어떤 보장 성공적인 주사에 매우 중요, 다음 속성 그림 2에 도시 한 바와 같이 : 4-8 μm의 외부 팁 직경 2cm 테이퍼 길이.
참고 : 바늘은 산란기 전에 뽑아 시즌 내내 사용할 수 있습니다.
- 5 % 페놀 레드 원액 (4 배)
- 각 산란기 전에 신선한 준비합니다.
- 0.22 μm의 여과 튜브에서 페놀 적색 분말을 25㎎ 달아.
- 에 DNase-과의 RNA 분해 효소가없는 물을 0.5 ML을 추가분체를 함유하는 튜브.
- 용액을 필터링 소독과 주사 바늘을 방해 할 수있는 결정을 제거하여 실온에서 18,000 XG에 3-5 분 동안 스핀.
- 4 ° C에서 보관 또는 -20 ° C에서 250 μL 씩 저장합니다.
- / ㎖ 폴리 라이신 솔루션 0.25 mg의
- 각 산란기 전에 신선한 준비합니다.
- 증류수 20ml에 폴리 -L- 라이신 5㎎을 녹인다. -20 ℃에서 5 ㎖ 씩.
- 폴리 라이신 코팅 요리에 난자의 재현과 강력한 접착력을 보장하기 위해 한 번만 즉시 해동 나누어지는을 사용합니다.
- mRNA의 합성
- 각 산란기 전에 신선한 준비합니다.
- (37 ° C에서 보통 2 시간 동안) 적절한 효소를 사용하여 원하는 DNA의 5 μg의 선형화. 소화의 완전성을 확인하려면 20 분 150 W에서 TBE 버퍼에 1 % 아가로 오스-TBE 겔에 소화 믹스의 볼륨에 2 %를 실행합니다.
- 원격 교육의 압축을 풉니 다24 : 1 페놀 (PH 8.0) : 클로로포름 : 25 음 공인 DNA 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기 18,000 XG에 10 분 수성 (위) 단계를 수집하기위한 소용돌이.
- (24) 다시 성상을 추출 : 1 클로로포름 : 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기에서 10 분간 18,000 XG 수성 상을 수집 용 소용돌이.
- 10 : 300 선형화 된 DNA : 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2) : -20 ℃에서 밤새 100 % 에탄올 100 선형화 된 DNA를 침전.
- 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 20 분. 70 % 에탄올로 씻어.
- 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 10 분. 의 RNA 분해 효소가없는 물을 건조 및 재현 탁 0.5 ㎍ / μL의 최종 농도 보자.
- 제조업체의 지시에 따라, 적절한 폴리머 라제 mRNA의 합성 키트를 사용하여 선형화 된 DNA 1 μg의 속기.
- 1 페놀 (PH 4.7) : 5의 mRNA를 추출 키트와 함께 제공된 클로로포름, 초산 암모늄 스톱 솔루션을.
- 20 초 동안 소용돌이, CEntrifuge XG 18,000에서 10 분 및 수성 상을 수집한다.
- (24) 다시 성상을 추출 : 1 클로로포름 : 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기에서 10 분간 18,000 XG 수성 상을 수집 용 소용돌이.
- 밤새도록 -20 ℃에서 100 % 이소프로판올 mRNA의 침전.
- 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 20 분. 80 % 에탄올에 씻어.
- 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 10 분. 그 다음, 재현 탁 어려울 수있는 바와 같이 더 이상보다 50-10 분 동안 실온에서 건조 된 펠렛을 보자. 적어도 2 ㎍ / μL 최종 농도 DNase-과의 RNase가없는 물에 재현 탁 사출 믹스 흉 mRNA의 최종 농도를 보장한다.
- 상기 전사 제품의 품질과 크기를 확인을 20 분 동안 150 W에서 TBE 버퍼의 RNase가없는 1 % 아가 로즈 겔상에서 TBE mRNA를 0.5 μL를 실행한다. 스토어 -80 ° C에서 2 μL 씩.
- 폴리 리신 - 코팅 요리
참고 : 폴리 라이신 COA테드 요리를 주입하는 동안 난자를 고정하는 데 사용됩니다.- 각 35mm 배양 세포 배양 접시 (총 5)의 경우, 해동 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 리신 용액 1 ㎖와 함께 배양 접시의 저면을 커버. 5 분 동안 실온에서 배양한다.
- 각 35mm 세포 배양 페트리 접시 (총 5)의 경우, 다른 35mm 세포 배양 페트리 접시에 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 라이신 솔루션을 전송합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다.
- 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 라이신 솔루션을 폐기하십시오.
- 2 시간 동안 실온에서 배양 접시 건조, 거꾸로 보자.
- 일주일 최대 오염을 방지하기 위해 4 ° C에서 플라스틱 포장에 싸여 폴리 라이신 코팅 요리를 저장합니다.
- 아가로 오스 코팅 요리
참고 : 그들은 문화를 주입 배아하는 데 사용됩니다. 아가로 오스는 주입 된 배아의 쿠션을 제공하고 접시의 바닥에 달라 붙는을 방지 할 수 있습니다.- 인공 해수 (ASW) 37~38g / L의 통신을 사용합니다역삼 투 물에 ercial 염 + 0.25 mM의의 NaHCO3.
- 전자 레인지에서 가열하여 용액을 0.22 μm의 필터 ASW에서 1 % 아가로 오스의 농도로 녹여.
- 신속히 요리의 매우 얇은 코팅을 아가 보장하기 위해 또 다른 하나에 하나 35mm 페트리 접시에서 용액을 따뜻한 아가 붓는다.
- 사란에 싸여 아가로 오스 코팅 요리 1 주일에 최대 오염을 방지하기 위해 4 ° C에서 포장에 보관하십시오.
- 주사 바늘 사출 믹스 로딩
- 약 2 시간 주사를 시작하기 전에, 1-1.8의 mRNA ㎍ / μL, 15 % 글리세롤, 1.25 % 페놀 레드의 최종 농도 2 μL를 주입 RNA 분해 효소의 믹스와의 DNase없는 물을합니다.
주 : 페놀 레드 색 주입의 주입 효율 및 배아 식별 모니터링을 허용 용액. 글리세롤 난자 내의 mRNA의 확산을 선호. - 원심 분리기 4 분에 18,000 XG에펠릿 결정. 얼음에 사용할 때까지 유지합니다.
- 10 μL 피펫, 결정을 펠렛 화 된 튜브의 바닥을 피 주사 믹스 0.5 μl를 수집한다.
- 바늘의 큰 개구부에 주입 믹스 0.5 μL 드롭 피펫 팅하여 (여기서 주입 중에 하나를 바꿈) 적어도 두 개의 주사 바늘 백필.
- 사출 믹스의 증발을 방지하기 위해 4 ° C에서 바닥에 액체와 함께 저장 항아리에 바늘을 설치합니다. 사출 믹스 천천히 기포의 생성을 최소화하기 위해, 적어도 1 시간 동안 주사 바늘의 선단을 여행하자.
- mRNA의 품질이 저하 한 후, 세 개의 추가 용도의 최대 -80 ° C에서 보관 추가적인 주입 믹스 (데이타 미기재).
- 약 2 시간 주사를 시작하기 전에, 1-1.8의 mRNA ㎍ / μL, 15 % 글리세롤, 1.25 % 페놀 레드의 최종 농도 2 μL를 주입 RNA 분해 효소의 믹스와의 DNase없는 물을합니다.
생물 재료, 미세 주입 및 배아 문화 2. 컬렉션
- 난자와 정자 수집
참고 : Theodosiou를 참조하십시오등의 알. 산란을 유도하고 배우자 수집을위한 상세한 프로토콜에 대한 (12).- 24 시간 동안 23 ° C에서 ASW에 충격 남성과 여성.
- 대부분의 성인은 일몰 후 1-2 시간을 산란하기 때문에 일몰 전에 한 두 시간은 19 ° C에서 ASW에서 개별 컵에 성인을 전송합니다.
- 필터링 ASW에서 35mm 배양 접시를 씻어 그들에게 접시의 바닥에 달라 붙는 난자를 방지하기 위해 건조 거꾸로 보자.
- 산란시, 즉시 1,000 μL 피펫으로 정자와 난자를 수집합니다.
- 정자를 유지하고 접촉 생식 세포가 건강에 해로운 때문에 난자가 성인 amphioxus 분리 (데이터가 표시되지 않음).
- 또한, 정자와 난자를 모두 방출 움직임에 이르게, 성인 깜짝 놀랄 방지, 따라서 희석. 가능한 한 긴 활성 정자를 유지하고, 수정 속도를 최적화 가능한 집중으로 정자를 수집 할 수 있습니다.
- 유지1.5 ML 튜브에 얼음에 정자.
- 사전 세척 35mm 페트리 접시에 여과 ASW에서 난자를 전송합니다.
- 전송 100 ~ 500는 주사를 수행하기 위해 다른 35mm 페트리 접시에 이전 뽑아 300 ~ 400 μm의 전송 파스퇴르 피펫으로 난자.
- 정자와 난자의 품질이나 다른 실험 대조군으로 클러치의 나머지 기름지게.
- 난자 주입
- 수평면에 50 ° 각도로 미세 조작기에 주사 바늘을 설치한다.
참고 : 50 °의 각도가 난자에 바늘의 상대 위치의 적절한 모니터링을 허용하지 않습니다 동안보다 50 °의 각도가 접시에 주위의 난자를 밀어 것입니다. - 25X 접안 형광 해부에서 여과 ASW를 함유하는 폴리 리신 - 코팅 접시 300-400 μm의 전송 파스퇴르 피펫 30 난자 옮긴다.
- 수행 할 선을 따라 난자를 입금주문 방법 및 아웃 주사는 비 주입 난 모세포에서 분사 구별하기. 배아 현상을 변형시키는 경향이 폴리 리신, 난 모세포의 노출 시간을 최소화하기 위해 작은 수 (30 난자) 주사 (데이타 미기재).
- 가능한 반투명으로 난자를 렌더링하는 암 필드 조명을 사용합니다.
- 미세 조작기의 조동 노브, 난자 가까이에 주사 바늘을 가지고.
- 미세 핀셋으로 선단이 만곡되기 시작 레벨에서 바늘을 오픈. 인젝터 펄스으로, 그 붉은 주입 혼합 실제로 바늘의 유출되어 있는지 확인합니다.
- 200X 배율과 미세 조작기의 미세한 움직임 노브로, 부드럽게 난자의 핵심 내부의 주사 바늘을 이동합니다.
참고 : 너무 피상적으로 삽입 한 경우, 주입 된 용액이 난자 내부에 남아되지 않습니다. 너무 멀리 삽입 한 경우, 난자가 파괴됩니다. - 120 밀리 초 durat의 1-3 펄스 주입이온과 1 ~ 10 psi의 압력. 바늘이 충분히 좋은 경우, 일정한 압력에서 연속적인 흐름으로 주입. 사출 볼륨이 하나의 난자의 부피의 1/3에 1/5에 해당하는지 확인합니다.
- 주입 후, 난자의 누출을 방지하기 위해 신속하게 바늘을 빼냅니다.
- 주입 된 용액이 난자 내에서 유지하고 몇 초 후, 주입 된 용액이 난자에 걸쳐 퍼져 있는지 확인합니다.
- 라인의 다음 난자에 이동합니다.
- 주입 된 배아 스캔 할 때 배경 형광을 추정하기 위해 음성 대조군 각 시리즈의 일부 uninjected 배아를 유지합니다.
- 수평면에 50 ° 각도로 미세 조작기에 주사 바늘을 설치한다.
- 주입 배아 및 배아 문화의 시비는, 선택
- 즉시 시리즈가 주입 된 바와 같이 난자를 기름지게. 난자의 질이 시간에 감소로, 주입, 12 산란 후 1 시간 내에 난자를 비옥.
- 정자 농도에 따라 난자에 정자의 1-5 방울을 추가하고접시를 소용돌이 친다.
참고 : 수정 봉투는 약 1 분 후 배아에 명확하게해야한다. - 난자의 또 다른 시리즈를 주입하는 동안, 배아는 폴리 라이신 코팅 접시에서 분리 할 수 있습니다.
- 아가로 오스 코팅 페트리 접시에 600 μm의 전송 파스퇴르 피펫으로 배아를 전송합니다. 모든 가능한 2 셀 단계 전에 경우, 가능한 한 빨리 폴리 라이신 코팅 접시에서 배아를 제거합니다.
참고 : 폴리 라이신에 장시간 노출 될 경우, 배아는 접시의 바닥에 닿는면에 평평하게 밀집 blastulae, 될 경향이있다. - 2 셀 4 셀 단계에서, DSR 필터와 형광 해부 범위로 선택 성공적으로 주입 배아, 즉, 페놀 레드 파생 적색 형광 신호를 전시하는 일반적인 형태와 그.
- 원하는 스테이지까지 19 ° C에서 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에서 필터링 ASW에서 문화 배아를 유지생체 내 이미징.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜 B. 마이크로 인젝션 용의 기초를 제공한다 lanceolatum 난자 따라서 B. 개발에 도입 mRNA를 lanceolatum 배아는 생체 내 이미징 형광 단백질을 코딩. 기술은 확실히 견고하고 신뢰할 수 있지만,이 프로토콜을 이용하여 성공적으로 주사 속도 변수 (표 1) 남아있다. 이 흥미로운 사실을 매우 그럴듯한 설명은 난자 클러치의 극단적 인 변화입니다 : 사출 압력을받을 때 다른 달걀 배치가 참으로 매우 다르게 작동 않습니다. 다른 사람들은 매우 단단하고 주입시 라운드 유지하면서 일부 난자, 오히려 탄성이며 접시의 바닥에 평평하게하는 경향이있다. 다른 단순히를 Lyse (데이터 미기재)하면서 또한 일부 난자 배치는 주입시 그들의 융모막 막을 팽창하는 경향이있다. 명백한 상관 관계가 주입 및 배아에 난자 행동 사이을 구축 할 수 없습니다수정 후 개발. 그것은 미세 주입에 가장 적합 난자의 범주를 예측하는 것이 어렵다. 그러나 수정 후, 정상적인 발달이 진행 배아는 절단 단계만큼 일찍 식별 할 수 할구 간의 접촉면이 작은 경우 4- 세포 단계 배아 2 세포가 정상으로 간주 할 수 괴성 절단 단계 배아, 개별 셀 동안 분별하기 어려운, 확실히 이상하다.
우리 손으로, 난자의 절반은 주사 및 주입 전시에게 특정 형광 라벨을 생존 할 배아의 절반에 대해 발생하는 외상 생존하지 않습니다. 따라서, 우리는이 주입 프로토콜, 50 ~120 배아 성공적 15과 60 사이에 표지 배아 수득 산란 주어진 날에 주입 될 수 있다고 추정한다.
4- 세포 단계 배아 2 셀 내의 페놀 레드 적색 형광은 매우 신뢰성이 배아 마크이와 같이 선택된 배아 100 %이어서 주입 된 mRNA에 의해 코딩되는 형광 단백질을 생산으로 적절히 주입되었다. 또한, 2 셀 4 셀에 단계에서 페놀 적색 형광의 세기와 mRNA의 주입에 의해 코딩 된 단백질에 의해 생성 된 형광의 개시 시점 사이의 아주 명확한 양의 상관 관계가있다. 이 상관 관계는 따라서 주입 과정에서의 mRNA의 가장 높은 금액을받은 이들 배아의 식별을 허용한다.
주입 된 mRNA에 의해 코딩되는 형광 단백질의 신호 페놀 레드 - 양성 배아의 선택 감지되지 않으면, 우리는 mRNA의 분해 또는 포착을 확인하기 위해 RNAse가없는 겔에 주입 혼합을 실행하도록 추천 (도 3) . 레인 (1)에서는, 본래 mRNA의 밴드가 검출된다. 이 혼합 주입 배아에서 강한 형광 신호로했다. 반대로, 레인이 다른 experimen에 상당페놀 레드가 (자세한 내용은 설명을 참조) 믹스 덱스 트란 염료로 대체 t는 mRNA의 배아에서 형광 신호 주도 결코이 믹스의 덱스 트란 염료 및 사출에 의해 포획 된 것으로 보인다.
이 미세 주입 기술과 우리의 구조 (표 2, 3, 보충 파일 1) (설명 참조), 우리가 이렇게 재현 막에서 핵 및 eGFP는와 mCherry 또는 eGFP는와 배아에 걸쳐 균일 한 형광 라벨을 생성 할 수 있습니다 사용 (그림 4) . 촬상 프로토콜은도 4는 다른 곳에서 설명한다 (포레 외., 현재 준비)를 생성하는데 사용. mRNA의 양에 따라하면 형광 단백질의 발현은 전형적으로 16 세포 (도 4A) 및 64 세포 단계 사이 검출되고 적어도 늦은 neurula 스테이지까지 검출 유지, 주입 (데이타 미기재). 나중에 단계는 테스트 된 것은 아닙니다. 원자력 신호전형적으로 인해 잠재적으로 핵의 크기가 작아짐에 비교하여 멤브레인의 본질 확산 특성, 막 신호보다 먼저 나타난다 (데이터는 보이지 않음). 이 체계적으로 모니터링되지 않지만, 배아는 핵 eGFP는 라벨이 독점적으로 주입 된 배아보다 건강한 것으로 보인다 핵 막 표지 모두 주입. 주입의 mRNA의 총량이 하나 또는 두 종의 mRNA 믹스 포함되어 있는지의 여부, 동일하다 흥미롭게도,이 효과는 주입의 mRNA의 총량 독립적 것으로 보인다 (데이타 미기재).
그림 1 : 세부 사항을 구축합니다. (A)의 스케치 막 대상 eGFP는 (eGFP는 : CAAX 상자), (B) 핵 대상 eGFP는 (H2B : eGFP는)와 (C) 핵 대상 mCherry (H2B : mCherry는) 아르를 구성전자가 표시.
그림 2 : 대표 주사 바늘의 모양입니다. (A)는 테이퍼 길이는 약 2 cm이고 선단 바늘 곡선이다. 스케일 바 = 2mm. A의 박스 영역 (B) 확대 바늘 (화살표)를 클리핑의 위치는 바늘의 곡선이다. 바늘의 선단은 화살표로 표시된다. 스케일 바 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 레인 1 mRNA와 페놀 레드를 포함하는 혼합 이주의 mRNA의 상호 작용과 선택 형광 염료 (A) 결과 및mRNA와 레인 (3.3 ㎎ / ㎖의 최종 농도) mRNA와 오레곤 그린 덱스 트란을 함유하는 혼합물의 이주의 레인 2 (B) 결과에서 (3.3 ㎎ / ㎖의 최종 농도) 텍사스 레드 덱스 트란 3 mRNA와 및 B 레인 5. 젤 이동 시간 (3.3 ㎎ / ㎖의 최종 농도) 레인 4 및 mRNA와 로다 덱스 트란 (3.3 ㎎ / ㎖의 최종 농도) FITC 덱스 트란이었다 다른. 명확성을 위해, 빛 반사와 점선 마이그레이션 차선의 윤곽을 마스크에 검은 사각형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :의 mRNA는 형광 단백질을 코딩 주입 amphioxus 배아의 3D 렌더링 (아미라 소프트웨어) 이미지이다.최적화 라이카 SP5 2- 광자 레이저 주사 현미경 취득한 3D 시간 경과로부터 추출 (A) 16 세포 단계 배아 핵 H2B 표현 :.. mCherry 및 멤브레인 타겟팅 : eGFP는 (B) 낭배 스테이지 배아 핵 H2B 발현 eGFP는 :. CAAX 상자 (C) 낭배 단계의 배아 핵 H2B을 표현 : mCherry와 막 대상 eGFP는 : CAAX 상자를. 광학 부분은 핵 mCherry 멤브레인 관련 eGFP는 신호와 내부 세포를 보여줍니다. 스케일 바는 50 μm의 =.
| 실험 번호 | 주입 된 구조 mRNA의 | 주입 된 배아의 수 | 표지 된 배아의 수 |
| (1) | H2B : eGFP는 | (53) | (23) |
| 이 | H2B : eGFP는 | (50) | (31) |
| 3 | H2B : eGFP는 | (48) | (20) |
| 4 | H2B : eGFP는 | (54) | (24) |
| (5) | H2B : eGFP는 | (114) | (47) |
| (6) | H2B : eGFP는 | (80) | (46) |
| 7 | H2B : eGFP는 또는 | (62) | (24) |
| H2B : mCherry + eGFP는 : CAAX 상자 | |||
| 8 | H2B : eGFP는 | 87 | (60) |
| 9 | H2B : eGFP는 | 77 | (45) |
| (10) | eGFP는 : CAAX 상자 또는 | (110) | (51) |
| H2B : mCherry + eGFP는 : CAAX 상자 | |||
| (11) | H2B : mCherry + eGFP는 : CAAX 상자 | (45) | (26) |
| (12) | H2B : mCherry + eGFP는 : CAAX 상자 | (52) | (16) |
| (13) | eGFP는 : CAAX 상자 또는 | (74) | (35) |
| H2B : mCherry + eGFP는 : CAAX 상자 | |||
| 합계 | (906) | (448) | |
| 성공률 | 49 % |
표 1. 성공적인 주사제의 전체 비율이 그대로 사출 성공률 주입 구조, 주입 및 표지 (성공적 또는 주입) 배아의 개수 살아남은 주입 배아의 수가 표시된다.
| 구축 | PCS2 + 벡터에 위치 | 원래 순서 | 돌연변이 순서 |
| PCS2 + eGFP는 : CAAX 상자 | 79..87 | GGA TCC ACC | ACC GT C C |
| PCS2 + H2B : eGFP는 | 82..90 | TCC GAC ACG | CC G T C AC |
| PCS2 + H2B : mCherry | 82..90 | TCC GAC ACG | CC G T C AC |
표 2 :. 코작 서열의 임시 최적화 원본과 돌연변이 코작 서열은 각각의 구조에 대해 표시됩니다. 도입 된 돌연변이는 B.의 코작 서열을 복구 매우 닮았다 lanceolatum 액틴 유전자, 그 amphioxus의 추정 이론 선호 코작 서열 (A / CGA / CG / TTC A / GAC의 ATG TG / CT).
| PCS2 + eGFP는 : CAAX 상자 | |||
| 원래 코돈 | 변이 된 코돈 | PCS2 + 벡터에 위치 | |
| (사용 수준) | (사용 수준) | ||
| GTA | GT G | 154..156 | eGFP는 순서 |
| (0.08) | (0.43) | ||
| AGA | AG G | 814..816 | 링커 |
| (0.09) | (0.27) | ||
| PCS2 + H2B : eGFP는 | |||
| 원래 코돈 | 변이 된 코돈 | 에 위치PCS2 + 벡터 | |
| (사용 수준) | (사용 수준) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B 순서 |
| (0.08) | (0.43) | ||
| 289..291 | H2B 순서 | ||
| 469..471 | 링커 | ||
| 568..570 | eGFP는 순서 | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B 순서 |
| (0.06) | (0.51) | ||
| PCS2 + H2B : mCherry | |||
| 원래 코돈 | 변이 된 코돈 | PCS2 + V를에 위치엑터 | |
| (사용 수준) | (사용 수준) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B 순서 |
| (0.08) | (0.43) | ||
| 289..291 | H2B 순서 | ||
| 469..471 | 링커 | ||
| 913..915 | mCherry 순서 | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B 순서 |
| (0.06) | (0.51) | ||
표 3 : 코돈 사용의 최적화 미정. 원본과 돌연변이 코돈 각 구조에 대한 표시됩니다. 이 실험적으로 테스트되지는 않았지만, mutati 소개기능은 amphioxus에서 mRNA의 번역을 최적화하기위한 것입니다.
보충 파일 1 : 시퀀스를 구축 (A) 막 대상 eGFP는의 염기 서열. (eGFP는 : CAAX 상자), (B) 핵 대상 eGFP는 (H2B : eGFP는)와 (C) 핵 대상 mCherry (H2B를 : mCherry) 구조는 PCS2 + 벡터 백본의 맥락에서 제공됩니다. 구조의 각으로 인코딩 된 주요 도메인은 색상으로 표시됩니다 eGFP는 (녹색), mCherry (적색), 인간의 HRAS (CAAX 상자)에서 막 지역화 신호 (파란색 시안), 제브라 피쉬 히스톤 2B 엑손 (H2B) (노란색).
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Discussion
이 글에서, B.의 주입을 위해, 처음으로, 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제시 lanceolatum 난자, 이는 후 B. floridae 13, 14 및 B belcheri 15는, 이와 같은 기술이 기재되어있는 제 amphioxus 종이다. 중요한 프로토콜은 B. 형광 단백질의 생산에 적합한 벡터 시스템의 설명을 포함 여기에 설명 시험 관내 생산 된 mRNA의 주입으로부터 lanceolatum (후술). 함께, 이러한 새로운 도구 amphioxus의 초기 개발 및 분열과 낭 배기와 배아의 초기 형태 형성 이벤트를 기초 동적 세포 행동의 분석의 생체 내 이미징 할 수 있습니다.
일반적으로, 마이크로 인젝션 기술은 특정 화합물의 사전 정의 된 양의, 표적 세포 내로 전달을 허용하는 이점을 갖는다. 이 인들과 함께보조제는,이 기술의 한 가지 중요한 한계는 주어진 실험 중에 분사 될 수있는 셀의 수가 제한된다. 예를 들어, 프로토콜은 여기에 설명 B. lanceolatum 약 절반이 마크가 부착되어있는 사출 세션 당 100-120 계란, (표 3)의 주입을 할 수 있습니다. B. 들어 floridae, 숫자는 50 % 이상 주사 13, 14 살아남있는 하루를 주입 할 수 500 개 이상의 계란, 매우 유사하다. B.를 분사하면서 프로토콜 lanceolatum와 B. floridae 계란 밀접 B. 서로 유사 belcheri 기술은 약간 다른 경우 : 다른 브랜드의 마이크로 인젝터를 사용하여 거꾸로 현미경으로 계란 폴리 라이신 코팅 된 커버에 배치하고 주사가 수행된다. 이 접근은 명백하게 200 내지 300 B.의 주입을 허용 생존율, neurula 단계에서 부화 후 주입 세션 당 belcheri 계란, OF 95.83 % 15 89.39 %. 프로토콜의 차이를 고려할 때 성공률 차이 종 - 관련 또는 프로토콜과 관련된 차이에 의해인지 아는 것이 곤란하다. 하나는이 질문에 대답하기 위해 서로 다른 프로토콜과 병렬로 다른 종을 테스트해야합니다. 그럼에도 불구하고, 상기 외인성 화합물의 전달 대상 난자의 수를 증가시키기 위해, 다른 프로토콜은 amphioxus 개발되어야 할 것이다. 후보 기술은 전기, 미립자, 리포 펙과 충돌하고, 전달 (4)를 포함한다. 참고로, 전기가 이미 수정 된 멍게의 피막이 계란에 외인성 물질의 도입을위한 표준 기술로 설립되어, 다른 무척추 척색 모델 개발 메커니즘 (8)의 진화를 연구에 사용됩니다.
성공적인 미세 주입 및 형광 단백질의 후속 생체 이미징, 적당한 들어발현 벡터는 필수 전제 조건이다. 이를 위해, 세 플라스미드 (그림 1, 보조 파일 1) 검증 실험적으로 개발되었습니다 CAAX 상자 구조 : 막 타겟팅에 대해, eGFP는 유전자가 인간의 HRAS CAAX 상자의 3 '말단에 융합되었다 (eGFP는 결과 ) (16)과, 핵 타겟팅을 위해, eGFP는 및 mCherry 유전자 모두가 5시에 융합 된 'H2B에 각각 결과 제브라 피쉬 히스톤 2B (H2B) 엑손 (에 끝 : eGFP는 및 H2B : mCherry 구조) 17. 이러한 구조의 각각은 SV40 후기 폴리아 데 닐화 사이트와 관내 출장 mRNA의 합성 (18, 19)에서 허용하는 SP6 프로모터를 포함하는 PCS2 + 플라스미드에 클로닝되었다. 또한, 목표와 B의 구조의 번역을 최적화 lanceolatum, 코작 서열 및 코돈 모두 단일 염기 돌연변이 (표 2 및 3에 부가 한 파일)을 사용하도록 구성되었다. 바스나카가와 (20), B의 작은 수영장으로 접근 에드 lanceolatum 유전자는이 종에서 바람직한 코작 서열을 식별하기 위해 분석 하였다. 이 이론 선호하는 순서에서 가장 가까운 알려진 자연 발생 순서는 B의 즉 액틴 유전자 lanceolatum. 세 구성체 코작 서열은 따라서이 액틴 유전자 서열과 일치하도록 수정 하였다. 또한, B.의 코돈 사용 lanceolatum는 B.에서 낮은 사용량 확률 제물에서 코돈 사용 데이터베이스 (21) 코돈을 사용하여 분석 하였다 lanceolatum (<10 %)보다 높은 사용 가능성과 동등한 코돈에 의해, 가능하면, 대체되었다.
주사 결과는 이들 벡터로부터 단백질의 발현 수준이 촬상 분석 생체 적합 함을 보여준다. 개질 된 발현 벡터의 출력이 변경되지 않은 구조와 비교되어 있지 않은 것을 감안하면 사기 없다코작 합의와 코딩 서열에 도입 된 수정의 효율성 또한 포함 할. 확실히 이들 변형이 실제로 단백질 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 테스트 흥미로울 것이다. 이와 더불어, 최근 분석 B.에 microinjections에 따라 다른 belcheri, 변성 amphioxus 벡터도 15에서 형광 단백질 생산의 mRNA 합성에 사용될 수 있음을 시사한다.
Amphioxus 내생 녹색 형광 단백질 (22)를 포함한다. 배아 따라서 녹색의 낮은 수준뿐만 아니라 붉은 형광 (우리의 관찰되지 않은)을 나타낸다. 그러나, 이들의 내인성 수준의 mRNA가 우리 제물의 주입으로 인한 형광 레벨에 대하여 무시할 수있다. 따라서, amphioxus 배아의 내생 형광은 형광 쌍안경 또는 멀티 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 실험 관찰을 방해하지 않습니다. 게다가사출 실험 mRNA의 주입에 의해 생성 된 외인성 형광의 강도를 직접 분사 믹스에 사용되는 mRNA의 최종 농도와 상관 주입 물질의 실제 양에 의존한다는 것을 알 수있다. B.을 lanceolatum 배아는 최대 1.8 μg의 농도 실제 mRNA의 농도의 독립, 일부 mRNA의 조합이 보인다,하지만 / μL의 mRNA, 이하 B. 용납 할을 허용하는 경향이 다른 사람보다 배아를 lanceolatum. 따라서, 핵 mCherry 및 막 eGFP는의 mRNA의 조합은 혼자 핵 eGFP는 주입보다 더 독성이 나타났다.
텍사스 레드 덱스 트란 이전 amphioxus 난자 13-15로 성공적인 주사에 대한 추적으로 사용되어왔다. 흥미롭게도, 주입 된 mRNA의에서 파생 된 형광 신호는 텍사스 레드 덱스 트란을 함유 한 용액의 주입이 모두 amphioxus 난자에서 4 명 (실험) 및 zebrafi 후의되지 않았습니다쉬 배아 (N = 3 실험). mRNA와 텍사스 레드 시험 관내에서 전사 된 덱스 트란 함유 주입 믹스의 RNase가없는 아가 로스 겔 (도 3, 레인 2)에 장착 될 때의 mRNA에 상응하는 밴드는 존재하지 않는다. 대조적으로, 시험 관내에서 전사 된 mRNA의 페놀 레드 (도 3, 레인 1)의 존재의 RNase가없는 영동 검출된다. 젤에 mRNA의 분해에 대한 증거가없는 점을 감안, 이러한 결과는 텍사스 레드 덱스 트란 트랩 mRNA의 경향 것이 좋습니다. 주사 용액에 사용하는 경우, 텍사스 레드 덱스 트란 따라서 주입의 mRNA의 번역을 방지 할 수 있습니다. 이 관찰 다음, mRNA의 다른 염료 (FITC 덱스 트란, 로다 민 덱스 트란과 오레곤 그린 덱스 트란)의 상호 작용은 B.에 아가 로스 젤의 RNase 무료와 주사로 모두 테스트 하였다 lanceolatum 또는 제브라 피쉬 (그림 3). 분석은 FITC 덱스 트란 젤에 트랩의 mRNA를하지 않는 것을 나타냅니다 (그림 3, LAN예 4) (N = 1 실험) 지브라 피쉬 형광 단백질 발현에 이르게 아니지만 B.의 배아 lanceolatum (N = 1 실험) (데이터 미기재). 로다 민, 덱스 트란은 겔 (도 3, 레인 5)에 트래핑하지 mRNA 발현을 수행하고 제브라 피쉬 배아 형광 단백질 발현을 유도 (N = 1 실험) (데이터는 도시되지 않음)하지만, 그 활성은 불행히도 B. 시험 될 수 없었다 lanceolatum 배아. 오레곤 그린 덱스 트란 mRNA의 mRNA를 같은 수준의 마이그레이션 마지막으로, 아가 로스 겔 (도 3, 레인 3)에 의해 평가 될 수 없었다 트래핑. 후자 염료 amphioxus (N = 1 실험) 형광 단백질 발현을 억제하지만, 제브라 피쉬하지 배아 (N = 1 실험) (데이터는 보이지 않음). 결론적으로, 이러한 데이터는 일부 덱스 트란 효율적으로 주입의 mRNA의 번역을 억제 할 수 있음을 시사한다. 용량 - 반응 실험이 수행되지 않았 음을 감안할 때, 이러한 데이터는 질적이다. 흥미롭게도,이 억제 효과에 의존하는 것 같다동물 종 추가적인 연구가이 효과를 기본 메커니즘을 이해하기위한 필요성을 강조 (지브라 피쉬 대 amphioxus). 덱스 트란은 주사제 컬러 트레이서로서 사용될 경우 더욱이, 이러한 결과는, 예비 분석 요구한다.
주어진 모델 마이크로 인젝션 기술의 개발은 유전자 특이 적 조작을위한 문을 연다. amphioxus에서, 예를 들어, 제 microinjections의 설명은 (B. floridae에서) 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드 주사를 사용하여 23, 24, 유전자 hox1의 성공적인 최저 선행되었다. B.의 수 성공적으로 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 매일 주입 될 수 lanceolatum 배아 이런 종류의 연구와 확실히 호환된다. 또한, 이러한 방법 손에서 소설 구조로, 하나는 이제 디자인 할 수 있습니다 네이티브 관심의 mRNA (또는 지배 - NEG의 주입에 의해 과발현 최저 연구를 수행극상 형태) 또는 예를 들어 마이크로 RNA 또는 shRNA를 기반 전략)에 대한 유전자 발현을 (방해를위한 다른 전략을 사용합니다. 지금까지 amphioxus 주사는이 효율적으로 고정 할 수있는 유일한 단계이기 때문에, 난자 단계에서 수행 할 수 있습니다. 난자 단계에서 주입 한 후, 대상 분자는 도처에서 발현되는 배아. 유전자 발현을 변경하거나 세포의 서브 세트만을 모니터 할 필요가있는 경우 이러한 현상 amphioxus 배아 15,25-27 mosaically에 표현 된 바와 따라서, DNA 작 제물이 주입 될 필요가있다. DNA 구조체 주사는 모자이크 식 15,25-27의 상술 한 단점과 일시적인 형질 전환 분석에서 amphioxus 개발 중에 조절 영역의 활성을 시험하기 위해 사용될 수있다.
궁극적으로, amphioxus의 미세 주입 기술은 특정 유전자 좌위의 대상 노크 아웃 또는 노크에 포함 안정적인 transgenesis에 대한 문을 엽니 다. 체계외래 DNA의 안정적인 삽입의 이미 곤충과 척추 동물 양막 류 (28) 모두에서 작동하는 것처럼 보이기는 물고기 트랜스포존 기반 TOL2 시스템, 예를 들어, 존재한다. 또한, 수정 아연 손가락 클레아 제 (ZFNs) 또는 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs) 또는 RNA 유도 게놈 편집 도구에 따라 접근 방법 (CRISPR은 / CAS 시스템) 점 돌연변이를 생성하고 노크의 특정에 수정하는 데 사용할 수 있습니다 게놈 (29)의 영역. 이미 나에 대해 설정되어 포로 amphioxus의 연중 번식을 필요로 이러한 노력 belcheri 11,30와 B. 30,31 japonicum A. 위해 현재 개발되고 lucayanum, B. floridae 및 amphioxus 종 B., 여기에 기능을 갖춘 lanceolatum (32).
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Acknowledgments
저자는 축산은 "Animalerie 센트 드 지프 쉬르 이베트"에 의해 지원을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) FP6 부여 "Embryomics"에 의해 ANR 부여 "에 의해, 마이클 슈베르트에 ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 및 ANR-11-JSV2-002-01)에서 기금에 의해 지원되었다 ANR- 장 - 프랑수아 니콜라스와 나딘 Peyriéras에 10 BLAN-121801 데브 - 프로세스 ". 주앙 엠마누엘 카르발류는 FCT 박사 교제에 의해 자금을 조달 (SFRH / BD / 2,012분의 86,878).
여기에 설명 된 벡터에 대한 요청은 저자에게 직접 해결할 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | Culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μm |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 μm |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P9155 | |
| H2O, DNase/RNase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | Sigma | C0549 | |
| 5:1 phenol pH 4.7:chloroform | Sigma | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200X magnification | Leica | MZ16F | 25X oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Fine forceps | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
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