Summary
Nous rapportons ici l'expression robuste et efficace de protéines fluorescentes après l'injection d'ARNm dans des ovocytes non fécondés de Branchiostoma lanceolatum. Le développement de la technique de micro-injection dans ce chordés basale ouvrira la voie à grande portée des innovations techniques dans ce système de modèle émergent, y compris l'imagerie in vivo et les manipulations spécifiques de gènes.
Introduction
Pendant le développement, une seule cellule donne naissance à un organisme entier dans un processus très complexe qui implique les deux divisions et les mouvements cellulaires. Pour mieux comprendre les principes biologiques sous-jacents la dynamique du comportement cellulaire, biologie du développement ont commencé à utiliser des techniques d'imagerie in vivo par fluorescence. Compartiments spécifiques des cellules, telles que les membranes cellulaires, peuvent soit être marquées par des traitements avec des colorants fluorescents, une approche entravée par le manque de spécificité et de la pénétration du tissu 1, ou par l'introduction spécifique dans l'embryon d'ARNm exogène codant pour les protéines fluorescentes deux. Différentes techniques peuvent être utilisées pour la prestation efficace de composés exogènes, tels que les ARNm. Ceux-ci comprennent, mais ne sont pas limités à, la micro-injection, l'électroporation, le bombardement avec des microparticules, la lipofection et 3,4 transduction. Bien que toutes ces approches peut être utilisé pour introduire des composés exogènes dans unle développement embryonnaire, la micro-injection ne permet l'application de quantités prédéfinies et précis dans chaque cellule 3. techniques de microinjection ont été décrits pour tous les principaux systèmes de modèle de développement 4 (par exemple, les mouches des fruits, des vers nématodes, de poisson zèbre, grenouilles, souris) ainsi que pour certains autres modèles 4, y compris ceux utilisés pour des études comparatives visant à comprendre l'évolution des mécanismes de développement (par exemple, les anémones de mer, vers annélides, les oursins, tuniciers d'ascidies, l'amphioxus de céphalochordé).
Céphalochordés, qui, avec les tuniciers et les vertébrés établissent le phylum des chordés, sont particulièrement bien adaptés modèles pour étudier l'évolution des chordés et la diversification des vertébrés d'un ancêtre invertébrés 5-8. La lignée de céphalochordé divergé très tôt pendant l'évolution des chordés; et céphalochordés existantes, qui sont subdivisés en trois genres (Branchiostoma, Asymmetron et Epigonichthys), ressemblent vertébrés à la fois en termes d'anatomie et de l'architecture globale du génome 5-8. Sur les 30 espèces de céphalochordés qui ont été décrites à ce jour, cinq sont disponibles pour des études embryologiques et de développement 6,9: Asymmetron lucayanum (le lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (le amphioxus Floride), Branchiostoma lanceolatum (l'amphioxus européenne), Branchiostoma belcheri (le amphioxus chinoise) et Branchiostoma japonicum (le amphioxus japonais). Adultes mûrs de trois de ces espèces (B. lanceolatum, B. belcheri et B. japonicum) peuvent être induits à pondre à la demande au cours de la saison de reproduction 10,11. En outre, au moins pour B. lanceolatum, frai efficace peut aussi être induite dans l'eau de mer artificielle 12, ce qui rend cette espèce de céphalochordé particuliers accessible pour laborators qui ne ont pas accès à l'eau de mer naturelle. La combinaison, dans B. lanceolatum, d'un accès pratique et fiable pour les embryons avec une méthode de livraison efficace, tels que la micro-injection, jusqu'à présent, la seule technique de livraison développé en amphioxus (à la fois B. et B. floridae belcheri) 13-15, va permettre le développement d'un nouvelle gamme de techniques de manipulation, y compris la lignée tracing- et les approches de comportement de cellules dynamique.
Un protocole pour la micro-injection d'ARNm efficace pour exprimer des protéines fluorescentes dans le B. lanceolatum embryon a donc été développé. En outre, de fournir un ensemble d'outils de base pour l'imagerie en direct de B. embryons lanceolatum, systèmes de vecteurs ont été développés qui permettent associée à la membrane nucléaire et l'expression de protéines fluorescentes. Pour le ciblage de la membrane, le renforcement de la protéine fluorescente verte (eGFP) a été fusionnée à la boîte de CAAX HRAS humaine et localisation nucléaire de mCherry et eGFP étaitobtenu par fusion à l'exon poisson zèbre histone 2B (H2B) (figure 1, fichier supplémentaire 1). En outre, dans le but d'optimiser la traduction des protéines, des séquences de Kozak et des codons des constructions ont été modifiées et adaptées à l'utilisation dans B. lanceolatum. Pris ensemble, la méthode d'injection et des vecteurs d'expression présentés ici serviront de base pour la génération de nouvelles approches expérimentales pour céphalochordés, notamment en utilisant les analyses par fluorescence les dernières techniques d'imagerie in vivo.
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Protocol
1. Préparation des instruments et réactifs
- Transfert pipettes Pasteur
- Générer une série de pipettes transfert de Pasteur avec différents diamètres de pointe en tirant de longues pipettes Pasteur 230 mm dessus d'une flamme à des vitesses différentes. Assurez-vous que le cône est aussi longtemps que possible pour le contrôle lisse et fine d'aspiration.
- Avec une pointe en diamant, rayer la pipette le long d'une ligne perpendiculaire à la longueur de la pipette. Avec les deux mains, tirez la pipette parallèlement à sa longueur pour générer une coupe au carré. Rapidement flamme polish la pipette sans se sceller la pointe.
- Varier le diamètre de la pointe avec le stade des ovocytes / embryons à pipette: 300-400 um pour les ovocytes non fécondés (environ 150 m de diamètre), 600 um pour les œufs fécondés (environ 500 m de diamètre), 200 à 400 um pour neurulas hachurée. Utilisez pipettes avec un tube d'aspiration bouche-surveillé de transférer les ovocytes / embryons d'un platà l'autre.
- Les aiguilles d'injection
- Manipuler les capillaires avec des gants pour assurer des conditions RNase-free. Utilisez le verre borosilicate avec des capillaires à incandescence avec des dimensions de 1,20 mm OD, ID 0,94 mm, longueur 10 mm.
- Si capillaires sont tirés sur le type de chauffage à filament aiguille extracteur décrit dans la liste des matières, utilisez les paramètres suivants: chaleur 600, Pull 50, Velocity 80, Temps 60, 200 ou 300. Pression Sinon, se assurer que la forme, qui est crucial pour injections réussies, est comme le montre la figure 2 avec les propriétés suivantes: 4-8 pm de diamètre de pointe extérieure, 2 cm de longueur conique.
NOTE: Aiguilles peut être tiré avant la saison de frai et utilisé pendant toute la saison.
- Solution rouge de phénol boursier 5% (4x)
- Préparer une solution fraîche avant chaque saison de frai.
- Dans un tube de 0,22 um-filtration, peser 25 mg de phénol poudre rouge.
- Ajouter 0,5 ml d'eau DNase et RNase àle tube contenant la poudre.
- Spin pendant 3-5 min à 18 000 xg à température ambiante pour filtrer stériliser la solution et enlever les cristaux qui pourraient obstruer l'aiguille d'injection.
- Conserver à 4 ° C ou stocker des aliquotes de 250 ul à -20 ° C.
- 0,25 mg de solution de poly-lysine / ml
- Préparer une solution fraîche avant chaque saison de frai.
- Dissoudre 5 mg de poly-L-lysine dans 20 ml d'eau distillée. Magasin aliquotes de 5 ml à -20 ° C.
- Utiliser un aliquot décongelé immédiatement et une seule fois pour assurer une adhérence robuste et reproductible des ovocytes à l'antenne poly-lysine.
- la synthèse d'ARNm
- Préparer une solution fraîche avant chaque saison de frai.
- Linéariser 5 ug d'ADN d'intérêt avec l'enzyme appropriée (généralement pendant 2 heures, à 37 ° C). Pour vérifier l'exhaustivité de la digestion, de fonctionner de 2% en volume du mélange de digestion sur un gel agarose-TBE 1% dans un tampon TBE à 150 W pendant 20 min.
- Extraire la lineaADN risé avec 25: 24: 1 de phénol (pH 8,0): chloroforme: alcool isoamylique. Vortex pendant 20 secondes, centrifugeuse 10 min à 18 000 xg et récupérer la phase aqueuse (supérieure).
- Extraire de nouveau la phase aqueuse avec 24: 1 de chloroforme: alcool isoamylique. Vortex pendant 20 secondes, centrifuger 10 min à 18000 xg et recueillir la phase aqueuse.
- Précipiter l'ADN linéarisé avec 100: 10: 300 ADN linéarisé: 3 M d'acétate de sodium (pH 5,2): 100% d'éthanol pendant une nuit à -20 ° C.
- Centrifugeuse 20 min à 18 000 g à 4 ° C. Rincer à l'éthanol à 70%.
- Centrifuger 10 min à 18 000 xg à 4 ° C. Laissez sécher et remettre en suspension dans l'eau sans RNase à une concentration finale de 0,5 ug / ul.
- On transcrit 1 ug d'ADN linéarisé en utilisant un kit de synthèse d'ARNm avec la polymerase appropriée, selon les instructions du fabricant.
- Extraire l'ARNm de 5: 1 de phénol (pH 4,7): une solution d'arrêt de chloroforme et d'acétate d'ammonium fourni avec le kit.
- Vortex pendant 20 secondes, CEntrifuge 10 min à 18 000 xg et recueillir la phase aqueuse.
- Extraire de nouveau la phase aqueuse avec 24: 1 de chloroforme: alcool isoamylique. Vortex pendant 20 secondes, centrifuger 10 min à 18000 xg et recueillir la phase aqueuse.
- Précipiter l'ARNm avec 100% d'isopropanol pendant la nuit à -20 ° C.
- Centrifugeuse 20 min à 18 000 g à 4 ° C. Rincer à 80% d'éthanol.
- Centrifuger 10 min à 18 000 xg à 4 ° C. Laissez le culot sec à la température ambiante pendant plus de 5-10 min comme il sera alors difficile de remettre en suspension. Remettre en suspension dans l'eau DNase et RNase à une concentration finale d'au moins 2 pg / pl pour assurer une concentration d'ARNm finale décent dans le mélange d'injection.
- Pour vérifier la qualité et la taille du produit de transcription, exécutez 0,5 pi de l'ARNm sur un 1% agarose-TBE gel sans RNase dans un tampon TBE à 150 W pendant 20 min. Magasin 2 aliquotes à -80 ° C.
- Plats Poly-lysine
REMARQUE: Poly-lysine coated plats sont utilisés pour immobiliser les ovocytes pendant l'injection.- Pour chaque culture cellulaire boîte de Pétri de 35 mm (5 au total), couvrir le fond de la boîte de Pétri avec 1 ml de la solution décongelée ml 0,25 mg / poly-lysine. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Pour chaque culture cellulaire boîte de Pétri de 35 mm (5 au total), transférer la solution de poly-lysine 0,25 mg / ml dans un autre 35 mm de culture cellulaire boîte de Pétri. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Jeter le ml solution à 0,25 mg / poly-lysine.
- Que les boîtes de Pétri à sec, à l'envers à la température ambiante pendant 2 heures.
- Stocker les plats de poly-lysine enveloppé dans une enveloppe en plastique à 4 ° C pour éviter la contamination pour une semaine maximum.
- plats d'agarose revêtues
NOTE: Ils sont utilisés pour la culture injecté embryons. L'agarose fournit un coussin pour les embryons injectés et les empêche de coller au fond de la boîte.- Assurez-eau de mer artificielle (ASW) en utilisant 37-38 g / L commsels erciales + 0,25 mM NaHCO 3 dans l'eau d'osmose inverse.
- Dissoudre l'agarose à une concentration de 1% à 0,22 um ASW-filtré par chauffage de la solution dans un four micro-ondes.
- Rapidement verser la solution d'agarose chaude d'un 35 mm boîte de Petri dans l'autre afin d'assurer un revêtement très mince agarose du plat.
- Conserver les plats d'agarose revêtues enveloppés dans Saran Wrap à 4 ° C pour éviter la contamination pendant une semaine maximum.
- mélange d'injection et le chargement des aiguilles d'injection
- Environ 2 heures avant de commencer les injections, faire un mélange d'injection en 2 ul dans RNase et de l'eau DNase avec des concentrations finales de 1 à 1,8 pg / pl de l'ARNm, 15% de glycérol, 1,25% de rouge de phénol.
REMARQUE: Les couleurs de rouge de phénol, la solution, ce qui permet le suivi de l'efficacité d'injection, et l'identification des embryons injectés avec succès. Glycérol favorise la diffusion de l'ARNm dans le ovocyte. - Centrifugeuse 4 min à 18 000 xg pourcristaux granulés. Garder sur la glace jusqu'à utilisation.
- Avec une pipette 10 ul, 0,5 ul de recueillir le mélange par injection, en évitant le fond du tube, où les cristaux ont été granulés.
- Remblai d'au moins deux aiguilles d'injection (en cas une pauses pendant l'injection) par pipetage la baisse de 0,5 pi de mélange d'injection à la grande ouverture de l'aiguille.
- Installer les aiguilles dans un récipient de stockage de liquide au fond à 4 ° C pour éviter l'évaporation du mélange d'injection. Laissez le mélange d'injection voyager lentement à la pointe de l'aiguille d'injection pendant au moins 1 heure pour minimiser la création de bulles.
- Magasin mélange d'injection supplémentaire à -80 ° C pendant un maximum de trois utilisations supplémentaires, après quoi détériore la qualité de l'ARNm (données non présentées).
- Environ 2 heures avant de commencer les injections, faire un mélange d'injection en 2 ul dans RNase et de l'eau DNase avec des concentrations finales de 1 à 1,8 pg / pl de l'ARNm, 15% de glycérol, 1,25% de rouge de phénol.
2. Collecte de matériel biologique, microinjection et culture d'embryons
- collecte des ovocytes et de sperme
NOTE: Voir Theodosiouet al. 12 pour un protocole détaillé pour induire la ponte et pour la collecte des gamètes.- les mâles et les femelles de choc dans ASW à 23 ° C pendant 24 heures.
- Une à deux heures avant le coucher du soleil, transférer les adultes dans des coupes individuelles en ASW à 19 ° C, car la plupart des adultes frayer 1-2 heures après le coucher du soleil.
- Rincer 35 mm boîtes de Pétri dans ASW filtrée et les laisser à l'envers sec pour éviter les ovocytes de coller au fond du plat.
- Après la ponte, de recueillir le sperme et ovocytes immédiatement avec une pipette de 1 000 pi.
- Gardez sperme et ovocytes séparer de amphioxus adultes car le contact est nuisible pour la santé des gamètes (données non présentées).
- En outre, éviter de surprendre les adultes, ce qui conduit à des mouvements qui dissipent, et donc diluer, des spermatozoïdes et ovocytes. Pour garder le sperme actif aussi longtemps que possible et d'optimiser le taux de fécondation, de recueillir le sperme aussi concentré que possible.
- Gardersperme sur de la glace dans un tube de 1,5 ml.
- Transfert ovocytes en filtrée ASW dans les 35 mm boîtes de Pétri pré-rincé.
- Transfert 100-500 ovocytes avec un précédemment tiré 300-400 um transfert pipette Pasteur à un autre 35 mm boîte de Petri pour effectuer les injections.
- Engrais le reste de l'embrayage en tant que témoin pour les spermatozoïdes et la qualité de l'ovocyte ou pour d'autres expériences.
- injection des ovocytes
- Installer l'aiguille d'injection sur le micromanipulateur à un angle 50 ° par rapport au plan horizontal.
REMARQUE: Angles de moins de 50 ° vont pousser les ovocytes autour sur le plat, tandis que des angles de plus de 50 ° ne permettra pas un suivi approprié de la position de l'aiguille par rapport à l'ovocyte. - Sous un microscope à dissection fluorescent avec 25X oculaires, transférer 30 ovocytes avec le 300-400 um transfert pipette Pasteur sur un plat poly-lysine contenant filtrée ASW.
- Déposez les ovocytes long d'une ligne à transporterinjections sur une manière ordonnée et pour distinguer injectés à partir d'ovocytes non-injecté. Injecter un petit nombre (30 ovocytes) pour réduire au minimum le temps d'exposition des ovocytes à la poly-lysine, ce qui tend à déformer les embryons en développement (données non présentées).
- Utiliser l'éclairage à fond noir pour rendre les ovocytes translucide comme possible.
- Avec le mouvement de la molette grossière micromanipulateur, amener l'aiguille d'injection à proximité d'un ovocyte.
- Avec une pince fine, ouvrir l'aiguille au niveau où la pointe commence à être courbé. Par pulsation avec l'injecteur, vérifier que mélange d'injection est en fait rouge se écoulant hors de l'aiguille.
- Au grossissement de 200x et avec le mouvement bouton fine de la micromanipulateur, déplacez doucement l'aiguille d'injection dans le noyau de l'ovocyte.
NOTE: Se il est inséré trop superficielle, la solution injectée ne sera pas rester à l'intérieur de l'ovocyte. Se il est inséré trop loin, l'ovocyte sera détruit. - Injecter avec 1-3 impulsions de 120 ms Durations et 1-10 psi de pression. Si l'aiguille est assez fine, injecter à débit continu à pression constante. Assurez-vous que le volume d'injection correspond à 1/5 à 1/3 du volume d'un seul ovocyte.
- Après l'injection, retirez l'aiguille rapidement pour éviter les fuites de l'ovocyte.
- Vérifiez que la solution injectée reste dans l'ovocyte et qui après quelques secondes, la solution injectée se répand dans l'ovocyte.
- Passez à la prochaine ovocyte en ligne.
- Gardez quelques embryons non-injecté de chaque série comme contrôle négatif pour estimer la fluorescence de fond lors de la numérisation pour les embryons injectés.
- Installer l'aiguille d'injection sur le micromanipulateur à un angle 50 ° par rapport au plan horizontal.
- La fertilisation, la sélection des embryons injectés et de la culture de l'embryon
- Fécondation des ovocytes dès qu'une série a été injectée. Comme la qualité des ovocytes diminue avec le temps, injecter et féconder les ovocytes dans les 1 h 12 après le frai.
- Selon la concentration du sperme, ajouter 5/1 gouttes de sperme et d'ovocytestourbillonner le plat.
NOTE: L'enveloppe de fertilisation devrait être apparent sur les embryons après environ 1 min. - Autoriser les embryons se détacher de l'antenne poly-lysine, tout en injectant une autre série d'ovocytes.
- Transférer les embryons avec le 600 um transfert pipette Pasteur dans une boîte de Pétri agarose revêtues. Retirez les embryons de le plat poly-lysine dès que possible, si possible avant le stade 2 cellules.
NOTE: En cas d'exposition prolongée à la poly-lysine, les embryons ont tendance à devenir blastulas densément-emballés, aplati sur le côté touchant le fond du plat. - Au stade 2 cellules à 4 cellules, sélectionnez avec une portée de dissection fluorescente avec filtre DSR les embryons succès injectées, ce est à dire, ceux qui ont une morphologie normale qui présentent un signal rouge fluorescent rouge de phénol dérivés.
- Garder les embryons en culture in filtrée ASW en boîtes de Pétri agarose revêtu à 19 ° C jusqu'à ce que la scène souhaitée pourdans l'imagerie in vivo.
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Representative Results
Le protocole détaillé ci-dessus constitue la base de la micro-injection de B. ovocytes lanceolatum et donc pour l'introduction dans le développement B. embryons de lanceolatum d'ARNm codant pour des protéines fluorescentes pour l'imagerie in vivo. Bien que la technique est certainement robuste et fiable, le taux d'injections réussies utilisant ce protocole reste variable (tableau 1). L'explication très probable pour ce fait intriguant, ce est l'extrême variabilité des embrayages d'ovocytes: différents lots d'œufs ne se comportent en effet très différemment, lorsqu'ils sont soumis à la pression d'injection. Certains ovocytes sont plutôt élastique et ont tendance à se aplatir au fond du plat, tandis que d'autres sont assez raide et restent ronde lors de l'injection. En outre, certains lots d'ovocytes ont tendance à gonfler les membranes de chorion lors de l'injection, tandis que d'autres simplement lyse (données non présentées). Aucune corrélation évidente n'a pu être établi entre le comportement de l'ovocyte lors de l'injection et de l'embryonle développement après la fécondation. Il est donc difficile de prévoir quelle catégorie d'ovocytes est le mieux adapté pour la microinjection. Cependant, après la fécondation, les embryons en cours de développement normal peuvent être identifiés aussi tôt que les étapes de clivage: 2-cellule à embryons au stade 4 cellules peut être considérée comme normale lorsque la surface de contact entre les blastomères est faible, tandis qu'un embryon clivage étapes compactée, où les cellules individuelles sont difficiles à discerner, est certainement anormale.
Dans nos mains, la moitié environ des ovocytes ne survivent pas le traumatisme causé par l'injection et environ la moitié des embryons qui survivent l'exposition d'injection d'un marqueur fluorescent spécifique. Ainsi, nous estimons que ce protocole d'injection, entre 50 et 120 embryons peuvent être injectés avec succès sur un jour de ponte donnée rendement entre 15 et 60 embryons marqués.
La fluorescence rouge du rouge de phénol dans deux cellules d'embryons au stade 4 cellules marque très fiable embryons qui ontété correctement injecté, en tant que 100% des embryons sélectionnés de cette manière produire par la suite les protéines fluorescentes codées par l'ARNm injecté. En outre, il existe une corrélation positive très nette entre l'intensité de la fluorescence rouge de phénol au stade 2 cellules à quatre cellules et le moment de l'apparition de la fluorescence produite par les protéines codées par l'ARNm injecté. Cette corrélation permet donc l'identification des embryons qui ont reçu la plus grande quantité d'ARNm au cours du processus d'injection.
Si le signal de la protéine fluorescente codée par l'ARNm injecté ne est pas détecté après la sélection d'embryons Rouge-positifs phénol, nous recommandons d'exécuter le mélange d'injection sur un gel sans RNAse afin de vérifier la dégradation de l'ARNm ou de piégeage (figure 3) . Dans la piste 1, une bande d'ARNm intact est détectée. L'injection de ce mélange conduit à une forte signal fluorescent dans l'embryon. Au contraire, dans la piste 2, qui correspond à un autre expérit où le rouge de phénol a été remplacé par le Dextran colorant dans le mélange (voir la discussion pour plus de détails), l'ARNm semble avoir été piégé par le colorant Dextran et l'injection de ce mélange jamais conduit à signal fluorescent dans l'embryon.
En utilisant cette technique de micro-injection et de nos constructions (tableaux 2 et 3, fichier supplémentaire 1) (voir la discussion), on peut donc produire de manière reproductible marquage fluorescent homogène dans tout l'embryon avec mCherry ou eGFP dans le noyau et avec eGFP à la membrane (Figure 4) . Le protocole de formation d'image utilisée pour générer la figure 4 sera décrit par ailleurs (Faure et al., En préparation). En fonction de la quantité d'ARNm injecté, l'expression de la protéine à fluorescence devient détectable typiquement entre 16 cellules (figure 4A) et les étapes 64 de cellules et reste détectable au moins jusqu'à la fin du stade neurula (données non présentées). Les étapes ultérieures ne ont pas été testés. Le signal nucléaireapparaît généralement plus tôt que le signal de la membrane, éventuellement en raison de la nature intrinsèque diffus de la membrane par rapport à la compacité du noyau (données non présentées). Bien que nous ne avons pas été contrôlée systématiquement, les embryons injectés avec à la fois un nucléaire et un marqueur de la membrane semble être moins bonne santé que embryons injectés exclusivement avec une étiquette de eGFP nucléaire. Curieusement, cet effet semble être indépendant de la quantité totale d'ARNm injecté comme la quantité totale d'ARNm injecté est le même, que ce soit une ou deux espèces d'ARNm sont inclus dans le mélange (données non présentées).
Figure 1: Construire détails. Sketches de (A) la membrane ciblée eGFP (eGFP: boîte de CAAX), (B) le nucléaire ciblée eGFP (H2B: eGFP) et (C) le nucléaire ciblée mCherry (H2B: mCherry) construit are affiche.
Figure 2: Forme d'une aiguille d'injection représentative. (A) Le cône est d'environ 2 cm de longueur et les courbes d'aiguille à l'extrémité. Barre d'échelle = 2 mm. (B) Agrandissement de la zone encadrée en A. La position pour écrêter l'aiguille (flèche) est dans la courbe de l'aiguille. La pointe de l'aiguille est indiquée par la flèche. Barre d'échelle = 500 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Interactions d'ARNm et colorants fluorescents sélectionnés (A) Résultat de la migration d'un mélange contenant l'ARNm et rouge de phénol dans le couloir 1 etde l'ARNm et Texas Red dextran (à une concentration finale de 3,3 mg / ml) dans la piste 2. (B) suite à la migration d'un mélange contenant l'ARNm et Oregon Green dextran (à une concentration finale de 3,3 mg / ml) dans le couloir 3, de l'ARNm et de dextrane FITC (à une concentration finale de 3,3 mg / ml) dans la piste 4 et de l'ARNm et la rhodamine dextran (à une concentration finale de 3,3 mg / ml) dans la piste 5. Gel temps de migration en A et B était différent. Par souci de clarté, le rectangle noir dans un masque une réflexion de la lumière et les lignes pointillées délimitent les voies de migration. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: rendu 3D (logiciel Amira) d'embryons de amphioxus injecté avec des ARNm codant pour des protéines fluorescentes images sont.extrait de time-lapses 3D acquis sur un Leica SP5 deux photons laser microscope à balayage optimisé embryon au stade (A) 16 cellule exprimant H2B nucléaire:.. eGFP (B) Gastrula embryon au stade exprimer H2B nucléaire: mCherry et la membrane ciblée eGFP:. boîte de CAAX (C) Gastrula embryon au stade exprimer H2B nucléaire: mCherry et eGFP membrane ciblée: boîte de CAAX. La section optique montre des cellules internes avec mCherry nucléaire et signaux de eGFP associées à la membrane. La barre d'échelle = 50 um.
| Essai numéro | Injecté ARNm de construction | Nombre d'embryons injectés | Nombre d'embryons marqués |
| 1 | H2B: eGFP | 53 | 23 |
| 2 | H2B: eGFP | 50 | 31 |
| 3 | H2B: eGFP | 48 | 20 |
| 4 | H2B: eGFP | 54 | 24 |
| 5 | H2B: eGFP | 114 | 47 |
| 6 | H2B: eGFP | 80 | 46 |
| 7 | H2B: eGFP ou | 62 | 24 |
| H2B: mCherry + eGFP: boîte de CAAX | |||
| 8 | H2B: eGFP | 87 | 60 |
| 9 | H2B: eGFP | 77 | 45 |
| 10 | eGFP: boîte de CAAX ou | 110 | 51 |
| H2B: mCherry + eGFP: boîte de CAAX | |||
| 11 | H2B: mCherry + eGFP: boîte de CAAX | 45 | 26 |
| 12 | H2B: mCherry + eGFP: CAboîte de AX | 52 | 16 |
| 13 | eGFP: boîte de CAAX ou | 74 | 35 |
| H2B: mCherry + eGFP: boîte de CAAX | |||
| Total | 906 | 448 | |
| Taux de réussite | 49% |
Tableau 1:. Taux de réussite d'injection Les constructions injectés, le nombre d'embryons injectés qui ont survécu à l'injection et le nombre de labellisés (ou succès injectés) embryons sont indiquées, comme ce est le pourcentage global d'injections réussies.
| Construire | Position dans la pCS2 + vecteur | Séquence originale | Séquence mutée |
| pCS2 + eGFP: boîte de CAAX | 79..87 | GGA TCC ACC | ACC GT C A C |
| pCS2 + H2B: eGFP | 82..90 | TCC GAC ACG | Un CC G T C A AC |
| pCS2 + H2B: mCherry | 82..90 | TCC GAC ACG | Un CC G T C A AC |
Tableau 2:. Optimisation indicative des séquences de Kozak et des séquences de Kozak origine mutés sont indiqués pour chaque construction. Les mutations introduites récupérer la séquence Kozak du B. gène d'actine de lanceolatum, qui ressemble de très près celle de la séquence présumée théorique préféré Kozak des amphioxus (A / CGA / CG / TTC A / GAC ATG TG / CT).
| pCS2 + eGFP: boîte de CAAX | |||
| Codon d'origine | Codon muté | Position dans la pCS2 + vecteur | |
| (Niveau d'utilisation) | (Niveau d'utilisation) | ||
| GTA | GT G | 154..156 | séquence eGFP |
| (0,08) | (0,43) | ||
| AGA | AG G | 814..816 | Linker |
| (0,09) | (0,27) | ||
| pCS2 + H2B: eGFP | |||
| Codon d'origine | Codon muté | Position dansl'pCS2 + vecteur | |
| (Niveau d'utilisation) | (Niveau d'utilisation) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | Séquence H2B |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | Séquence H2B | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 568..570 | séquence eGFP | ||
| CTA | CT G | 226..228 | Séquence H2B |
| (0,06) | (0,51) | ||
| pCS2 + H2B: mCherry | |||
| Codon d'origine | Codon muté | Position dans la pCS2 + vecteur | |
| (Niveau d'utilisation) | (Niveau d'utilisation) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | Séquence H2B |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | Séquence H2B | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 913..915 | séquence mCherry | ||
| CTA | CT G | 226..228 | Séquence H2B |
| (0,06) | (0,51) | ||
Tableau 3: optimisation provisoire de l'utilisation de codon. Des codons d'origine et mutés sont indiqués pour chaque construction. Bien que cela ne ait pas été testé expérimentalement, la Mutati introduitons sont destinés à optimiser la traduction de l'ARNm en amphioxus.
Fichier supplémentaire 1: construire des séquences Les séquences nucléotidiques de (A) la membrane ciblée eGFP. (EGFP: boîte de CAAX), (B) le nucléaire ciblée eGFP (H2B: eGFP) et (C) l'mCherry nucléaire ciblée (H2B : mCherry) constructions sont données dans le contexte de la pCS2 + squelette du vecteur. Les principaux domaines codés par chacune des constructions sont indiquées en couleur: eGFP (vert), mCherry (rouge), signal de localisation de la membrane de HRAS (boîte de CAAX) humaine (bleu cyan), le poisson-zèbre exon histone 2B (H2B) (jaune).
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Discussion
Dans cet article, nous présentons, pour la première fois, un protocole détaillé et reproductible pour l'injection de B. ovocytes lanceolatum, qui, après B. floridae 13,14 et B. belcheri 15, est donc la troisième espèce de amphioxus, pour lesquels une telle technique a été décrite. Fait important, le protocole décrit ici comprend également la description des systèmes de vecteurs adaptés pour la production de protéines fluorescentes dans B. lanceolatum injectées produites à partir d'ARNm in vitro (décrit ci-dessous). Ensemble, ces nouveaux outils permettent en imagerie in vivo du développement précoce de l'amphioxus et l'analyse des comportements dynamiques de cellule qui sous-tendent les premiers événements morphogénétiques dans l'embryon, comme le clivage et la gastrulation.
En général, la technique de micro-injection a l'avantage de permettre la fourniture, dans une cellule cible, d'un volume prédéfini d'un composé spécifique. Avec ce qui est saide, une limitation majeure de cette technique est le nombre limité de cellules qui peuvent être injectées au cours d'une expérience donnée. Par exemple, le protocole décrit ici pour B. lanceolatum permet l'injection de 100 à 120 œufs par séance d'injection, dont environ la moitié sera marqué (tableau 3). Pour B. floridae, les chiffres sont très similaires avec 500 ou plus d'oeufs qui peuvent être injectés par jour, dont plus de 50% survivront à l'injection 13,14. Bien que les protocoles d'injection d'B. lanceolatum et B. floridae oeufs ressemblent étroitement, le B. belcheri technique est légèrement différent: les œufs sont placés sur des poly-lysine lamelles et les injections sont effectuées sous un microscope inversé en utilisant un micro-injecteur d'une autre marque. Cette approche permet apparemment l'injection comprise entre 200 et 300 B. oeufs belcheri par séance d'injection avec un taux de survie, après l'éclosion au stade de neurula, of 89,39% à 95,83% 15. Compte tenu des différences dans les protocoles, il est difficile de savoir si les différences dans les taux de réussite sont dues aux différences liées à l'espèce ou protocolaires. Il faudrait tester les différentes espèces en parallèle avec les différents protocoles de répondre à cette question. Néanmoins, pour augmenter encore le nombre d'ovocytes ciblées pour la livraison de composés exogènes, d'autres protocoles devront être développés pour amphioxus. techniques possibles comprennent l'électroporation, le bombardement avec des microparticules, la lipofection, transduction et 4. Fait à noter, l'électroporation a déjà été établie comme une technique standard pour l'introduction de matériel exogène dans fécondés oeufs ascidie de tuniciers, un autre modèle de chordés invertébrés utilisée pour étudier l'évolution des mécanismes de développement 8.
Pour la micro-injection efficace et ensuite une imagerie in vivo des protéines fluorescentes, propiceLes vecteurs d'expression sont un préalable obligatoire. À cette fin, trois plasmides ont été développés et validé expérimentalement (figure 1, complémentaire Fichier 1): pour le ciblage de la membrane, le gène eGFP a été fusionnée à son extrémité 3 'à la boîte HRAS CAAX humaine (résultant dans un eGFP: boîte de construction CAAX ) 16 et, pour le ciblage nucléaire, à la fois la eGFP et les gènes mCherry ont été fusionnés à leurs extrémités 5 'de l'exon poisson zèbre histone 2B (H2B) (résultant, respectivement, dans un H2B: eGFP et un H2B: construction d'mCherry) 17. Chacune de ces constructions a été clone dans le plasmide pCS2 + contenant un site de polyadénylation tardif du SV40 et un promoteur SP6 in vitro permettant la synthèse d'ARNm coiffé 18,19. En outre, dans le but d'optimiser la traduction des constructions dans B. lanceolatum, à la fois les séquences de Kozak et les codons ont été adaptés en utilisant une mutagenèse nucléotidique unique (tableaux 2 et 3, fichier supplémentaire 1). Based sur l'approche par Nakagawa 20, une petite piscine de B. lanceolatum gènes a été analysée pour identifier une séquence de Kozak plus pratique dans cette espèce. La séquence connue la plus proche naturelle de cette séquence préférée théorique est celle du B. lanceolatum gène de l'actine. Les séquences de Kozak des trois constructions sont donc modifiés pour correspondre à cette séquence du gène de l'actine. En outre, l'usage des codons de B. lanceolatum a été analysée en utilisant la base de données d'usage des codons et les codons 21 dans les constructions avec une faible probabilité d'utilisation dans B. lanceolatum (<10%) ont été remplacés, autant que possible, par des codons équivalents avec une probabilité d'utilisation supérieur.
Les résultats des injections montrent que le niveau d'expression de la protéine à partir de ces vecteurs est approprié pour l'imagerie in vivo des analyses. Etant donné que la sortie de l'expression des vecteurs modifiés n'a pas été comparée à celle de constructions non modifiées, on ne peut pas conconclure sur l'efficacité des modifications qui ont été introduites dans le consensus de Kozak et des séquences codantes. Il serait certainement intéressant de tester si ces modifications ont en effet un impact sur les niveaux d'expression de protéines. Le long de ces lignes, une analyse récente basée sur des micro-injections dans B. belcheri suggère que d'autres, des vecteurs non modifiés peuvent également être utilisés pour la synthèse de l'ARNm pour la production de la protéine fluorescente dans amphioxus 15.
Amphioxus contient des protéines endogènes vertes fluorescentes 22. Les embryons présentent donc de faibles niveaux de vert ainsi que la fluorescence rouge (nos observations non publiées). Cependant, ces niveaux endogènes sont négligeables par rapport aux niveaux de fluorescence résultant de l'injection de nos constructions d'ARNm. Par conséquent, la fluorescence endogène des embryons de amphioxus ne perturbe pas les observations expérimentales avec des jumelles fluorescentes ou multi-microscopes à balayage laser. En outreLes expériences d'injection révèlent que l'intensité de la fluorescence exogène produite par injection d'ARNm dépend de la quantité réelle de matière injectée, qui est directement corrélée avec la concentration finale de l'ARNm utilisé dans le mélange d'injection. B. lanceolatum embryons ont tendance à tolérer une concentration allant jusqu'à 1,8 pg / pl de l'ARNm, bien que, indépendant de la concentration de l'ARNm proprement dit, certaines combinaisons d'ARNm semblent être moins tolérés par B. lanceolatum embryons que d'autres. Ainsi, la combinaison de la membrane nucléaire et mCherry eGFP ARNm semble être plus toxique que l'injection nucléaire de eGFP seule.
Texas Red dextran a déjà été utilisé comme traceur pour les injections réussies dans des ovocytes de amphioxus 13-15. Curieusement, un signal fluorescent provenant de l'ARNm injecté n'a jamais été obtenue après injection de solutions contenant Texas Red dextran et cela dans les deux ovocytes amphioxus (n = 4 expériences) et zebrafiembryons de poisson (n = 3 expériences). Quand un mélange d'injection contenant l'ARNm transcrit in vitro et Texas Red dextran est chargé sur un gel d'agarose RNase-free (Figure 3, piste 2), la bande correspondant à l'ARNm est absent. En revanche, l'ARNm transcrit in vitro est détectable sur un gel d'agarose RNase-free en présence de rouge de phénol (Figure 3, piste 1). Étant donné qu'il n'y a aucune preuve de la dégradation de l'ARNm sur le gel, ces résultats suggèrent que Texas Red dextran tend à piéger ARNm. Lorsqu'il est utilisé dans une solution d'injection, Texas Red dextran peut ainsi empêcher la traduction de l'ARNm injecté. Suite à cette observation, les interactions d'autres colorants (FITC dextran, la rhodamine dextrane et le dextrane Oregon Green) avec de l'ARNm ont été testés, à la fois sur RNase gels d'agarose et par injection dans B. lanceolatum ou le poisson zèbre (figure 3). Les analyses indiquent que FITC dextran ne piège ARNm sur gel (Figure 3, lane 4) et conduit à l'expression de la protéine fluorescente dans le poisson zèbre (n = 1 essai), mais pas dans les embryons de B. lanceolatum (expérience n = 1) (données non présentées). Rhodamine dextrane ne piège ARNm sur gel (Figure 3, piste 5) et conduit à l'expression de la protéine fluorescente dans les embryons de poisson zèbre (n = 1 expérience) (données non présentées), mais son activité peut malheureusement pas être testée en B. embryons lanceolatum. Enfin, comme le dextrane Oregon Green migre au même niveau que l'ARNm, l'ARNm de piégeage ne pouvait être évalué par gel d'agarose (figure 3, ligne 3). Cette dernière colorant empêché l'expression de protéine fluorescente dans amphioxus (n = 1 expérience), mais les embryons de poisson zèbre ne (n = 1 essai) (données non présentées). En somme, ces données suggèrent que certains dextranes peuvent efficacement inhiber la traduction des ARNm injecté. Étant donné que les expériences dose-réponse ne ont pas été effectuées, ces données sont qualitatives. Curieusement, cet effet inhibiteur semble être dépendanteles espèces animales (poisson zèbre rapport de amphioxus), qui met en évidence la nécessité de nouvelles études visant à comprendre les mécanismes sous-jacents cet effet. En outre, ces résultats appellent analyses préparatoires, si dextranes doivent être utilisés comme traceurs de couleur pour préparations injectables.
Le développement de la technique de micro-injection pour un modèle donné ouvre la porte à des manipulations spécifiques d'un gène. Dans amphioxus, par exemple, la première description de micro-injections (dans B. floridae) a été suivie par le knock-down réussi d'un gène, hox1, en utilisant des injections d'oligonucléotides morpholino 23,24. Le nombre de B. lanceolatum embryons qui peuvent être injectés avec succès tous les jours en utilisant le protocole présenté ici est certainement compatible avec ce type d'étude. En outre, avec ces méthodes et les nouvelles constructions à portée de main, on peut maintenant également concevoir et réaliser des études de surexpression et knockdown par injection d'ARNm d'intérêt (natif ou dominant-negformes ative) ou utilisent d'autres stratégies pour perturber l'expression des gènes (par exemple microRNA- ou stratégies basées sur les shRNA). Jusqu'à présent, les injections de amphioxus ne peuvent être effectuées au stade de l'ovocyte, simplement parce que ce est la seule étape qui peut efficacement être immobilisé. Après injection au stade de l'ovocyte, la molécule d'intérêt est exprimé de façon ubiquitaire dans l'embryon. Ainsi, si l'expression génique doit être modifiée ou contrôlée que dans un sous-ensemble de cellules, des constructions d'ADN doivent être injectés, tels qu'ils sont exprimés dans le mosaically amphioxus embryon en développement 15,25-27. ADN injections de construction peut également être utilisé pour tester l'activité des régions régulatrices de amphioxus au cours du développement dans des essais transitoires transgéniques, avec l'inconvénient susmentionné d'expression mosaïque 15,25-27.
En fin de compte, la technique de micro-injection de amphioxus ouvre également la porte pour la transgenèse stable, y compris le knock-out ciblée ou knock-in des loci génétiques spécifiques. Systèmes pour l'insertion stable de l'ADN exogène existent déjà, par exemple avec le système à base de transposons Tol2 poisson qui semble fonctionner dans les deux insectes et les vertébrés Amniotes 28. En outre, les approches fondées sur les nucléases modifiées en doigt de zinc (ZFN) ou transcription nucléases effectrices activatrices comme (Talens) ou des outils d'édition du génome ARN-guidée (CRISPR / Cas système) pourrait être utilisé pour générer des mutations ponctuelles et knock-in modifications spécifiques des régions du génome 29. Ces efforts nécessiteront l'élevage de l'année des amphioxus en captivité, qui a déjà été mis en place pour B. belcheri 11,30 et B. japonicum 30,31 et est actuellement développé pour A. lucayanum, B. floridae et les espèces amphioxus présentées ici, B. lanceolatum 32.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à souligner l'appui par le "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette» pour l'élevage. Ce travail a été soutenu par des fonds de l'ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 et ANR-11-JSV2-002-01) à Michael Schubert, par la subvention de l'Union européenne FP6 "Embryomics» et par la subvention de l'ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "à Jean-François Nicolas et Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho est financé par une bourse de doctorat FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
Les demandes pour les vecteurs décrits ici peuvent être adressées directement aux auteurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | Culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μm |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 μm |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P9155 | |
| H2O, DNase/RNase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | Sigma | C0549 | |
| 5:1 phenol pH 4.7:chloroform | Sigma | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200X magnification | Leica | MZ16F | 25X oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Fine forceps | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
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