Summary
Vi rapporterar här robusta och effektiva uttryck av fluorescerande proteiner efter mRNA injektion i obefruktade oocyter av Lansettfisk. Utvecklingen av mikroinjektion tekniken i denna basala chordate kommer att bana väg för långtgående tekniska innovationer inom detta framväxande modellsystem, inklusive in vivo imaging och genspecifika manipulationer.
Introduction
Under utveckling, ger en enda cell upphov till en hel organism i en mycket komplex process som involverar både celldelningar och rörelser. För att bättre förstå de biologiska principer dynamiken i cellens beteende, har utvecklingsbiologer börjat använda fluorescens-baserade in vivo avbildningstekniker. Specifika facken i celler, såsom cellmembran, kan antingen märkas av behandlingar med fluorescerande färger, ett tillvägagångssätt hämmas av brist på specificitet och vävnadspenetration 1, eller av den specifika införande i embryot av exogena mRNA kodar fluorescerande proteiner 2. Olika tekniker kan användas för effektiv leverans av exogena föreningar, såsom mRNA. Dessa innefattar, men är inte begränsade till, mikroinjektion, elektroporering, bombardemang med mikropartiklar, lipofektion och transduktion 3,4. Även om alla dessa metoder kan användas för att införa exogena föreningar till enväxande embryot, bara mikroinjektion tillåter tillämpningen av fördefinierade och exakta mängder i varje cell 3. Mikroinjektion tekniker har beskrivits för alla större utvecklingsmodellsystem 4 (t.ex. fruktflugor, nematod maskar, zebrafisk, grodor, möss) såväl som för några alternativa modeller 4, inklusive de som används för jämförande studier som syftar till att förstå utvecklingen av utvecklingsmekanismer (t.ex. havsanemoner, Annelid maskar, sjöborrar, ascidian manteldjur, den Lansettfiskar amphioxus).
Cephalochordates, som tillsammans med manteldjur och ryggradsdjur fastställer chordate fylum, är särskilt väl lämpade modeller för att studera utvecklingen av chordates och diversifieringen av ryggradsdjur från en ryggradslös förfader 5-8. Den Lansettfiskar härstamning avvek mycket tidigt under chordate evolution; och ännu existerande cephalochordates, som indelas i tre släkten (Branchiostoma, Asymmetron och Epigonichthys), liknar ryggradsdjur både vad gäller övergripande anatomi och genomet arkitektur 5-8. Av de cirka 30 arter av cephalochordates som har beskrivits hittills, fem är tillgängliga för embryologiska och utvecklingsstudier 6,9: Asymmetron lucayanum (Bahama LANSETTFISK), Branchiostoma floridae (Florida amphioxus), Lansettfisk (den europeiska amphioxus), Branchiostoma belcheri (den kinesiska amphioxus) och Branchiostoma japonicum (den japanska amphioxus). Mogna vuxna i tre av dessa arter (B. lanceolatum, B. belcheri och B. japonicum) kan förmås att leka on-demand under häckningssäsongen 10,11. Dessutom, åtminstone för B. lanceolatum, kan effektiv lek också induceras i artificiellt havsvatten 12, vilket gör detta särskilt Lansettfiskar arter tillgänglig för labotalet som inte har tillgång till naturligt havsvatten. Kombinationen, i B. lanceolatum, en bekväm och pålitlig tillgång till embryon med en effektiv leveransmetod, såsom mikroinjektion, hittills den enda leverans teknik utvecklad i amphioxus (i både B. floridae och B. belcheri) 13-15, kommer att möjliggöra utvecklingen av en roman svit av manipulativa tekniker, bland annat härstamning tracing- och dynamisk cellbeteendebaserade strategier.
Ett protokoll för effektiv mikroinjektion av mRNA för att uttrycka fluorescerande proteiner i B. lanceolatum embryo följaktligen utvecklats. Dessutom, för att ge en grundläggande verktygslåda för live avbildning av B. lanceolatum embryon undersöktes vektorsystem utvecklats som tillåter membranassocierat och nukleär expression av fluorescerande proteiner. För membraninriktning förhöjdes grönt fluorescerande protein (EGFP) fusionerad till den humana HRAS CAAX boxen och nukleär lokalisering av mCherry och EGFP varerhålls genom sammansmältning till zebrafisk histon 2B (H2B) exon (Figur 1, Kompletterande Arkiv 1). Dessutom med målet att optimera protein översättning, de Kozak-sekvenser och kodon av konstruktionerna har modifierats och anpassats till användning i B. lanceolatum. Sammantaget kommer den injektionsteknik och expressionsvektorer presenteras här tjäna som underlag för generering av nya experimentella metoder för cephalochordates, särskilt analyser använder den senaste fluorescens-baserade in vivo avbildningstekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av instrument och reagens
- Överför Pasteur pipetter
- Generera en serie överföringspasteurpipetter med olika spetsdiametrar genom att dra 230 mm långa pasteurpipetter ovanför en flamma vid olika hastigheter. Kontrollera att avsmalningen är så lång som möjligt för smidig och finreglering av aspiration.
- Med en diamant rits, skrapa pipetten längs en linje vinkelrät mot längden av pipetten. Med båda händerna, drar pipetten parallellt med sin längd för att generera en trubbig cut. Snabbt flame-polish pipetten utan tätnings spetsen.
- Variera diameter spetsen med skede av oocyter / embryon som skall pipetteras: 300-400 nm för obefruktade ägg (cirka 150 mikrometer i diameter), 600 nm för befruktade ägg (cirka 500 mikrometer i diameter), 200-400 nm för streckade neurulae. Använd pipetter med en mun-övervakade sugrör att överföra oocyter / embryon från en maträtttill en annan.
- Injektionsnålar
- Manipulera kapillärerna med handskar för att säkerställa RNas fria betingelser. Använd borosilikatglas med glödlampor kapillärer med måtten OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, längd 10 mm.
- Om kapillärer dras på vilken typ av uppvärmning-fila nål avdragare beskrivs i Materials List, använd följande inställningar: Heat 600, Pull 50, Velocity 80, Tid 60, tryck 200 eller 300. Annars se till att formen, vilket är avgörande för framgångsrika injektioner, är såsom visas i fig 2 med följande egenskaper: 4-8 | im yttre spetsdiameter, 2 cm avsmalnande längd.
OBS: Nålar kan dras inför lekperioden och användas under hela säsongen.
- 5% fenolrött förrådslösning (4x)
- Bered färsk före varje lekperioden.
- I en 0,22 um-filtreringsröret, väg upp 25 mg fenolrött pulver.
- Lägg 0,5 ml DNase- och RNas-fritt vatten tillröret med pulvret.
- Snurra under 3-5 min vid 18000 xg vid rumstemperatur för att filtrera-sterilisera lösningen och avlägsna kristaller som kan sätta igen injektionsnålen.
- Förvaras vid 4 ° C eller lagra 250 | il alikvoter vid -20 ° C.
- 0,25 mg / ml poly-lysin lösning
- Bered färsk före varje lekperioden.
- Lös 5 mg av poly-L-lysin i 20 ml destillerat vatten. Store 5 ml alikvoter vid -20 ° C.
- Använd en upptinad alikvot omedelbart och endast en gång för att säkerställa reproducerbar och robust vidhäftning av äggceller till poly-lysin-belagda maträtt.
- mRNA-syntes
- Bered färsk före varje lekperioden.
- Linjärisera 5 pg av DNA av intresse med den lämplig enzym (vanligtvis under 2 h, vid 37 ° C). För att kontrollera fullständigheten av matsmältningen, kör 2% i volym av uppslutningsblandningen på en 1% agaros-TBE-gel i TBE-buffert vid 150 W under 20 min.
- Utdrag linea-auktoriserad DNA med 25: 24: 1 fenol (pH 8,0): kloroform: isoamylalkohol. Vortex för 20 sek, centrifug 10 min vid 18.000 xg och samla vatten (övre) fasen.
- Extrahera vattenfasen åter med 24: 1 kloroform: isoamylalkohol. Vortexa i 20 sek, centrifugera 10 min vid 18000 xg och samla den vattenhaltiga fasen.
- Fällning den linjäriserade DNA med 100: 10: 300 linjäriserad DNA: 3 M natriumacetat (pH 5,2): 100% etanol över natten vid -20 ° C.
- Centrifugera 20 min vid 18000 xg vid 4 ° C. Skölj i 70% etanol.
- Centrifugera 10 min vid 18000 xg vid 4 ° C. Låt torka och återsuspendera i RNas-fritt vatten vid en slutkoncentration av 0,5 ug / ul.
- Transkribera 1 ug av linjäriserad DNA med användning av en mRNA-syntes-kit med den lämpliga polymeras, enligt tillverkarens instruktioner.
- Extrahera mRNA med 5: 1 fenol (pH 4,7): kloroform och ammoniumacetat stopplösning som medföljer kitet.
- Vortex för 20 sek, centrifuge 10 min vid 18000 xg och samla den vattenhaltiga fasen.
- Extrahera vattenfasen åter med 24: 1 kloroform: isoamylalkohol. Vortexa i 20 sek, centrifugera 10 min vid 18000 xg och samla den vattenhaltiga fasen.
- Fällning mRNA med 100% isopropanol över natten vid -20 ° C.
- Centrifugera 20 min vid 18000 xg vid 4 ° C. Skölj i 80% etanol.
- Centrifugera 10 min vid 18000 xg vid 4 ° C. Låt pellets torrt i rumstemperatur längre än 5-10 min eftersom det då blir svårt att resuspendera. Resuspendera i DNase- och RNas-fritt vatten till en slutlig koncentration av minst 2 ug / ul att garantera en hygglig slutlig mRNA-koncentrationen i injektionsblandningen.
- För att kontrollera kvaliteten och storleken av transkriptionsprodukten, kör 0,5 | il av mRNA på en RNas-fri 1% agaros-TBE-gel i TBE-buffert vid 150 W under 20 min. Store 2 | il alikvoter vid -80 ° C.
- Poly-lysin-belagda rätter
OBS: Poly-lysin coated rätter används för att immobilisera oocyterna under injektion.- För varje 35 mm cellodlingspetriskål (5 totalt), täcka botten av petriskål med 1 ml av den tinade 0,25 mg / ml poly-lysin lösning. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- För varje 35 mm cellodlingspetriskål (5 totalt), överföra 0,25 mg / ml poly-lysin lösning in i en annan 35 mm cellodlingspetriskål. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Kassera 0,25 mg / ml poly-lysin lösning.
- Låt petriskålarna torr, upp-och-ned vid rumstemperatur i 2 h.
- Förvara poly-lysin-belagda rätter insvept i en plastfolie vid 4 ° C för att undvika kontaminering i en vecka max.
- Agarose drage rätter
OBS: De används för att kultur injicerade embryon. Agarosen ger en kudde för injicerade embryona och hindrar dem från att fastna i botten av skålen.- Gör artificiellt havsvatten (ASW) med 37-38 g / L commercial salter + 0,25 mM NaHCO 3 i omvänd osmos.
- Lös agaros till en 1% koncentration i 0,22 ^ m-filtrerad ASW genom uppvärmning av lösningen i en mikrovågsugn.
- Snabbt häll den varma agaroslösningen från en 35 mm petriskål i ett annat i syfte att säkerställa en mycket tunn agaros beläggning av skålen.
- Förvara agarosen belagda rätter emballeras i Saran wrap vid 4 ° C för att undvika kontaminering i en vecka max.
- Injektion mix och lastning av injektionsnålar
- Cirka 2 tim innan injektionerna, gör en 2 pl injektion mix i RNase- och DNas-fritt vatten med slutliga koncentrationer av 1-1,8 mikrogram / l av mRNA, 15% glycerol, 1,25% fenolrött.
OBS: fenolrött färgerna lösningen, som medger övervakning av injektionseffektiviteten och identifieringen av framgångsrikt injicerade embryon. Glycerol gynnar mRNA diffusion inom äggcellen. - Centrifugera 4 minuter vid 18.000 xg för attpellets kristaller. Håll på is fram till användning.
- Med en 10 l pipett, samla 0,5 pl av injektionsblandningen, undvika botten av röret, där kristallerna har pelleteras.
- Återfyllning minst två injektionsnålar (ifall ett avbrott under injektionen) genom att pipettera 0,5 pl droppe injektion mix vid den stora öppningen av nålen.
- Installera nålarna i en förvaringsburk med vätska vid botten vid 4 ° C för att förhindra avdunstning av injektionsblandningen. Låt injektionsblandningen sakta färdas till spetsen av injektionsnålen under minst 1 timme för att minimera bildandet av bubblor.
- Butiks extra insprutningsblandningen vid -80 ° C under ytterligare högst tre användningsområden, varefter mRNA kvaliteten försämras (data ej visade).
- Cirka 2 tim innan injektionerna, gör en 2 pl injektion mix i RNase- och DNas-fritt vatten med slutliga koncentrationer av 1-1,8 mikrogram / l av mRNA, 15% glycerol, 1,25% fenolrött.
2. Insamling av biologiskt material, mikroinjektion och Embryo Culture
- Äggcellen och spermien samling
OBS: Se Theodosiouet al. 12 för en detaljerad protokoll för att framkalla lek och könsceller samling.- Shock hanar och honor i ASW vid 23 ° C under 24 h.
- En till två timmar före solnedgången, överföra de vuxna i enskilda koppar i ASW vid 19 ° C, eftersom de flesta vuxna kommer att leka 1-2 timmar efter solnedgången.
- Skölj 35 mm petriskålar i filtrerad ASW och låt dem torka upp och ner för att förhindra att ägg fastnar på botten av skålen.
- Vid lek, omedelbart samla spermier och ägg med en 1.000 l pipett.
- Håll spermier och ägg åtskilda från vuxna amphioxus eftersom kontakten är skadligt för könsceller hälsa (data visas ej).
- Dessutom undviker häpnadsväckande de vuxna, vilket leder till rörelser som avleder och därmed späda, både spermier och ägg. För att hålla spermier aktiv så länge som möjligt och för att optimera fertiliseringskvot, samla spermierna så koncentrerad som möjligt.
- Hållsperma på is i ett 1,5 ml rör.
- Överför oocyter i filtrerad ASW i förväg sköljas 35 mm petriskålar.
- Överför 100-500 oocyter med en tidigare drog 300-400 nm överförings pasteurpipett till en annan 35 mm petriskål för att utföra injektionerna.
- Befrukta återstoden av kopplingen som en kontroll för spermier och oocyt kvalitet eller för andra experiment.
- Oocyte injektion
- Installera injektionsnålen på mikromanipulator vid en 50 ° vinkel i förhållande till horisontalplanet.
OBS: Vinklar på mindre än 50 ° kommer att driva oocyter runt på skålen, medan vinkeln mer än 50 ° inte kommer att tillåta en lämplig övervakning av nålen position i förhållande till äggcellen. - Enligt en fluorescerande dissekera omfattning med 25x okular, överför 30 oocyter med 300-400 nm överförings pasteurpipett på en poly-lysin-belagda maträtt som innehåller filtrerat ASW.
- Deponera ägg längs en linje att bäraout injektioner i en ordnad sätt och för att skilja injiceras från icke-injicerade oocyter. Injicera litet antal (30 oocyter) för att minimera exponeringstiden för oocyter till poly-lysin, vilket tenderar att deformera utvecklingsembryon (data ej visade).
- Använd den mörka fältbelysningen att göra oocyter som genomskinliga som möjligt.
- Med den grova rörelse knoppen på mikromanipulator, sätta injektionsnålen nära en äggcell.
- Med fin pincett, skära upp nålen på den nivå där spetsen börjar att vara krökt. Genom att pulsera med injektorn, kontrollera att röda injektion mix faktiskt flödar ut ur nålen.
- Vid 200 gångers förstoring och med den fina rörelsen knoppen på mikromanipulator försiktigt flytta injektionsnålen inuti kärnan i äggcellen.
OBS: Om insatt alltför ytligt, kommer den injicerade lösningen inte blir kvar i äggcellen. Om insatt för långt, kommer ägget att förstöras. - Spruta med 1-3 pulser av 120 msek Duratjon och 1-10 psi tryck. Om nålen är bra nog, injicera med kontinuerligt flöde vid konstant tryck. Kontrollera att injektionen volymen motsvarar 5/1 till 1/3 av volymen av en enda oocyt.
- Efter injektionen, dra nålen ut snabbt för att undvika läckage av äggcellen.
- Kontrollera att den injicerade lösningen förblir inom äggcellen och efter några sekunder, sprider den injicerade lösningen hela äggcellen.
- Gå vidare till nästa äggcellen i linje.
- Håll några oinjicerade embryon av varje serie som negativ kontroll för att uppskatta bakgrundsfluorescens vid scanning för injicerade embryon.
- Installera injektionsnålen på mikromanipulator vid en 50 ° vinkel i förhållande till horisontalplanet.
- Befruktning, val av injicerade embryon och embryokultur
- Gödsla oocyter så snart en serie har injicerats. Som äggcellen kvalitet avtar med tiden, injicera och gödsla äggceller inom 1 timme efter leken 12.
- Beroende på spermiekoncentration, till 1-5 droppar sperma till äggceller ochSnurra skålen.
OBS: befruktning kuvertet ska bli tydliga på embryon efter ca 1 min. - Låt embryona att lösgöra från poly-lysin-belagda skålen, under injicering annan serie av oocyter.
- Överför embryon med 600 nm överförings pasteurpipett till ett agaros belagd petriskål. Ta bort embryon från poly-lysin-belagda maträtt så snart som möjligt, om det alls är möjligt före 2-cellstadiet.
OBS: Vid långvarig exponering för poly-lysin, embryona tenderar att bli tätt packade blastulae, tillplattad på den sida vidrör skålens botten. - Vid 2-cellen till 4-cellstadiet väljer med en fluorescerande dissekera omfattning med DSR filter de framgångsrikt-injicerade embryon, dvs, de med en normal morfologi som uppvisar en fenolrött-derived röd fluorescerande signal.
- Håll embryon i kultur i filtrerad ASW i agaros belagda petriskålar vid 19 ° C tills den önskade stadiet förin vivo-avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs ovan utgör grunden för mikroinjektion av B. lanceolatum oocyter och därmed för införsel till att utveckla B. lanceolatum embryon av mRNA som kodar fluorescerande proteiner för in vivo imaging. Även om tekniken är verkligen robust och tillförlitlig, förblir hastigheten av lyckade injektioner användning av detta protokoll variabel (tabell 1). Den mycket sannolika förklaringen till detta fängslande faktum är den extrema variabiliteten i oocyt kopplingar: olika ägg satser beter sig faktiskt mycket annorlunda, när det utsätts för insprutningstrycket. Vissa oocyter är ganska elastiskt och har en tendens att plana ut vid botten av skålen, medan andra är ganska stel och förblir runda vid injektion. Vidare kan vissa äggcell partier tenderar att blåsa upp sina chorion membran vid injektion, medan andra helt enkelt lyserar (data ej visade). Ingen uppenbar korrelation kunde fastställas mellan äggcellen beteende vid injektion och embryonalautveckling efter befruktningen. Det är därför svårt att förutse vilken kategori av äggceller som är bäst lämpad för mikroinjektion. Men efter befruktningen, kan embryon genomgår normal utveckling identifieras så tidigt som klyvningssteg: 2-cell till 4-cellstadiet embryon kan anses vara normalt när kontaktytan mellan blastomeres är liten, medan en packad klyvning steg embryo, där enskilda celler är svåra att urskilja, är definitivt onormal.
I våra händer, behöver ungefär hälften av oocyter inte överleva det trauma som orsakas av injektionen och omkring hälften av de embryon som överlever injektions uppvisar en specifik fluorescerande märkning. Därför uppskattar vi att med denna injektion protokoll, mellan 50 och 120 embryon kan framgångsrikt injiceras på en given lek dag ger mellan 15 och 60 märkta embryon.
Den röda fluorescens av fenolrött i 2-cell till 4-cellstadiet embryon markerar väldigt tillförlitligt embryon som harkorrekt injiceras, såsom 100% av embryon som valts på detta sätt därefter producera de fluorescerande proteiner som kodas av det injicerade mRNA. Dessutom finns det en mycket tydlig positiv korrelation mellan intensiteten av fenolrött fluorescens vid 2-cellen till 4-cellstadiet och tiden för början av den fluorescens som produceras av de proteiner som kodas av det injicerade mRNA. Denna korrelation medger således identifiering av dessa embryon som har fått den högsta kvantiteten av mRNA under insprutningsprocessen.
Om signalen från den fluorescerande protein som kodas av den injicerade mRNA inte identifieras efter val av Fenol Red-positiva embryon, rekommenderar vi att köra injektionsmixen på en RNAse fria gel för att kontrollera mRNA nedbrytning eller fånga (Figur 3) . I spår 1, är en intakt mRNA-bandet detekterades. Injektion av denna blandning ledde till en stark fluorescerande signal i embryot. Tvärtom, i spår 2 som motsvarar en annan experiment där Fenol Röd ersattes med Dextran färgämne i mixen (se diskussion för ytterligare information), verkar mRNA ha varit instängda av Dextran färgämnet och injektion av denna blandning ledde aldrig till fluorescerande signal i embryot.
Med hjälp av denna mikroinjektion teknik och våra konstruktioner (Tabell 2 och 3, Kompletterande File 1) (se diskussion), vi kan alltså reproducerbart producera homogen fluorescerande märkning hela embryot med mCherry eller eGFP i kärnan och med eGFP på membranet (Figur 4) . Den avbildning protokoll som används för att generera figur 4 kommer att beskrivas på annat håll (Faure et al., För närvarande under utarbetande). Beroende på mängden mRNA injiceras, fluorescerande proteinuttryck blir vanligtvis detekterbara mellan 16-cell (Figur 4A) och 64-cellsstadier och förblir detekterbar åtminstone fram till den sena neurula stadiet (data visas ej). Senare skeden har inte testats. Kärn signaltypiskt verkar tidigare än membransignal, potentiellt på grund av den inneboende diffusa naturen hos membranet i förhållande till den kompakta naturen av kärnan (data ej visade). Även om det inte har följts upp systematiskt, embryon injiceras med både en nukleär och en membran etikett verkar vara mindre hälsosamt än embryon injicerade enbart med en nukleär eGFP etikett. Fängslande, verkar denna effekt vara oberoende av den totala mängden mRNA injiceras som den totala mängden injicerat mRNA är densamma, oavsett om en eller två mRNA ingår till mixen (data visas ej).
Figur 1: Konstruera detaljer. Sketches of (A) membranet inriktade eGFP (eGFP: CAAX box), (B) Kärninriktade eGFP (H2B: eGFP) och (C) kärnkraftsinriktade mCherry (H2B: mCherry) konstruerar are visas.
Figur 2: Formen på en representativ injektionsnål. (A) Konan är ca 2 cm i längd och nålen kurvor vid spetsen. Skalstreck = 2 mm. (B) Förstoring av det inramade området i A. Positionen för klippning av nålen (pil) är i en kurva över nålen. Spetsen på nålen indikeras av pilspetsen. Skala bar = 500 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Interaktioner av mRNA och utvalda fluorescerande färgämnen (A) Resultat av migration av en blandning som innehåller mRNA och fenolrött i spår 1 ochav mRNA och Texas Red dextran (vid en slutlig koncentration av 3,3 mg / ml) i spår 2. (B) Resultat av migrering av en blandning innehållande mRNA och Oregon Grön dextran (vid en slutlig koncentration av 3,3 mg / ml) i spår 3, av mRNA och FITC-dextran (vid en slutlig koncentration av 3,3 mg / ml) i bana 4 och av mRNA och Rhodamine dextran (vid en slutlig koncentration av 3,3 mg / ml) i spår 5. Gel migrationstiden i A och B var olika. För tydlighetens skull, den svarta rektangeln i A masker för en reflektion och de streckade linjerna avgränsa de migrations körfält. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: 3D-rendering (Amira programvara) i amphioxus embryon injicerade med mRNA kodar för fluorescerande proteiner Bilder är.utvinns ur 3D tidsluckor som förvärvats på en optimerad Leica SP5 2-foton laser-scanning mikroskop (A) 16-cellsstadiet embryo som uttrycker kärn H2B:.. eGFP (B) gastrulastadium embryo som uttrycker kärn H2B: mCherry och membranet inriktade eGFP:. CAAX box (C) gastrulastadium embryo som uttrycker kärn H2B: mCherry och membranet inriktade eGFP: CAAX rutan. Den optiska delen visar interna celler med nukleär mCherry och membranassocierade EGFP signaler. Skalstreck = 50 | im.
| Experiment nummer | Injicerad konstrukt mRNA | Antal injicerade embryon | Antal märkta embryon |
| 1 | H2B: EGFP | 53 | 23 |
| 2 | H2B: EGFP | 50 | 31 |
| 3 | H2B: EGFP | 48 | 20 |
| 4 | H2B: EGFP | 54 | 24 |
| 5 | H2B: EGFP | 114 | 47 |
| 6 | H2B: EGFP | 80 | 46 |
| 7 | H2B: EGFP eller | 62 | 24 |
| H2B: mCherry + EGFP: CAAX boxen | |||
| 8 | H2B: EGFP | 87 | 60 |
| 9 | H2B: EGFP | 77 | 45 |
| 10 | eGFP: CAAX låda eller | 110 | 51 |
| H2B: mCherry + EGFP: CAAX boxen | |||
| 11 | H2B: mCherry + EGFP: CAAX boxen | 45 | 26 |
| 12 | H2B: mCherry + EGFP: CAAX låda | 52 | 16 |
| 13 | eGFP: CAAX låda eller | 74 | 35 |
| H2B: mCherry + EGFP: CAAX boxen | |||
| Totalt | 906 | 448 | |
| Framgång | 49% |
Tabell 1:. Injektions framgångsrika De injicerade konstruktioner, antalet injicerade embryon som överlevde injektionen och antalet märkta (eller framgångsrikt injiceras) embryon anges, så är den totala andelen lyckade injektioner.
| Konstrukt | Position i pCS2 + vektorn | Original sekvens | Muterade sekvensen |
| pCS2 + EGFP: CAAX boxen | 79..87 | GGA TCC ACC | ACC GT C A A C |
| pCS2 + H2B: EGFP | 82..90 | TCC GAC ACG | En CC G T C A AC |
| pCS2 + H2B: mCherry | 82..90 | TCC GAC ACG | En CC G T C A AC |
Tabell 2:. Preliminärt optimering av Kozak sekvenser Original och muterade Kozak sekvenser anges för varje konstruktion. De införda mutationer återvinna Kozak sekvensen av B. lanceolatum aktingen, som mycket nära liknar den hos den härledd teoretiskt föredragna Kozak-sekvens av amphioxus (A / CGA / CG / TTC A / GAC ATG TG / CT).
| pCS2 + EGFP: CAAX boxen | |||
| Original kodon | Muterade kodon | Position i pCS2 + vektorn | |
| (Användningsnivå) | (Användningsnivå) | ||
| GTA | GT G | 154..156 | EGFP-sekvens |
| (0,08) | (0,43) | ||
| AGA | AG G | 814..816 | Linker |
| (0,09) | (0,27) | ||
| pCS2 + H2B: EGFP | |||
| Original kodon | Muterade kodon | Position iden pCS2 + -vektor | |
| (Användningsnivå) | (Användningsnivå) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B sekvens |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | H2B sekvens | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 568..570 | EGFP-sekvens | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B sekvens |
| (0,06) | (0,51) | ||
| pCS2 + H2B: mCherry | |||
| Original kodon | Muterade kodon | Position i pCS2 + vector | |
| (Användningsnivå) | (Användningsnivå) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B sekvens |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | H2B sekvens | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 913..915 | mCherry sekvens | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B sekvens |
| (0,06) | (0,51) | ||
Tabell 3: Preliminär optimering av kodonanvändning. Original och muterade kodon anges för varje konstruktion. Även om detta inte har experimentellt testats, den införda Mutations är tänkta att optimera mRNA översättning i amphioxus.
Kompletterande File 1: Konstruera sekvenser Nukleotidsekvensema av (A) membranet inriktade eGFP. (EGFP: CAAX box), (B) Kärninriktade eGFP (H2B: eGFP) och (C) kärnkraftsinriktade mCherry (H2B : mCherry) konstruktioner ges i samband med pCS2 + vektor ryggraden. De huvudsakliga domäner kodas av var och en av konstruktionerna anges i färg: eGFP (grön), mCherry (röd), membranlokaliseringssignalen från humant HRAS (CAAX box) (cyan blå), zebrafisk histon 2B exon (H2B) (gul).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln presenterar vi, för första gången, en detaljerad och reproducerbar protokoll för injektion av B. lanceolatum oocyter, som efter B. floridae 13,14 och B. belcheri 15, är alltså den tredje amphioxus arter, för vilka en sådan teknik har beskrivits. Viktigt beskrev protokollet här innefattar även beskrivningen av vektorsystem lämpat för produktion av fluorescerande proteiner i B. lanceolatum från injicerade mRNA som producerats in vitro (beskrivet nedan). Tillsammans utgör dessa nya verktyg tillåter in vivo avbildning av den tidiga utvecklingen av amphioxus och analys av dynamiska cell beteenden som ligger bakom de tidigaste morfogenetiska händelser i embryot, såsom klyvning och gastrulation.
I allmänhet har mikroinjektionsteknik fördelen att låta leveransen, in i en målcell, en i förväg bestämd volym av en specifik förening. Med detta är sstöd, är en viktig begränsning av denna teknik det begränsade antalet celler som kan injiceras under ett givet experiment. Till exempel, beskrev protokollet här för B. lanceolatum tillåter injektion av 100 till 120 ägg per injektion session, varav ungefär hälften kommer att märkas (tabell 3). För B. floridae, siffrorna är mycket lika med 500 eller fler ägg som kan injiceras per dag, varav mer än 50% kommer att överleva injektionen 13,14. Medan protokollen för injicering B. lanceolatum och B. floridae ägg liknar varandra, B. belcheri teknik är något annorlunda: äggen placeras på poly-lysin-belagda täck och injektioner utförs under ett inverterat mikroskop med hjälp av en microinjector av ett annat märke. Detta tillvägagångssätt gör tydligen injektion av mellan 200 och 300 B. belcheri ägg per injektion session med en överlevnadsgrad, efter kläckning på neurula stadiet, of 89,39% till 95,83% 15. Med tanke på skillnaderna i protokollen är det svårt att veta om skillnaderna i andelen framgångsrika beror på arter relaterade eller protokollrelaterade skillnader. Man skulle behöva testa olika arter parallellt med de olika protokoll för att svara på denna fråga. Ändå, för att ytterligare öka antalet oocyter riktade för leverans av exogena föreningar, kommer andra protokoll måste utvecklas för amphioxus. Kandidattekniker innefattar elektroporering, bombardemang med mikropartiklar, lipofektion, och transduktion 4. Notera, har elektroporering redan införts som en standardteknik för införande av exogent material i befruktade ascidian manteldjurs ägg, en annan ryggradslös chordate modell som används för att studera utvecklingen av utvecklingsmekanismer 8.
För framgångsrik mikroinjektion och efterföljande in vivo imaging av fluorescerande proteiner, lämpligexpressionsvektorer är en obligatorisk förutsättning. För detta ändamål har tre plasmider utvecklats och experimentellt validerade (Figur 1, Kompletterande File 1): för membranmålsades eGFP genen fusionerad vid sin 3 'slut på det mänskliga HRAS CAAX box (som resulterar i en eGFP: CAAX box konstruktion ) 16 och, för nukleär målsökning, både EGFP och mCherry generna fuserades vid sina 5'-ändar till zebrafisk histon 2B (H2B) exon (resulterande, respektive, i en H2B: EGFP och en H2B: mCherry-konstruktion) 17. Var och en av dessa konstruktioner har klonats in i pCS2 + plasmid innehållande en SV40 sen polyadenyleringsställe och en SP6 promotor tillåter i mRNA-vitro capped syntes 18,19. Vidare, med målet att optimera translation av konstruktionerna i B. lanceolatum, har både Kozak-sekvenser och kodonerna anpassats med hjälp enda nukleotid mutagenes (tabellerna 2 och 3, Kompletterande Arkiv 1). Based på strategi från Nakagawa 20, en liten pool av B. lanceolatum gener analyserades för att identifiera en föredragen Kozak sekvens i denna art. Den närmaste kända naturligt förekommande sekvens till denna teoretiska föredragen sekvens är den för B. lanceolatum aktingenen. Kozak sekvenser av de tre konstruktionerna därmed ändras för att matcha detta aktin gensekvens. Vidare kodonanvändningen av B. lanceolatum analyserades med hjälp av kodonanvändningen databasen 21 och kodon i konstruktionerna med en låg användning sannolikhet i B. lanceolatum (<10%) ersattes, där så är möjligt, genom att motsvarande kodon med högre användning sannolikhet.
Resultaten av injektionerna visar att nivån av proteinuttryck från dessa vektorer är lämplig för in vivo-avbildning analyser. Med tanke på att uttrycket utsignalen från de modifierade vektorerna inte har jämförts med den hos omodifierade konstruktioner, kan vi inte conclude om effektiviteten av de ändringar som infördes i Kozak konsensus och kodningssekvensema. Det skulle säkert vara intressant att testa om dessa ändringar faktiskt har en inverkan på proteinuttrycksnivåer. Längs dessa linjer, en färsk analys baserad på microinjections till B. belcheri antyder att andra, icke modifierade vektorer kan också användas för syntes av mRNA för fluorescerande proteinproduktion i amphioxus 15.
Amphioxus innehåller endogena gröna fluorescerande proteiner 22. De embryon uppvisar därför låga nivåer av grönt samt röd fluorescens (våra opublicerade observationer). Emellertid är dessa endogena nivåer är försumbara i förhållande till fluorescensnivåer till följd av injektionen av våra mRNA-konstruktioner. Därför har endogena fluorescens av amphioxus embryon inte störa experimentella observationer med fluorescerande kikare eller flera laser scanning mikroskop. Dessutom, Injektionsexperiment visar att intensiteten i den exogena fluorescens som genereras av mRNA injektion beror på den faktiska mängden insprutat material, som är direkt korrelerad med den slutliga koncentrationen av mRNA som används i insprutningsmixen. B. lanceolatum embryon tenderar att tolerera en koncentration av upp till 1,8 mikrogram / l mRNA, även om, oberoende av den faktiska mRNA koncentrationen, vissa mRNA kombinationer verkar vara mindre tolereras av B. lanceolatum embryon än andra. Sålunda ger kombinationen av kärn mCherry och membran EGFP mRNA visade sig vara mer toxiska än injektion av kärn EGFP ensam.
Texas Red dextran har tidigare använts som ett spårämne för framgångsrika injektioner i amphioxus oocyter 13-15. Intriguingly en fluorescerande signal utvunnen från den injicerade mRNA aldrig erhållits efter injektion av lösningar innehållande Texas Red dextran och detta i båda amphioxus oocyter (n = 4 experiment) och zebrafish embryon (n = 3 experiment). När en injektionsblandning innehållande in vitro-transkriberat mRNA och Texas Red dextran laddas på en RNas-fri agarosgel (Figur 3, bana 2), är bandet motsvarande mRNA frånvarande. Däremot i vitro transkriberade mRNA är detekterbar på en RNas-fri agarosgel i närvaro av fenolrött (fig 3, spår 1). Med tanke på att det inte finns några belägg för mRNA nedbrytning på gelén, dessa resultat tyder på att Texas Red dextran tenderar att fälla mRNA. Vid användning i en injektionslösning, kanske Texas Red dextran därmed förhindra översättningen av den injicerade mRNA. Efter denna observation ades interaktioner av andra färgämnen (FITC dextran, Rhodamine dextran och Oregon Grön dextran) med mRNA testad, både på RNas-fri agarosgeler och genom injektion i B. lanceolatum eller zebrafisk (Figur 3). Analyserna visar att FITC dextran inte fälla mRNA på gel (Figur 3, lane 4) och leder till fluorescerande protein uttryck i zebrafisk (n = 1 experiment), men inte i embryon av B. lanceolatum (n = 1 experiment) (data ej visade). Rodamin dextran inte fälla mRNA på gel (Figur 3, bana 5) och leder till fluorescerande protein uttryck i zebrafisk embryon (n = 1 experiment) (data visas ej), men dess verksamhet kunde tyvärr inte testas i B. lanceolatum embryon. Slutligen som Oregon Grön dextranet migrerar på samma nivå som mRNA, mRNA Trapping kunde inte bedömas genom agarosgel (fig 3, spår 3),. Denna senare färgämne förhindrade fluorescerande proteinuttryck i amphioxus (n = 1 experiment), men inte zebrafiskembryon (n = 1 experiment) (data ej visade). Sammanfattningsvis antyder dessa data att vissa dextraner effektivt kan hämma translation av injicerat mRNA. Med tanke på att dos-responsförsök inte utfördes, dessa uppgifter är kvalitativa. Intriguingly tycks denna inhiberande effekt vara beroende avde djurarter (zebrafisk kontra amphioxus), vilket understryker behovet av ytterligare studier för att förstå mekanismerna bakom denna effekt. Dessutom kallar dessa resultat för förberedande analyser, om dextraner ska användas som färgspårämnen för injektioner.
Utvecklingen av mikroinjektionsteknik för en given modell öppnar dörren för genspecifika manipulationer. I amphioxus, till exempel, var den första beskrivningen av microinjections (i B. floridae) följt av den framgångsrika knockdown av en gen, hox1, använder morfolino oligonukleotid injektioner 23,24. Antalet B. lanceolatum embryon som framgångsrikt kan injiceras varje dag med hjälp av protokollet presenteras här är verkligen kompatibel med denna typ av studie. Dessutom med dessa metoder och de nya konstruktioner till hands, kan man nu även utforma och utföra överuttryck och knockdown studier genom injektion av mRNA av intresse (infödda eller dominant-negtiva former) eller använda andra strategier för att störa genuttryck (t.ex. microRNA- eller shRNA-baserade strategier). Hittills kan amphioxus injektioner endast utföras vid äggcellen stadiet, helt enkelt eftersom det är det enda stadium som effektivt kan immobiliseras. Efter injektion vid oocyt skede är molekylen av intresse ubiquitously uttryckt i embryot. Således, om genuttryck behöver ändras eller övervakas endast i en delmängd av celler, DNA-konstruktioner måste injiceras, eftersom dessa uttrycks mosaically i utvecklings amphioxus embryot 15,25-27. DNA-konstrukt injektioner kan också användas för att testa aktiviteten av regulatoriska regioner under amphioxus utveckling i transienta transgena analyser, med den tidigare nämnda nackdelen med mosaik uttryck 15,25-27.
Ytterst amphioxus mikroinjektion tekniken öppnar också dörren för stabil genmodifiering, inklusive riktade knock-out eller knock-in för specifika genetiska loci. Systems för stabil insättning av exogent DNA finns redan, exempelvis med fisken transposonen baserade Tol2 system som tycks fungera i både insekter och Amnioter ryggradsdjur 28. Vidare tillvägagångssätt bygger på modifierade zinkfinger nukleaser (ZFNs) eller transkriptions aktivator liknande effektor nukleaser (Talens) eller RNA-guidad genomet redigeringsverktyg (CRISPR / Cas-system) kan användas för att generera punktmutationer och knock-in ändringar i specifika regioner av genomet 29. Dessa ansträngningar kommer att kräva året runt uppfödning av amphioxus i fångenskap, som redan har inrättats för B. belcheri 11,30 och B. japonicum 30,31 och utvecklas för närvarande för A. lucayanum, B. floridae och amphioxus arter presenteras här, B. lanceolatum 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för det stöd som "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" för djurhållning. Detta arbete stöddes av medel från ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 och ANR-11-JSV2-002-01) till Michael Schubert, av Europeiska unionen FP6 bidrag "Embryomics" och av ANR bidraget "ANR- 10-BLAN-121.801 Dev-Process "till Jean-François Nicolas och Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho finansieras genom en FCT doktorandstipendium (SFRH / BD / 86878/2012).
Begäran om vektor beskrivs här kan ställas direkt till författarna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | Culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μm |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 μm |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P9155 | |
| H2O, DNase/RNase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | Sigma | C0549 | |
| 5:1 phenol pH 4.7:chloroform | Sigma | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200X magnification | Leica | MZ16F | 25X oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Fine forceps | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
