Isolasjon og Kvantitativ immunocytokjemisk Karakterisering av Primære myogenic celler og fibroblaster fra Menneskelig Skeletal Muscle

Summary

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Abstract

Reparasjon og regenerering av skjelettmuskulatur krever handling av satellitten celler, som er bosatt muskel stamceller. Disse kan bli isolert fra humant muskelbiopsiprøver ved enzymatisk fordøyelse og deres myogeniske egenskaper studert i kultur. Kvantitativt de to hoved adherente celletyper erholdt fra enzymatisk fordøyelse er: (i) de satellittceller (kalt myogeniske celler eller muskel forløper-celler), som er identifisert i utgangspunktet som CD56 ⁺ og senere som CD56 ⁺ / desmin ⁺ celler, og (ii) muskel- avledet fibroblaster, identifisert som CD56 ^– og TE-7 ^+. Fibroblaster sprer svært effektivt i kultur og i blandede cellepopulasjoner disse cellene kan overkjørt myogeniske celler til å dominere kulturen. Isolering og rensing av forskjellige celletyper fra human muskel er således en viktig faktor når metodiske forsøk på å undersøke den medfødte oppførsel av hver celletype i kultur. Her vi descrIbe et system for sortering basert på milde enzymatiske fordøyelse av celler ved hjelp av kollagenase og dispase etterfulgt av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) som gir både en høy renhet (> 95% myogeniske celler) og med godt utbytte (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8.87 x 10 ⁵ celler / g vev etter 7 dager in vitro) for eksperimenter i kultur. Denne fremgangsmåten er basert på å inkubere det blandede muskel-avledet cellepopulasjon med magnetiske mikrokuler konjugert til et antistoff mot CD56, og deretter passerer cellene selv om et magnetisk felt. CD56 ⁺ celler bundet til microbeads beholdes av feltet mens CD56 ^– celler passere uhindret gjennom kolonnen. Cellesuspensjoner fra hvilket som helst trinn av sorteringsprosessen kan bli belagt og kultivert. Etter et gitt inngrep, cellemorfologi, og ekspresjon og lokalisering av proteiner, inkludert nukleære transkripsjonsfaktorer kan kvantifiseres ved hjelp av immunfluorescens-merking med spesifikke antistoffer og et bilde processing og analysepakke.

Introduction

Reparasjon og regenerering av skjelettmuskulatur krever handling av satellitten celler ^1, de myogeniske stamceller ^2,3. In vivo disse cellene finnes i et reversibelt hviletilstand ligger mellom sarcolemma og basal lamina av hver myofiber, men bli aktivert for å spre seg, sikring og differensiere muskelvev er skadet, repareres og regenereres ^tre. Satellittceller kan isoleres fra unge og eldre menneskers muskelbiopsiprøver ved hjelp av enzymatisk fordøyelse ^fire og deres myogeniske egenskaper kan senere bli studert i primærkultur ^5. Effektiviteten av denne isoleringsprosessen i forhold til både utbytte og renhet av cellepopulasjon er avhengig av de metoder som brukes, og kan variere fra prøve til prøve. De to viktigste tilhenger celletyper hentet fra enzymatisk fordøyelse er satellittceller (nå betegnet myogeniske celler eller muskel forløper celler), identifiserte først som CD56 ⁺ / desmin celler, og muscle-avledede fibroblaster, identifisert som CD56 ^– og TE7 ^{+ -celler 5.} Fibroblaster har en rask proliferativ hastighet og ikke gjennomgår irreversibel vekst arrest og terminal differensiering på celle-celle kontakt som myogeniske celler; dermed i blandede bestander, kan fibroblaster kjørt myogeniske celler til å dominere kulturen.

Fibroblaster har ofte blitt sett på som en irritasjon for muskel biologer, men det er nå en økende interesse i fibroblaster som celler verdig studie i seg selv, særlig når de har vist seg å ha en samarbeidsvillig rolle med myogeniske celler under muskel reparasjon ⁶ . Isolering og rensing av forskjellige celletyper fra human muskel er således en viktig faktor når metodiske forsøk på å undersøke den medfødte oppførsel av begge celletyper i kultur. Fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) er en metode ved hvilken celler kan sorteres for videre studier og / eller telles oganalysert. FACS har vist seg å pålitelig berike human myogeniske celler, men utbyttet av celler for etterfølgende kultur har hittil ikke vært høy ^7. Gitt den begrensede replikasjonspotensialet av somatiske celler, slik som satellitt-celle-avledet myogeniske cellene og svært dårlig proliferasjon og differensiering forbundet med begynnende alderdom ^4, er mer skånsomme metoder påkrevd. Enkeltmuskelfiber kulturer tilby en annen, mindre aggressiv, betyr å skaffe murine satellittceller fortsatt bosatt i deres sublaminal nisje og etter deres aktivering i kultur ^8,9. Dette er imidlertid ofte ikke mulig fra human muskelbiopsimateriale (fordi fibrene kan sjelden oppnås fra senen til senen) betyr at denne teknikken ikke kan være tilgjengelig for mange forskningslaboratorier som er interessert i å studere humane muskel-avledede celler. Dessuten gir den eneste fiberteknikken bare svært begrenset antall celler.

Her beskriver vi et system for sortering basert på gentle enzymatisk fordøyelse av celler ved hjelp av kollagenase og dispase fulgt av to suksessive runder av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) som gir både en høy renhet (> 95% myogeniske celler) og utbytte (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ celler / g vev) for eksperimenter i kultur. CD56 er regnet som gullstandarden overflatemarkør for identifikasjon av menneskelige satellittceller in situ ¹⁰ og in vitro ¹¹ og gir den ideelle overflaten markør kandidat for perle vedlegg. I denne tilnærmingen CD56-antistoffer konjugert til jernoksyd og polysakkarid-inneholdende superparamagnetiske kuler er bundet til celler og føres gjennom en høy gradient magnetisk celleseparasjonskolonne plassert i et sterkt magnetfelt ^12,13. Separasjonskolonnene er fylt med en matrise av ferromagnetiske stålull eller jernkuler som tjener til å fokusere magnetiske feltlinjer langs deres overflate å generere sterke magnetiske feltgradienter (~ 4tesla) ¹⁴. I disse kolonnene enda litt magnetiske celler er tiltrukket og absorbert til overflaten deres ^14. Ubundet (CD56 ^– celler) passerer gjennom kolonnen, mens CD56 ⁺ celler merket med magnetiske mikroperler beholdes inntil fjerning av det magnetiske feltet ^12,15.

Cellesuspensjoner fra hvilket som helst trinn av sorteringsprosessen kan bli belagt på den ønskede densitet for videre eksperimentering. Etter en gitt intervensjon de cellulære bestanddeler kan identifiseres ved hjelp av immunocytokjemi, avbildes med wide-feltet eller konfokal fluorescens mikroskopi og analysert kvantitativt ved hjelp av en bildeanalyse tilnærming som tillater rask objektiv måling av alle merkede celler i et gitt bilde. I vårt laboratorium har vi benyttet denne doble immunomagnetisk sortering tilnærming etterfulgt av bildeanalyse ¹⁶ for å demonstrere at CD56 ^– humane fibroblaster lett transdifferentiate inn adipocytter, mens myogenic celles av satellitt opprinnelse er svært motstandsdyktig mot denne adipogenic konvertering ^5.

Protocol

MERK: For studier utført i vår lab alle fag ga sitt skriftlige, informerte samtykke til å delta og alle eksperimenter ble utført med UK National Health Service etiske komité godkjenning (London forskningsetiske komiteen; referanse: 10 / H0718 / 10), og i samsvar med Human Tissue Act og Helsinkideklarasjonen. 1. Innledende Fremstilling Før muskelbiopsien (15 min) Gjør menneskelig skjelettmuskelvekst medium. Til en gradert sterilt 50 ml konisk rør legger 2,5 ml supplement bl…

Representative Results

Purified myogeniske celler og fibroblaster kan dyrkes i adipogenic differensiering medium for tre dager etterfulgt av adipogenic ernæring medium fra hvor som helst mellom 7-30 dager for å vurdere deres potensial for adipogenese. Ved hjelp av de rensede cellepopulasjoner, Oil Red O farging i kombinasjon med immunfarging for adipogenic og myogeniske avstamning markører viste at bare fibroblast fraksjon var i stand til å adipogenic differensiering (figur 2). Den massive akkumulering av fett ved fibrobl…

Discussion

Vi har beskrevet en immunomagentic sortering fremgangsmåte for selektiv anrikning av humane muskel-forløpere avledet fra små prøver av muskelbiopsimateriale. Denne teknikken har vært uvurderlig i vårt laboratorium for å overvinne tapet av humane muskel-avledet kulturer til fibroblaster, men også for å forstå den unike virkemåten av distinkte populasjoner av muskel-avledede stamceller. Når rensede myogeniske celler kan bli etterforsket for endringer i protein og / eller genekspresjon, eller brukes til nedstr?…

Materials

Collagenase  D	Roche	11088866001
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 micron cell strainer	BD Biosciences	352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron)	Sartorius	17573ACK	Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads	Miltenyi Biotech	130-050-401	Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm Pre-separation filters	Miltenyi Biotech	130-041-407
Large Cell Collumns	Miltenyi Biotech	130-042-202	These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	This separator fits the large cell column but not the LS column.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Must be filter sterilized before use
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethyl phosphate	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering.
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (purchased from Pugh Computers)	ADPH16982*