The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
Reparationen og regenerering af skeletmuskulatur kræver handling af satellit celler, som er de hjemmehørende muskel stamceller. Disse kan isoleres fra human muskel biopsiprøver under anvendelse af enzymatisk fordøjelse og deres myogene egenskaber undersøgt i kultur. Kvantitativt, de to vigtigste vedhængende celletyper opnået fra enzymatisk fordøjelse er: (i) satellit celler (betegnet myogene celler eller muskel præcursorceller), først identificeret som CD56 + og senere som CD56 + / desmin + celler og (ii) muskel- afledte fibroblaster, identificeret som CD56 – og TE-7 +. Fibroblaster formere meget effektivt i kultur og i blandede cellepopulationer disse celler kan overskridelse myogene celler at dominere kulturen. Isoleringen og oprensning af forskellige celletyper fra human muskel er således et vigtigt metodiske overvejelser, når de forsøger at undersøge medfødte adfærd enten celletype i kultur. Her descr viIBE et system til sortering baseret på den blide enzymatisk fordøjelse af celler under anvendelse af collagenase og dispase efterfulgt af magnetisk cellesortering (MACS), hvilket giver både en høj renhed (> 95% myogene celler) og godt udbytte (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 celler / g væv efter 7 dage in vitro) til forsøg i kultur. Denne tilgang er baseret på inkubering af blandede muskel-afledte cellepopulation med magnetiske mikroperler perler konjugeret til et antistof mod CD56 og derefter passerer celler selvom et magnetfelt. CD56 + celler bundet til mikroperler tilbageholdes af feltet mens CD56 – celler passerer uhindret gennem kolonnen. Cellesuspensioner fra enhver fase af sorteringsprocessen kan udplades og dyrkes. Efter en given indsats, cellemorfologi og ekspression og lokalisering af proteiner, herunder nukleære transkriptionsfaktorer kan kvantificeres ved hjælp af immunfluorescerende mærkning med specifikke antistoffer og et billede processing og analyse pakke.
Reparationen og regenerering af skeletmuskulatur kræver handling af satellit celler 1, de myogene stamceller 2,3. In vivo findes disse celler i en reversibelt hvilende tilstand placeret mellem sarcolemma og basal lamina af hver myofibre, men bliver aktiveret til at formere sig, sikring og differentiere som muskelvæv er beskadiget, repareret og regenereret 3. Satellit-celler kan isoleres fra unge og ældre human muskel biopsiprøver under anvendelse af enzymatisk fordøjelse 4 og deres myogene egenskaber kan efterfølgende undersøgt i primær kultur 5. Effektiviteten af denne isolation proces med hensyn til både udbytte og renhed af cellepopulation afhænger af de anvendte metoder og kan variere fra prøve til prøve. De to vigtigste vedhængende celletyper opnået fra enzymatisk nedbrydning er satellit celler (nu betegnet myogene celler eller muskel præcursorceller), først identificeret som CD56 + / desmin celler og muSCLE-afledte fibroblaster, identificeret som CD56 – og TE7 + celler 5. Fibroblaster har en hurtig proliferativ sats og ikke undergår irreversibel vækststandsning og terminal differentiering ved celle-celle-kontakt som myogene celler; således i blandede populationer, kan fibroblaster overskredet myogene celler at dominere kulturen.
Fibroblaster er ofte blevet set som en irritation i muskelvæv biologer, men der er nu en stigende interesse for fibroblaster som celler værd at studere i deres egen ret, især fordi de har vist sig at have en kooperativ rolle med myogene celler under muskel reparation 6 . Isoleringen og oprensning af forskellige celletyper fra human muskel er således et vigtigt metodiske overvejelser, når de forsøger at undersøge medfødte adfærd begge celletyper i kultur. Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) er en metode, ved hvilken celler kan sorteres til yderligere undersøgelse og / eller tælles oganalyseret. FACS har vist sig at pålideligt berige humane myogene celler, men udbyttet af celler til efterfølgende kultur har hidtil ikke været høj 7. I betragtning af den begrænsede replikationspotentiale af somatiske celler, såsom satellit-celleafledt myogene celler og meget dårlig proliferation og differentiering er forbundet med senescens 4 er mere skånsom metoder påkrævet. Enkelte kulturer muskel fiber tilbyde en anden, mindre aggressive, midler til at opnå murine satellit celler stadig bosat i deres sublaminal niche, og efter deres aktivering i kultur 8,9. Dette er imidlertid ofte ikke muligt fra human muskel biopsi materiale (fordi fibre sjældent kan opnås fra senen til sene) betyder, at denne teknik ikke kan være tilgængelige for mange forskningslaboratorier interesserede i at studere human muskel-afledte celler. Desuden enkelt fiber teknik kun giver meget begrænsede celletal.
Her beskriver vi et system med sortering baseret på gentle enzymatisk fordøjelse af celler under anvendelse af collagenase og dispase efterfulgt af to på hinanden følgende runder af magnetisk cellesortering (MACS), hvilket giver både en høj renhed (> 95% myogene celler) og udbytte (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 celler / g væv) til forsøg i kultur. CD56 betragtes som den gyldne standard overflade markør for identifikation af humane satellit celler in situ 10 og in vitro 11 og giver den ideelle overflade markør kandidat til perle fastgørelse. Ved denne fremgangsmåde CD56 antistoffer konjugeret til jernoxid og polysaccharid indeholdende superparamagnetiske kugler bundet til celler og ledes gennem en høj gradient magnetisk celleseparering kolonne anbringes i et stærkt magnetisk felt 12,13. Separationskolonnerne er fyldt med en matrix af ferromagnetiske ståluld eller jern kugler, der tjener til at fokusere magnetiske feltlinier mod deres overflade genererer stærke magnetiske feltgradienter (~ 4tesla) 14. I disse kolonner endda lidt magnetiske celler er tiltrukket og adsorberet til overfladen 14. Ubundet (CD56 -) celler passerer gennem kolonnen mens CD56 + celler mærket med magnetiske mikroperler bevares indtil fjernelse fra magnetfeltet 12,15.
Cellesuspensioner fra enhver fase af sortering proces kan være belagt på den ønskede densitet for yderligere eksperimenter. Efter en given indsats de cellulære bestanddele kan identificeres ved hjælp af immuncytokemi, afbildes ved hjælp af bredt område eller konfokal fluorescensmikroskopi og analyseret kvantitativt ved hjælp af en billedanalyse, der tillader en hurtig objektiv måling af alle mærkede celler i et givet billede. I vores laboratorium har vi brugt denne dobbelte immunomagnetisk sortering indflyvning efterfulgt af billedanalyse 16 at vise, at CD56 – humane fibroblaster let transdifferentiate til adipocyter, mens myogenic celles af satellit oprindelse er meget modstandsdygtige over for denne adipogeniske konvertering 5.
Vi har beskrevet en immunomagentic sortering procedure for selektiv berigelse af menneskelige muskel-afledte forstadier fra små prøver af muskel biopsi materiale. Denne teknik har været uvurderlig i vores laboratorium for at overvinde tabet af human muskel-afledte kulturer fibroblaster, men også for at forstå den unikke opførsel af distinkte populationer af muskel- afledte progenitorceller. Når rensede myogene celler kan undersøges for ændringer i protein og / eller genekspression, eller anvendes til downstream…
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
Oil Red O | Sigma | O0625 | |
Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |