Summary

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Abstract

La reparación y la regeneración del músculo esquelético requiere la acción de las células satélite, que son las células madre de músculo residente. Estos se pueden aislar a partir de muestras de biopsia de músculo humano usando digestión enzimática y sus propiedades miogénicas estudiados en cultivo. Cuantitativamente, los dos principales tipos de células adherentes obtenidas a partir de la digestión enzimática son: (i) las células satélite (denominadas células miogénicas o células precursoras del músculo), identificado inicialmente como CD56 + y más tarde como desmina + / CD56 + células y (ii) músculo- fibroblastos derivados, identificadas como CD56 y TE-7 +. Los fibroblastos proliferan de manera muy eficiente en la cultura y en las poblaciones de células mixtas estas células pueden invadir células miogénicas de dominar la cultura. El aislamiento y purificación de diferentes tipos de células de músculo humano es por lo tanto una consideración metodológica importante cuando se trata de investigar el comportamiento innato de cualquiera de los tipos de células en cultivo. Aquí DescrIbe un sistema de clasificación basada en la digestión enzimática suave de las células utilizando colagenasa y dispasa seguido por clasificación magnética de células activadas (MACS), que da a la vez una alta pureza (> 95% de células miogénicas) y buen rendimiento (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 células / g de tejido después de 7 días in vitro) de experimentación en la cultura. Este enfoque se basa en la incubación de la población de células derivadas de músculo mezclado con microperlas perlas magnéticas conjugadas con un anticuerpo contra CD56 y luego pasar las células a través de un campo magnético. Células CD56 + unidos a microperlas son retenidos por el campo mientras que CD56 células pasan sin impedimentos a través de la columna. Las suspensiones celulares de cualquier etapa del proceso de clasificación pueden ser en placas y se cultivaron. A raíz de una intervención dada, la morfología celular, y la expresión y localización de proteínas, incluyendo factores de transcripción nuclear puede cuantificarse utilizando el etiquetado de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos y una imagen Processing y el paquete de análisis.

Introduction

La reparación y la regeneración del músculo esquelético requiere la acción de las células satélite 1, las células madre miogénicas 2,3. In vivo estas células existen en un estado quiescente reversible situado entre el sarcolema y la lámina basal de cada miofibrillas, pero se activan para proliferar, fusibles y diferenciarse como el tejido muscular están dañados, reparar y regenerar 3. Las células satélite se pueden aislar a partir de muestras de biopsia de músculo humano joven y de edad avanzada utilizando digestión enzimática 4 y sus propiedades miogénicos posteriormente se pueden estudiar en la cultura primaria 5. La eficiencia de este proceso de aislamiento con respecto a tanto el rendimiento y la pureza de la población de células depende de los métodos utilizados y puede variar de muestra a muestra. Los dos principales tipos de células adherentes obtenidas a partir de la digestión enzimática son las células satélite (células miogénicas ahora denominados o células precursoras de músculo), identificados inicialmente como células CD56 + / desmina, y mufibroblastos SCLE derivados, identificadas como CD56 y TE7 + 5 células. Los fibroblastos tienen una tasa de proliferación rápida y no se someten a la detención del crecimiento y la diferenciación terminal irreversible al contacto célula-célula, como las células miogénicas; por lo tanto en poblaciones mixtas, los fibroblastos pueden invadir células miogénicas a dominar la cultura.

Los fibroblastos a menudo se han visto como una irritación para los biólogos musculares, sin embargo, ahora existe un creciente interés en los fibroblastos como células dignos de estudio por derecho propio, en particular, ya que han demostrado tener un papel cooperativo con células miogénicas durante la reparación del músculo 6 . El aislamiento y purificación de diferentes tipos de células de músculo humano es por lo tanto una consideración metodológica importante cuando se trata de investigar el comportamiento innato de ambos tipos de células en cultivo. Activada por fluorescencia de células (FACS) es un método por el cual las células pueden ser ordenados para el estudio adicional y / o se contaron y seanalizada. FACS se ha demostrado para enriquecer de forma fiable células miogénicas humanos, pero el rendimiento de las células para el cultivo posterior hasta el momento no ha sido alto 7. Dado el potencial de replicación limitado de células somáticas, tales como células derivadas de células satélite miogénicas y muy pobre la proliferación y diferenciación asociados con la senescencia 4, se requieren métodos más suaves. Culturas individuales de fibras musculares ofrecen otra, menos agresivo, los medios de obtención de células satélite murinos todavía residente en su nicho sublaminal y después de su activación en la cultura 8,9. Sin embargo, esto a menudo no es posible a partir del material de biopsia de músculo humano (porque las fibras rara vez se pueden obtener de tendón a tendón) lo que significa que esta técnica puede no ser accesible a muchos laboratorios de investigación interesados ​​en el estudio de células derivadas de músculo humanos. Por otra parte, la técnica de la fibra individual sólo proporciona el número de células muy limitadas.

Aquí se describe un sistema de clasificación basada en el gendigestión enzimática TLE de células utilizando colagenasa y dispasa seguido por dos rondas sucesivas de clasificación magnética de células activadas (MACS), que da a la vez una alta pureza (> 95% de células miogénicas) y rendimiento (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 células / g de tejido) para experimentos en la cultura. CD56 se considera el marcador de superficie estándar de oro para la identificación de las células satélite humanos in situ e in vitro 10 11 y proporciona el candidato ideal marcador de superficie para la fijación del talón. En este enfoque anticuerpos CD56 conjugados con óxido de hierro y perlas superparamagnéticas que contiene polisacárido se une a las células y pasa a través de una columna de separación celular magnética de alto gradiente colocado en un fuerte campo magnético 12,13. Las columnas de separación se llenan con una matriz de lana de acero o de hierro esferas ferromagnéticas que sirven para enfocar líneas de campo magnético hacia su superficie generar fuertes gradientes de campo magnético (~ 4tesla) 14. En estas columnas incluso células ligeramente magnéticos son atraídos y absorbidos a su superficie 14. Sin consolidar (CD56 -) las células pasan a través de la columna mientras que las células CD56 + etiquetados con microperlas magnéticas se conservan hasta la retirada del campo magnético 12,15.

Las suspensiones celulares de cualquier etapa del proceso de clasificación se pueden colocaron en placas a la densidad deseada para la experimentación adicional. A raíz de una intervención dada los constituyentes celulares pueden identificarse utilizando inmunocitoquímica, utilizando imágenes de campo amplio o microscopía de fluorescencia confocal y analizados cuantitativamente usando un enfoque de análisis de imágenes que permite una rápida medición objetiva de todas las células marcadas en cualquier imagen dada. En nuestro laboratorio hemos utilizado este enfoque doble clasificación inmunomagnética seguido por análisis de imagen 16 para demostrar que CD56 fibroblastos humanos transdifferentiate fácilmente en los adipocitos, mientras que las células myogenics de origen satélite son altamente resistentes a esta conversión adipogenic 5.

Protocol

NOTA: Para los estudios realizados en nuestro laboratorio de todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para participar y todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética de Servicio Nacional de Salud del Reino Unido (Comité Ético de Investigación Londres; referencia: 10 / H0718 / 10) y de acuerdo con la Ley de Tejidos Humanos y la Declaración de Helsinki. 1. Preparación inicial antes de la biopsia muscular (15 min) Hace…

Representative Results

Células miogénicas y fibroblastos purificadas pueden ser cultivadas en un medio de diferenciación adipogénica durante tres días seguidos por medio de la nutrición adipogenic desde cualquier lugar entre 7-30 días para evaluar su potencial para la adipogénesis. Uso de las poblaciones de células purificadas, la tinción con Oil Red O en combinación con inmunotinción para marcadores de linaje adipogénicos y miogénicas mostró que sólo la fracción de fibroblastos era capaz de diferenciación adipogénica <stro…

Discussion

Hemos descrito un procedimiento de clasificación immunomagentic para el enriquecimiento selectivo de precursores derivadas de músculo humanos a partir de pequeñas muestras de material de biopsia muscular. Esta técnica ha sido muy valiosa en nuestro laboratorio para superar la pérdida de cultivos de músculo humanos derivados de los fibroblastos, sino también para la comprensión del comportamiento único de poblaciones distintas de células progenitoras derivadas de músculo. Células miogénicas Una vez purificad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.

Materials

Collagenase  D Roche  11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 micron cell strainer BD Biosciences 352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) Sigma, Dorset, UK C8919 
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human Miltenyi Biotech 130-050-601
40 μm Pre-separation filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Large Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns  Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMacs Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 This separator fits the large cell column but not the LS column. 
MidiMACS Miltenyi Biotech  130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Must be filter sterilized before use
Oil Red O Sigma O0625
Triethyl phosphate Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. 
ProLong Gold Antifade Reagent Molecular Probes, Invitrogen P36930 This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (purchased from Pugh Computers) ADPH16982* 

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Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. R. Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (95), e52049, doi:10.3791/52049 (2015).

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